中国人脑瘤中p16、p15基因缺失分析
作者：田新华 江澄川 高翔 许凯黎 周瑾 陈商群
单位：田新华(山西医科大学第二医院神经外科 太原 030001)；江澄川(上海华山医院神经外科)；高翔(上海华山医院神经外科)；许凯黎(上海市肿瘤研究所)；周瑾(上海市肿瘤研究所)；陈商群(上海华山医院神经外科)
关键词：脑肿瘤；p16基因；p15基因；基因缺失
中国人脑瘤中p16 〔摘要〕 目的 为了解p16、p15基因与中国人脑肿瘤遗传易感性的关系。方法 应用PCR、银染PCR-SSCP及免疫组化法对88例脑肿瘤及相应手术切除正常组织DNA标本p16、p15基因进行研究。结果 结果显示在不同病理分级脑胶质瘤中p16、p15基因缺失率分别为Ⅰ-Ⅱ级4%、0%，Ⅲ级32%、28%，Ⅳ级36%、27%，p16、p15基因缺失主要见于Ⅲ-Ⅳ级肿瘤中；脑转移瘤中也检出缺失该基因(2/3)，而原发性非胶质细胞瘤(脑膜瘤、垂体瘤、听神经瘤等)中未见p16、p15基因缺失，各类肿瘤标本PCR-SSCP分析均未见p16、p15基因点突变。结论 表明国人脑瘤中p16、p15基因异常以缺失为主，p16、p15基因缺失在脑胶质瘤中发生频率较高，促进肿瘤细胞由良性向恶性演进，而对良性非胶质细胞瘤的发病没有作用。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R739.41 〔文献标识码〕B
Analysis on p16、p15gene deletion in human brain tumor in Chinese
TIAN Xin-hua,JIANG Cheng-chuan,XU Kai-li,et al.
Department of Neurosurgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship between p16(MTS1),p15(MTS2) gene and the susceptibility of brain tumor.Methods 88 brain tumor and its neighbouring normal brain tissues at the resection edge were detected using PCR,silver stain PCR-SSCP and immunohistochemistry.Results The deletion rates of p16,p15 gene were 4% and 0% in gliomas of grade Ⅰ-Ⅱ,32% and 28% of grade Ⅲ,36% and 27% of grade Ⅳ respectively.Deletion of p16,p15 gene also occurred in brain metastatic tumors(2/3).But it did not possibly demonstrate deletion of p16,p15 gene in 17 primary non-astrocytic tumors.Mutation of p16,p15 gene was not been found in a variety of brain tumors by PCR-SSCP.Conclusions These data suggest that deletion of p16,p15 gene may be an efficient and commonly seen mechanism of simultaneous inactivation for gliomas,which is associated with the malignant progression of gliomas.On top of this,p16 and p15 gene dose not play a role in the pathogenesis of cerebral non-astrocytic tumors.
, 百拇医药
〔Key words〕 brain tumors;p16 gene;p15 gene;gene deletion
多肿瘤抑制基因(Multiple tumor suppressor,MTS)MTS1/p16、MTS2/p15是迄今发现的最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成份，二者均定位于染色体9p21不到40Kb的范围内[1]。p16、p15基因对细胞的生长起负性调控作用，其基因的缺失、突变与恶性肿瘤发生发展的关系是目前肿瘤学研究的热点之一[2]。在既往研究基础上[3]，通过对肿瘤抑制基因p16、p15在国人脑瘤组织中突变频率的检测，了解该基因异常与我国脑肿瘤遗传易感性的关系，并寻找新的筛查脑肿瘤的分子生物学标志。
材料与方法
标本来源和DNA抽提：88例脑肿瘤标本均来自上海华山医院，新鲜肿瘤组织43例并取相应手术切端正常组织，近期石蜡包埋标本45例。其中脑胶质瘤68例，脑膜瘤5例，听神经瘤5例，垂体瘤3例，髓母细胞瘤2例，血管母细胞瘤2例，脑转移瘤3例(肺癌转移2例、乳腺癌转移1例)。依据WHO 1993年中枢神经系统肿瘤分类标准作出脑胶质瘤病理分级，包括Ⅰ-Ⅱ级(星形细胞瘤)21例，Ⅲ级(间变型星形细胞瘤)25例，Ⅳ级(胶母细胞瘤)22例。每一标本分二份，一份置液氮中，用于p16、p15基因突变检测，另一份石蜡包埋用于p16蛋白免疫组化检测。按常规方法进行[4]DNA抽提、纯化和定量。
, 百拇医药
PCR扩增及条件：PCR反应在PE 9600热循环仪中进行，分别扩增p16基因第1、2外显子和p15基因第2外显子，引物合成由中科院细胞所完成，各标本并行CDK4的PCR扩增作为内参照。p16 CDK4基因的引物序列及扩增条件同前述[3]。p15基因第2外显子引物序列为(S)CCCGGCCGGCATCTCCCATA，(AS)CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT。
银染PCR-SSCP分析：各取10μl PCR产物，加入8μl变性缓冲液(80%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯晴蓝)，96℃变性10min后冰上骤冷，立即上样行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳(30∶0.8)，10mA恒电流电泳3小时，至溴酚蓝接近凝胶底部。取下凝胶，置10%醋酸固定液中30分，再以去离子水漂洗3次(2min/次)，加入2%硝酸银染液染色20分后，去离子水洗胶20秒，凝胶置显影液(3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫代硫酸钠)中显色5～10分，以10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。
, 百拇医药
免疫组化染色：采用ABC免疫组化染色法，按试剂盒说明书进行。P16多克隆抗体购自Pharmingen Inc，生物素标记的羊抗兔IgG、ABC试剂盒均为Vector Lab Inc产品。用正常兔血清作替代对照，PBS作空白对照，正常淋巴细胞作为阳性对照，以细胞核或浆染成棕褐色为阳性。
应用卡方检验及精确概率法分析组间差异。
结果
1.脑胶质瘤中p16、p15基因改变：本组68例脑胶质瘤标本p16、p15基因与内对照CDK4基因同步PCR扩增显示，p16、p15基因扩增阳性者分别为51例、55例，同一样本的内对照CDK4基因扩增均获成功。扩增阳性标本再经银染PCR-SSCP分析，在p16外显子1、2及p15外显子2中，均未见明显异常移动电泳带(若DNA片段中残基发生突变，将会引起单链DNA二级结构改变，SSCP凝胶上出现异常移动电泳带，即SSCP阳性)。在相应手术切端正常组织未见有基因缺失和突变。
, 百拇医药
2.p16、p15基因缺失、p16蛋白丢失与脑胶质瘤病理分级的关系：见表1，p16、p15基因和p16蛋白的丢失主要见于恶性程度较高Ⅲ-Ⅳ级脑胶质瘤病例中。p16蛋白表达阳性部位见于瘤细胞浆和胞核内，正常对照细胞核、浆均为阳性，替代对照及空白对照中胞核、胞浆均为阴性。
表1 p16、p15基因缺失、p16蛋白丢失与脑胶质瘤病理分级的关系
病理分级
例数
P16基因缺失
P15基因缺失
P16蛋白丢失
Ⅰ-Ⅱ
21
, 百拇医药
1(4%)
0
6(28%)
Ⅲ
25
8(32%)
7(28%)
12(48%)
Ⅳ
22
8(36%)
6(27%)
16(72%)
, 百拇医药
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P值为Ⅰ-Ⅱ组与Ⅲ-Ⅳ组间比较
3.非胶质细胞脑瘤中p16、p15基因改变及p16蛋白表达：3例脑转移瘤中2例存在p16基因缺失，1例为肺癌脑转移，另1例为乳腺癌脑转移，该2例标本免疫组化检测均发现p16蛋白丢失。其余17例非胶质细胞性脑瘤中无一例检测到p16、p15基因的纯合性缺失，免疫组化检测p16蛋白表达均为阳性。所有相应手术切端正常组织未见基因缺失和突变。
讨论
肿瘤的发生与多种基因异常有关，研究这些基因与人群肿瘤易感性关系，对有效防治恶性肿瘤有重要意义。近年来新的肿瘤易感基因不断被分离鉴定，在肿瘤易感人群中检测分析新得到的基因、研究其异常与肿瘤发生发展的关系，将有利于寻找鉴定主基因，并可能为肿瘤的早期诊断和治疗提供分子标志。新发现的多肿瘤抑制基因MTS1编码16Kb的蛋白p16，MTS2编码14.7Kb的蛋白p15，p15比p16少20个氨基酸残基，二基因编码区核苷酸具有高度的同源性(93%)[1]，推测两蛋白功能相近。p16、p15基因的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，p16、p15蛋白可特异性结合并抑制周期素依赖性蛋白激酶4(CDK4)的活性，使之不能解除Rb基因对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期而抑制细胞增殖。已发现在多种恶性肿瘤细胞系及一些包括脑胶质瘤在内的实体瘤组织中存在着p16基因的异常[1，5，6]。
, http://www.100md.com
基因的缺失和突变是导致抑癌基因功能失活的主要原因。在脑胶质瘤细胞系检测中，已发现p16基因发生纯合性缺失的比例达82%[1]，然而，在原发性脑胶质瘤组织中该基因缺失的检出率却不高[7]，本研究68例脑胶质瘤中，p16、p15基因缺失主要出现于Ⅲ-Ⅳ级肿瘤(P<0.05，其缺失率分别为34%、28%)，这一趋势在p16蛋白丢失检测时更加明显(59%，P<0.05)；全部标本银染PCR-SSCP分析未发现基因的点突变或小的缺失。这些实验结果提示脑胶质瘤中p16、p15基因改变的主要形式是基因的缺失，突变是极少发生的。p16、p15基因结构的异常与脑胶质瘤瘤变相关，该基因的失活与脑胶质瘤的病理分级及其临床进展更具密切关系，其促进了肿瘤由低病理分级向高病理分级演进的过程。同时，与国外类似研究多数的报道相比，上述的肿瘤分子生物学改变不具种族特异性[8]。Jen和Tenan认为p16、p15基因是两个具有独立功能的基因，可单独或相加作用于肿瘤演进过程中[6、9]，文献报道p16基因缺失的肿瘤中50%～80%可并有p15基因的缺失，我们的实验结果支持这一结论，49%(23/47)恶性脑胶质瘤存在单纯p16或p15基因的缺失，p16基因缺失的标本中p15基因缺失的发生率为41%(7/16)。
, 百拇医药
与脑胶质瘤的情况相反，本实验对17例原发性非胶质细胞脑瘤的检测无一例发生p16、p15基因的纯合性缺失和突变，p16蛋白的表达均为阳性，表明在脑膜瘤、听神经瘤、垂体瘤等非胶质细胞原发脑瘤的发生中，p16、p15基因可能没有什么作用。然而在3例转移性脑瘤中却检出了2例存在p16基因的纯合性缺失并存在蛋白的丢失，分别为肺癌脑转移和乳腺癌脑转移。我们知道在同一宿主体内发生的转移，由于其极端相似的细胞生长条件，转移瘤的细胞代表了原发肿瘤的主要细胞克隆，基因改变来源于原发肿瘤的基因异常[6],Nobori对原发肺癌p16基因缺失率检测为36%[10]，而乳腺癌细胞株的p16基因缺失率达60%，本实验对脑转移瘤的检测结果间接提示了p16基因与肺癌、乳腺癌的密切关系，更重要的启示则是p16基因缺失这一肿瘤进展的晚期事件可能与癌的转移有关，已有学者注意到这一问题，因本组例数较少，且对照研究不够，有关这一方面的深入认识尚需进一步探讨。由于p16、p15基因的缺失和突变在许多肿瘤细胞系中的检出率比原发癌组织高(16)，故曾被怀疑是体外建株选择的结果，现在的研究证实p16基因缺失是多类原发恶性肿瘤的频发事件[2]。癌组织中检出率低的原因(1)肿瘤内间质细胞或炎症细胞的污染；(2)在引物未包括的启动子区和内含子区突变的漏检；(3)单链SSCP技术本身存在的假阴性问题；(4)标本数目有限。可以推测，应用定量PCR、DNA直接测序等方法学上的改进，将会提高原发肿瘤组织p16、p15基因异常的检出率。
, http://www.100md.com
基金项目：国家教委博士点基金资助项目(96026515)
作者简介：田新华(1965-)，男，山西太原人，博士，硕士生导师，副教授，从事神经外科专业。
参考文献
1，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994；264:436-438
2，Kyritisis AP,Zhang BH,Zhang W,et al.Mutations of p16 gene in gliomas.Oncogene,1996；12:623-627
3，田新华，江澄川，许凯黎，等.脑胶质瘤中MTS1/p16基因的缺失和突变.上海医科大学学报，1997；24(S)：14-16
, 百拇医药
4，Innis MA,Gelfand DH,Snisky JJ.PCR protocal:a guide to methods and applications.San Diego:Acad press,1990；146-160
5，Nobori T, Kmuira, Wu DJ, et al. Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer.Nature,1994；386:753-758
6，Jen J,Fouter DS,Swand RE,et al.Deletion of p16 and p15 gene in brain tumors.Cancer Res,1994；54:6353-6358
7，Nishikawa R,Furnair F,Lin H,et al.Homozygous deletions of MTS1/p16 gene in human brain tumors.Cancer Res,1995；55:1941-1943
, http://www.100md.com
8，Walrer DG,Duan W,Popvic EA,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene I in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995；55:20-23
9，Tenan I, Benedeti S, Finochiaro G, et al.Deletion and transfection analysis of the p15/MTS2 gene in malignant gliomas.Biochem Biophysical Research Communication,1995;217:195-202
10，Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Mutation of p16 ang p15 in human lung cancer.Nature,1995；368:753-756
收稿日期：1999-3-21, 百拇医药
单位：田新华(山西医科大学第二医院神经外科 太原 030001)；江澄川(上海华山医院神经外科)；高翔(上海华山医院神经外科)；许凯黎(上海市肿瘤研究所)；周瑾(上海市肿瘤研究所)；陈商群(上海华山医院神经外科)
关键词：脑肿瘤；p16基因；p15基因；基因缺失
中国人脑瘤中p16 〔摘要〕 目的 为了解p16、p15基因与中国人脑肿瘤遗传易感性的关系。方法 应用PCR、银染PCR-SSCP及免疫组化法对88例脑肿瘤及相应手术切除正常组织DNA标本p16、p15基因进行研究。结果 结果显示在不同病理分级脑胶质瘤中p16、p15基因缺失率分别为Ⅰ-Ⅱ级4%、0%，Ⅲ级32%、28%，Ⅳ级36%、27%，p16、p15基因缺失主要见于Ⅲ-Ⅳ级肿瘤中；脑转移瘤中也检出缺失该基因(2/3)，而原发性非胶质细胞瘤(脑膜瘤、垂体瘤、听神经瘤等)中未见p16、p15基因缺失，各类肿瘤标本PCR-SSCP分析均未见p16、p15基因点突变。结论 表明国人脑瘤中p16、p15基因异常以缺失为主，p16、p15基因缺失在脑胶质瘤中发生频率较高，促进肿瘤细胞由良性向恶性演进，而对良性非胶质细胞瘤的发病没有作用。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R739.41 〔文献标识码〕B
Analysis on p16、p15gene deletion in human brain tumor in Chinese
TIAN Xin-hua,JIANG Cheng-chuan,XU Kai-li,et al.
Department of Neurosurgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship between p16(MTS1),p15(MTS2) gene and the susceptibility of brain tumor.Methods 88 brain tumor and its neighbouring normal brain tissues at the resection edge were detected using PCR,silver stain PCR-SSCP and immunohistochemistry.Results The deletion rates of p16,p15 gene were 4% and 0% in gliomas of grade Ⅰ-Ⅱ,32% and 28% of grade Ⅲ,36% and 27% of grade Ⅳ respectively.Deletion of p16,p15 gene also occurred in brain metastatic tumors(2/3).But it did not possibly demonstrate deletion of p16,p15 gene in 17 primary non-astrocytic tumors.Mutation of p16,p15 gene was not been found in a variety of brain tumors by PCR-SSCP.Conclusions These data suggest that deletion of p16,p15 gene may be an efficient and commonly seen mechanism of simultaneous inactivation for gliomas,which is associated with the malignant progression of gliomas.On top of this,p16 and p15 gene dose not play a role in the pathogenesis of cerebral non-astrocytic tumors.
, 百拇医药
〔Key words〕 brain tumors;p16 gene;p15 gene;gene deletion
多肿瘤抑制基因(Multiple tumor suppressor,MTS)MTS1/p16、MTS2/p15是迄今发现的最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成份，二者均定位于染色体9p21不到40Kb的范围内[1]。p16、p15基因对细胞的生长起负性调控作用，其基因的缺失、突变与恶性肿瘤发生发展的关系是目前肿瘤学研究的热点之一[2]。在既往研究基础上[3]，通过对肿瘤抑制基因p16、p15在国人脑瘤组织中突变频率的检测，了解该基因异常与我国脑肿瘤遗传易感性的关系，并寻找新的筛查脑肿瘤的分子生物学标志。
材料与方法
标本来源和DNA抽提：88例脑肿瘤标本均来自上海华山医院，新鲜肿瘤组织43例并取相应手术切端正常组织，近期石蜡包埋标本45例。其中脑胶质瘤68例，脑膜瘤5例，听神经瘤5例，垂体瘤3例，髓母细胞瘤2例，血管母细胞瘤2例，脑转移瘤3例(肺癌转移2例、乳腺癌转移1例)。依据WHO 1993年中枢神经系统肿瘤分类标准作出脑胶质瘤病理分级，包括Ⅰ-Ⅱ级(星形细胞瘤)21例，Ⅲ级(间变型星形细胞瘤)25例，Ⅳ级(胶母细胞瘤)22例。每一标本分二份，一份置液氮中，用于p16、p15基因突变检测，另一份石蜡包埋用于p16蛋白免疫组化检测。按常规方法进行[4]DNA抽提、纯化和定量。
, 百拇医药
PCR扩增及条件：PCR反应在PE 9600热循环仪中进行，分别扩增p16基因第1、2外显子和p15基因第2外显子，引物合成由中科院细胞所完成，各标本并行CDK4的PCR扩增作为内参照。p16 CDK4基因的引物序列及扩增条件同前述[3]。p15基因第2外显子引物序列为(S)CCCGGCCGGCATCTCCCATA，(AS)CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT。
银染PCR-SSCP分析：各取10μl PCR产物，加入8μl变性缓冲液(80%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯晴蓝)，96℃变性10min后冰上骤冷，立即上样行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳(30∶0.8)，10mA恒电流电泳3小时，至溴酚蓝接近凝胶底部。取下凝胶，置10%醋酸固定液中30分，再以去离子水漂洗3次(2min/次)，加入2%硝酸银染液染色20分后，去离子水洗胶20秒，凝胶置显影液(3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫代硫酸钠)中显色5～10分，以10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。
, 百拇医药
免疫组化染色：采用ABC免疫组化染色法，按试剂盒说明书进行。P16多克隆抗体购自Pharmingen Inc，生物素标记的羊抗兔IgG、ABC试剂盒均为Vector Lab Inc产品。用正常兔血清作替代对照，PBS作空白对照，正常淋巴细胞作为阳性对照，以细胞核或浆染成棕褐色为阳性。
应用卡方检验及精确概率法分析组间差异。
结果
1.脑胶质瘤中p16、p15基因改变：本组68例脑胶质瘤标本p16、p15基因与内对照CDK4基因同步PCR扩增显示，p16、p15基因扩增阳性者分别为51例、55例，同一样本的内对照CDK4基因扩增均获成功。扩增阳性标本再经银染PCR-SSCP分析，在p16外显子1、2及p15外显子2中，均未见明显异常移动电泳带(若DNA片段中残基发生突变，将会引起单链DNA二级结构改变，SSCP凝胶上出现异常移动电泳带，即SSCP阳性)。在相应手术切端正常组织未见有基因缺失和突变。
, 百拇医药
2.p16、p15基因缺失、p16蛋白丢失与脑胶质瘤病理分级的关系：见表1，p16、p15基因和p16蛋白的丢失主要见于恶性程度较高Ⅲ-Ⅳ级脑胶质瘤病例中。p16蛋白表达阳性部位见于瘤细胞浆和胞核内，正常对照细胞核、浆均为阳性，替代对照及空白对照中胞核、胞浆均为阴性。
表1 p16、p15基因缺失、p16蛋白丢失与脑胶质瘤病理分级的关系
病理分级
例数
P16基因缺失
P15基因缺失
P16蛋白丢失
Ⅰ-Ⅱ
21
, 百拇医药
1(4%)
0
6(28%)
Ⅲ
25
8(32%)
7(28%)
12(48%)
Ⅳ
22
8(36%)
6(27%)
16(72%)
, 百拇医药
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P值为Ⅰ-Ⅱ组与Ⅲ-Ⅳ组间比较
3.非胶质细胞脑瘤中p16、p15基因改变及p16蛋白表达：3例脑转移瘤中2例存在p16基因缺失，1例为肺癌脑转移，另1例为乳腺癌脑转移，该2例标本免疫组化检测均发现p16蛋白丢失。其余17例非胶质细胞性脑瘤中无一例检测到p16、p15基因的纯合性缺失，免疫组化检测p16蛋白表达均为阳性。所有相应手术切端正常组织未见基因缺失和突变。
讨论
肿瘤的发生与多种基因异常有关，研究这些基因与人群肿瘤易感性关系，对有效防治恶性肿瘤有重要意义。近年来新的肿瘤易感基因不断被分离鉴定，在肿瘤易感人群中检测分析新得到的基因、研究其异常与肿瘤发生发展的关系，将有利于寻找鉴定主基因，并可能为肿瘤的早期诊断和治疗提供分子标志。新发现的多肿瘤抑制基因MTS1编码16Kb的蛋白p16，MTS2编码14.7Kb的蛋白p15，p15比p16少20个氨基酸残基，二基因编码区核苷酸具有高度的同源性(93%)[1]，推测两蛋白功能相近。p16、p15基因的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，p16、p15蛋白可特异性结合并抑制周期素依赖性蛋白激酶4(CDK4)的活性，使之不能解除Rb基因对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期而抑制细胞增殖。已发现在多种恶性肿瘤细胞系及一些包括脑胶质瘤在内的实体瘤组织中存在着p16基因的异常[1，5，6]。
, http://www.100md.com
基因的缺失和突变是导致抑癌基因功能失活的主要原因。在脑胶质瘤细胞系检测中，已发现p16基因发生纯合性缺失的比例达82%[1]，然而，在原发性脑胶质瘤组织中该基因缺失的检出率却不高[7]，本研究68例脑胶质瘤中，p16、p15基因缺失主要出现于Ⅲ-Ⅳ级肿瘤(P<0.05，其缺失率分别为34%、28%)，这一趋势在p16蛋白丢失检测时更加明显(59%，P<0.05)；全部标本银染PCR-SSCP分析未发现基因的点突变或小的缺失。这些实验结果提示脑胶质瘤中p16、p15基因改变的主要形式是基因的缺失，突变是极少发生的。p16、p15基因结构的异常与脑胶质瘤瘤变相关，该基因的失活与脑胶质瘤的病理分级及其临床进展更具密切关系，其促进了肿瘤由低病理分级向高病理分级演进的过程。同时，与国外类似研究多数的报道相比，上述的肿瘤分子生物学改变不具种族特异性[8]。Jen和Tenan认为p16、p15基因是两个具有独立功能的基因，可单独或相加作用于肿瘤演进过程中[6、9]，文献报道p16基因缺失的肿瘤中50%～80%可并有p15基因的缺失，我们的实验结果支持这一结论，49%(23/47)恶性脑胶质瘤存在单纯p16或p15基因的缺失，p16基因缺失的标本中p15基因缺失的发生率为41%(7/16)。
, 百拇医药
与脑胶质瘤的情况相反，本实验对17例原发性非胶质细胞脑瘤的检测无一例发生p16、p15基因的纯合性缺失和突变，p16蛋白的表达均为阳性，表明在脑膜瘤、听神经瘤、垂体瘤等非胶质细胞原发脑瘤的发生中，p16、p15基因可能没有什么作用。然而在3例转移性脑瘤中却检出了2例存在p16基因的纯合性缺失并存在蛋白的丢失，分别为肺癌脑转移和乳腺癌脑转移。我们知道在同一宿主体内发生的转移，由于其极端相似的细胞生长条件，转移瘤的细胞代表了原发肿瘤的主要细胞克隆，基因改变来源于原发肿瘤的基因异常[6],Nobori对原发肺癌p16基因缺失率检测为36%[10]，而乳腺癌细胞株的p16基因缺失率达60%，本实验对脑转移瘤的检测结果间接提示了p16基因与肺癌、乳腺癌的密切关系，更重要的启示则是p16基因缺失这一肿瘤进展的晚期事件可能与癌的转移有关，已有学者注意到这一问题，因本组例数较少，且对照研究不够，有关这一方面的深入认识尚需进一步探讨。由于p16、p15基因的缺失和突变在许多肿瘤细胞系中的检出率比原发癌组织高(16)，故曾被怀疑是体外建株选择的结果，现在的研究证实p16基因缺失是多类原发恶性肿瘤的频发事件[2]。癌组织中检出率低的原因(1)肿瘤内间质细胞或炎症细胞的污染；(2)在引物未包括的启动子区和内含子区突变的漏检；(3)单链SSCP技术本身存在的假阴性问题；(4)标本数目有限。可以推测，应用定量PCR、DNA直接测序等方法学上的改进，将会提高原发肿瘤组织p16、p15基因异常的检出率。
, http://www.100md.com
基金项目：国家教委博士点基金资助项目(96026515)
作者简介：田新华(1965-)，男，山西太原人，博士，硕士生导师，副教授，从事神经外科专业。
参考文献
1，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994；264:436-438
2，Kyritisis AP,Zhang BH,Zhang W,et al.Mutations of p16 gene in gliomas.Oncogene,1996；12:623-627
3，田新华，江澄川，许凯黎，等.脑胶质瘤中MTS1/p16基因的缺失和突变.上海医科大学学报，1997；24(S)：14-16
, 百拇医药
4，Innis MA,Gelfand DH,Snisky JJ.PCR protocal:a guide to methods and applications.San Diego:Acad press,1990；146-160
5，Nobori T, Kmuira, Wu DJ, et al. Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer.Nature,1994；386:753-758
6，Jen J,Fouter DS,Swand RE,et al.Deletion of p16 and p15 gene in brain tumors.Cancer Res,1994；54:6353-6358
7，Nishikawa R,Furnair F,Lin H,et al.Homozygous deletions of MTS1/p16 gene in human brain tumors.Cancer Res,1995；55:1941-1943
, http://www.100md.com
8，Walrer DG,Duan W,Popvic EA,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene I in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995；55:20-23
9，Tenan I, Benedeti S, Finochiaro G, et al.Deletion and transfection analysis of the p15/MTS2 gene in malignant gliomas.Biochem Biophysical Research Communication,1995;217:195-202
10，Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Mutation of p16 ang p15 in human lung cancer.Nature,1995；368:753-756
收稿日期：1999-3-21, 百拇医药