低频电磁场对人胚腱细胞生长分泌的影响及机制探讨
作者：康庆林 蒋祖言 田万成
单位：264002 中国人民解放军第107医院骨科(康庆林、田万成)；重庆大坪医院(蒋祖言)
关键词：分裂球/分类；腱/生长和发育；电磁场；胶原/分泌；脱氧核糖核酸/分泌
中华物理医学杂志980104.htm 摘 要 目的 阐明低频电磁场促进人胚腱细胞增殖及分泌胶原的机制。方法 将传代培
养的人胚腱细胞分为对照组、刺激1日组、刺激3日组及刺激5日组,在电磁场刺激的不同时相点,分别测定细胞DNA含量、cAMP水平及胶原分泌量。结果 在低频电磁场作用早期(1～3日),细
胞cAMP水平与DNA合成均呈明显升高(P<0.05),细胞内信使物质合成及细胞增殖加快,但胶原分
, http://www.100md.com
泌无变化,而在电磁场作用晚期(3～5日),当cAMP水平及DNA合成都不再改变时,腱细胞分泌胶原
量显著增加(P<0.01)。结论 低频电磁场可能通过作用于cAMP-蛋白激酶A 信号转导系统,从而
调控人胚腱细胞增殖及胶原分泌。提示临床应用电磁场促进肌腱愈合宜从早期开始,并且需要刺
激足够长的时间。
中图号 R318.03
Low-frequencyElectromagnetic Fields Regulation in Growth andCollagen-production of Human
, 百拇医药 Embryonic Tenocytes Kang Qinglin, Jiang Zuyan, TianWancheng.Department of Orthopedics, 107th
Hospital of PLA, 264002
Abstract Objective To elucidate the mechanism of low-frequency electromagnetic fields ( LFEMF)
promoting human embryonic tenocyte growth and collagen-production.Method Passaged tenocytes were
divided into control group,LFEMF-treated for one-day group,treated for three-day group and treated for
, http://www.100md.com
five-day group.After treatment,the DNA-synthesis,cAMP intracellular level and hydroxy-proline of superplasm
of cultured cells were investigated. Results On the early state of LFEMF stimulation (1～3 days), DNA
synthesis and cAMP intracellular level increased simultaneously, collagen production wasn't observed with
any changes. Thus, on the late state(3～5 days),when DNA and cAMP didn't increase any more, collagen
, 百拇医药
production appeared to increase markedly. Conclusion LFEMF promoting human embryonic tenocyte
proliferation and collagen-production was probably through mediating cAMP intracellular level. LFEMF
stimulation for clinical tendon healing should begin as early as possible after tendon injury,and it's also necessary
to do long time enough.
Key words blastomeres/class;tendons/growth;electromagnetic fields; collagen/secrete;DNA/secrete
, http://www.100md.com
电磁场生物学效应机制十分复杂。近年来的研究发现,信号转导系统在介导电磁场作用中扮
演着重要角色〔1〕。cAMP是细胞内重要的第二信使物质,其水平高低与细胞DNA 合成及蛋白质
代谢密切相关〔2〕。我们已初步摸索了电磁场促进腱细胞增殖的最适用参数〔3〕。在此参数作
用下,人胚腱细胞生物学行为如何?本实验进行了探讨。
材 料 与 方 法
一、细胞培养及电磁场装置〔3〕 参见文献〔3〕,贴块法培养人胚腱细胞,传至3～5代,测得生长曲线稳定后,用于实验。低频
电磁场装置由一台信号发生器、一台放大器及一对直径20 cm的Helmholtz线圈组成(解放军后勤
, http://www.100md.com
工程学院研制)。电磁场参数波形、频率及场强可自行调整,线圈通过引线置二氧化碳孵箱中。
二、实验分组及刺激方法
将传代培养的人胚腱细胞分为A、B、C、D四组,A为对照组,B为刺激1日组,C为刺激3日组,D为刺激5日组,每组4个直径35 mm培养皿,每皿内预置小盖片一张,并加入细胞2×105/2 ml,各组
同时置孵箱内培养12小时后,B、C、D组置电磁场中接受处理,每日刺激8小时,电磁场参数为:
1.7 Hz、5～6×10-4T、正弦波形。24小时后自电磁场中取出B组,72小时后取出C组,120小时后取
出D组,各刺激组取出后仍与对照组放在一起培养,待全部刺激结束后,关闭电磁场,取上清液测定
, 百拇医药
羟脯氨酸,小盖片用于Feulgen染色及DNA测定。另取培养皿16个,分组与刺激方法同上,用于测定
细胞cAMP水平。
三、Feulgen染色及DNA含量测定〔4〕
取长有腱细胞的小盖片,D-Hanks液漂洗后,Feulgen染色,在自动图像分析仪(MD-20 德国)上、测定DNA含量。具体作法是,分别从每组每张片随机摄取25个细胞,每组共选100个细胞,进行镜
下扫描,输入计算机系统,自动计算DNA吸光值。
四、细胞cAMP测定
D-Hanks液淋洗细胞三次,0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,调整浓度6×105个/ml,每个样本取
, 百拇医药
上述细胞悬液1 ml,离心去上清后,加入-10℃1% Triton X-100 0.5 ml,立即置-20℃冰箱内,冻结后
置4℃冰箱内过夜,使细胞全部溶解,取出后离心,取上清用cAMP放免试剂盒(上海第二医科大学)
测定。具体方法参照说明书进行,结果以pmol/106细胞表示。
五、羟脯氨酸测定
取收集的各培养皿中上清液及6N HCl各1 ml,加入水解管中,在110℃条件下,水解24小时,再
用真空泵于70℃下将水解液抽干, 加入0.01 mol/L NaOH,室温放置4小时后加入0.01 mol/L HCl,用6300系统Na-S稀释液定容过滤,稀释到合适浓度,在氨基酸自动分析仪(Beckman-6300 美国)上
, 百拇医药
测试羟脯氨酸含量。
六、统计学处理
所有结果均以均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析。
结 果
一、细胞Feulgen染色及DNA含量测定
Feulgen染色后,光镜下观察 ,见细胞核内DNA着紫红色,胞浆不着色,处于分裂期细胞,核内
染色质堆积在一起,刺激组与对照组相比,核形态无异常改变。
表1 电磁场对腱细胞DNA代谢的
, 百拇医药 影响(
±s,n=100)
组 别
核总吸光值(Au)
对 照 组
20.85±1.57
刺激1日组
21.67±2.85*
刺激3日组
23.40±3.49*#
刺激5日组
, 百拇医药 24.02±2.52*#
注 与对照组比较 * P<0.05 与刺激1日组比较 # P<0.01
从表1看出,电磁场刺激1日组,核总吸光值高于对照组(P<0.05),刺激3日组及5日组均高于刺
激1日组(P<0.01),而刺激5日组则与3日组无明显差异。
二、细胞cAMP水平测定
表2 电磁场对腱细胞cAMP代谢的
影响(±s, n=4)
组 别
, 百拇医药
cAMP量(pmol/106cell)
对 照 组
2.25±0.26
刺激1日组
3.49±0.51*
刺激3日组
4.30±0.43*#
刺激5日组
4.87±0.39*#
注 与对照组比较 * P<0.01 与刺激1日组比较 # P<0.01
, http://www.100md.com
看出,电磁场刺激1日组,cAMP值高于对照组(P<0.01),刺激3日组及5日组均高于刺激1日组
(P<0.01),刺激5日组则与3日组无明显差异。
三、羟脯氨酸测定
表3 电磁场对腱细胞胶原分泌的作用(±s,n=4)
组 别
羟脯氨酸量 (mg/L)
对 照 组
3.88±0.47
刺激1日组
, 百拇医药
3.69±0.75
刺激3日组
4.02±0.54
刺激5日组
5.13±0.42△*#
注 与对照组比较 △ P<0.01与刺激1日组比较 * P<0.01与刺激3日组比较 # P<0.01
如表3所示,电磁场刺激1日组、3日组及对照组三组间羟脯氨酸量比较无明显差异,而刺激
5日组显著高于刺激1日组、3日组及对照组(P<0.01)。
讨 论
电磁场促进组织修复的病理学基础是刺激细胞增殖〔3〕。DNA作为生命活动的重要信息
, http://www.100md.com
分子,主要功能是传递细胞遗传信息,核总吸光值代表细胞核内DNA总含量〔4〕。本研究发现,电磁场刺激的各处理组人胚腱细胞DNA含量较对照组均明显增加,而且刺激3日组较1日组效果
好,刺激5日组则与3日组无显著差异。说明低频电磁场刺激对人胚腱细胞增殖有促进作用,而
且这种效应主要发生在细胞增殖的早期(1～3日)。从而提示,低频电磁场在临床上用以促进肌
腱愈合,宜尽早进行。
目前公认,电磁场与细胞作用的初始位点是胞膜,随后触发的一切反应都是由胞膜介导的〔1〕。
有研究发现,电磁场使细胞表面蛋白分子产生电泳作用,改变了胞膜表面电荷分布,从而调节受
, 百拇医药
配体结合信号转导系统,最终导致细胞生物学行为的改变〔5〕。cAMP-蛋白激酶A系统是细胞
内重要的第二信使体系,许多理化因素调控细胞分化增殖 ,即是通过调解cAMP代谢而实现的〔2〕。
本实验结果表明,低频电磁场促进人胚腱细胞增殖同时,胞内cAMP水平也呈现升高,其机制可能
是,电磁场作用于胞膜受体,引起腱细胞内cAMP水平改变,继而触发一系列磷酸化生物信号放大
反应,而调控细胞增殖。
胶原是腱细胞分泌的主要胞外基质,通常用以评价腱细胞分泌功能及肌腱愈合强度。羟脯
氨酸在胶原中固定含量为12.5%,测定羟脯氨酸可间接反映胶原量〔6〕。Murry等研究证实,鸡
, http://www.100md.com
胚腱细胞合成的胶原90%在分泌前要发生降解,而该过程是由胞内cAMP水平调控的,改变细胞
内cAMP水平可影响胶原分泌量〔7〕。本实验显示,在电磁场刺激早期(1～3日),人胚腱细胞内
cAMP水平增高时,细胞分泌胶原量无改变,而在后期(3～5日),当细胞cAMP水平不再改变时,细
胞分泌胶原量显著增加,细胞分泌胶原量与胞内cAMP变化呈明显的负相关。因此,低频电磁场
可能通过作用于细胞cAMP-蛋白激酶A系统而促进胶原分泌。其临床意义在于,电磁场促进肌
腱达到坚强愈合,不仅宜尽早进行,而且需要刺激足够长的时间。
在生物电磁学领域中,一些基本作用机制尚需进一步探讨。本课题从一个侧面说明,胞内
, 百拇医药
cAMP代谢是电磁场作用的重要“靶分子”,从而为揭示电磁场作用机制展现了有希望的前景。
(感谢第三军医大学西南医院理疗科吴宗耀教授审修本文)
参 考 文 献1 Lee RC,CanadayDJ,Doong II,et al.A review of the biophysical basis for theclinical application of
electric fields in soft tissue repair. J Burn CareRehabil,1993,14:319-325.
2 Baum BJ,Moss J, Breul SD. Effect of cAMP on the intracellulardegradation of newly synthesized
, 百拇医药
collagen.J Biolchem,1980,255:2843-2847.
3 康庆林,蒋祖言,王爱民,等.不同参数低频电磁场刺激对人胚腱细胞增殖的影响.中华物
理医学杂志,1997,19(2):105-107.
4 赵桂枝,陈华,林珠,等.恒磁场对人牙周膜成纤维细胞DNA代谢的影响.中华口腔医学杂
志,1994,29:75-78.
5 Mclaughlin S,Poo M.The role of electro-osmosis in the electricfield-induced movement of changed
macromolecules on the surface of cells. Biophys J,1981,34:85-93.
, 百拇医药
6 Paul R,Manske PR.Biochemical evidence of flexor tendonparticipation in the repair in vitro study.J
Hand Surg,1994,9B:117-120.
7 Murry JC,Farndale RW.Modulation of collagen production incultured fibroblasts by a low-frequency
pulsed magneticfield. Biochem Biophys Acta,1985,838:98-105.(收稿 1997-06-03 修回1997-12-26), http://www.100md.com
单位：264002 中国人民解放军第107医院骨科(康庆林、田万成)；重庆大坪医院(蒋祖言)
关键词：分裂球/分类；腱/生长和发育；电磁场；胶原/分泌；脱氧核糖核酸/分泌
中华物理医学杂志980104.htm 摘 要 目的 阐明低频电磁场促进人胚腱细胞增殖及分泌胶原的机制。方法 将传代培
养的人胚腱细胞分为对照组、刺激1日组、刺激3日组及刺激5日组,在电磁场刺激的不同时相点,分别测定细胞DNA含量、cAMP水平及胶原分泌量。结果 在低频电磁场作用早期(1～3日),细
胞cAMP水平与DNA合成均呈明显升高(P<0.05),细胞内信使物质合成及细胞增殖加快,但胶原分
, http://www.100md.com
泌无变化,而在电磁场作用晚期(3～5日),当cAMP水平及DNA合成都不再改变时,腱细胞分泌胶原
量显著增加(P<0.01)。结论 低频电磁场可能通过作用于cAMP-蛋白激酶A 信号转导系统,从而
调控人胚腱细胞增殖及胶原分泌。提示临床应用电磁场促进肌腱愈合宜从早期开始,并且需要刺
激足够长的时间。
中图号 R318.03
Low-frequencyElectromagnetic Fields Regulation in Growth andCollagen-production of Human
, 百拇医药 Embryonic Tenocytes Kang Qinglin, Jiang Zuyan, TianWancheng.Department of Orthopedics, 107th
Hospital of PLA, 264002
Abstract Objective To elucidate the mechanism of low-frequency electromagnetic fields ( LFEMF)
promoting human embryonic tenocyte growth and collagen-production.Method Passaged tenocytes were
divided into control group,LFEMF-treated for one-day group,treated for three-day group and treated for
, http://www.100md.com
five-day group.After treatment,the DNA-synthesis,cAMP intracellular level and hydroxy-proline of superplasm
of cultured cells were investigated. Results On the early state of LFEMF stimulation (1～3 days), DNA
synthesis and cAMP intracellular level increased simultaneously, collagen production wasn't observed with
any changes. Thus, on the late state(3～5 days),when DNA and cAMP didn't increase any more, collagen
, 百拇医药
production appeared to increase markedly. Conclusion LFEMF promoting human embryonic tenocyte
proliferation and collagen-production was probably through mediating cAMP intracellular level. LFEMF
stimulation for clinical tendon healing should begin as early as possible after tendon injury,and it's also necessary
to do long time enough.
Key words blastomeres/class;tendons/growth;electromagnetic fields; collagen/secrete;DNA/secrete
, http://www.100md.com
电磁场生物学效应机制十分复杂。近年来的研究发现,信号转导系统在介导电磁场作用中扮
演着重要角色〔1〕。cAMP是细胞内重要的第二信使物质,其水平高低与细胞DNA 合成及蛋白质
代谢密切相关〔2〕。我们已初步摸索了电磁场促进腱细胞增殖的最适用参数〔3〕。在此参数作
用下,人胚腱细胞生物学行为如何?本实验进行了探讨。
材 料 与 方 法
一、细胞培养及电磁场装置〔3〕 参见文献〔3〕,贴块法培养人胚腱细胞,传至3～5代,测得生长曲线稳定后,用于实验。低频
电磁场装置由一台信号发生器、一台放大器及一对直径20 cm的Helmholtz线圈组成(解放军后勤
, http://www.100md.com
工程学院研制)。电磁场参数波形、频率及场强可自行调整,线圈通过引线置二氧化碳孵箱中。
二、实验分组及刺激方法
将传代培养的人胚腱细胞分为A、B、C、D四组,A为对照组,B为刺激1日组,C为刺激3日组,D为刺激5日组,每组4个直径35 mm培养皿,每皿内预置小盖片一张,并加入细胞2×105/2 ml,各组
同时置孵箱内培养12小时后,B、C、D组置电磁场中接受处理,每日刺激8小时,电磁场参数为:
1.7 Hz、5～6×10-4T、正弦波形。24小时后自电磁场中取出B组,72小时后取出C组,120小时后取
出D组,各刺激组取出后仍与对照组放在一起培养,待全部刺激结束后,关闭电磁场,取上清液测定
, 百拇医药
羟脯氨酸,小盖片用于Feulgen染色及DNA测定。另取培养皿16个,分组与刺激方法同上,用于测定
细胞cAMP水平。
三、Feulgen染色及DNA含量测定〔4〕
取长有腱细胞的小盖片,D-Hanks液漂洗后,Feulgen染色,在自动图像分析仪(MD-20 德国)上、测定DNA含量。具体作法是,分别从每组每张片随机摄取25个细胞,每组共选100个细胞,进行镜
下扫描,输入计算机系统,自动计算DNA吸光值。
四、细胞cAMP测定
D-Hanks液淋洗细胞三次,0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,调整浓度6×105个/ml,每个样本取
, 百拇医药
上述细胞悬液1 ml,离心去上清后,加入-10℃1% Triton X-100 0.5 ml,立即置-20℃冰箱内,冻结后
置4℃冰箱内过夜,使细胞全部溶解,取出后离心,取上清用cAMP放免试剂盒(上海第二医科大学)
测定。具体方法参照说明书进行,结果以pmol/106细胞表示。
五、羟脯氨酸测定
取收集的各培养皿中上清液及6N HCl各1 ml,加入水解管中,在110℃条件下,水解24小时,再
用真空泵于70℃下将水解液抽干, 加入0.01 mol/L NaOH,室温放置4小时后加入0.01 mol/L HCl,用6300系统Na-S稀释液定容过滤,稀释到合适浓度,在氨基酸自动分析仪(Beckman-6300 美国)上
, 百拇医药
测试羟脯氨酸含量。
六、统计学处理
所有结果均以均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析。
结 果
一、细胞Feulgen染色及DNA含量测定
Feulgen染色后,光镜下观察 ,见细胞核内DNA着紫红色,胞浆不着色,处于分裂期细胞,核内
染色质堆积在一起,刺激组与对照组相比,核形态无异常改变。
表1 电磁场对腱细胞DNA代谢的
, 百拇医药 影响(
±s,n=100)组 别
核总吸光值(Au)
对 照 组
20.85±1.57
刺激1日组
21.67±2.85*
刺激3日组
23.40±3.49*#
刺激5日组
, 百拇医药 24.02±2.52*#
注 与对照组比较 * P<0.05 与刺激1日组比较 # P<0.01
从表1看出,电磁场刺激1日组,核总吸光值高于对照组(P<0.05),刺激3日组及5日组均高于刺
激1日组(P<0.01),而刺激5日组则与3日组无明显差异。
二、细胞cAMP水平测定
表2 电磁场对腱细胞cAMP代谢的
影响(
±s, n=4)组 别
, 百拇医药
cAMP量(pmol/106cell)
对 照 组
2.25±0.26
刺激1日组
3.49±0.51*
刺激3日组
4.30±0.43*#
刺激5日组
4.87±0.39*#
注 与对照组比较 * P<0.01 与刺激1日组比较 # P<0.01
, http://www.100md.com
看出,电磁场刺激1日组,cAMP值高于对照组(P<0.01),刺激3日组及5日组均高于刺激1日组
(P<0.01),刺激5日组则与3日组无明显差异。
三、羟脯氨酸测定
表3 电磁场对腱细胞胶原分泌的作用(
组 别
羟脯氨酸量 (mg/L)
对 照 组
3.88±0.47
刺激1日组
, 百拇医药
3.69±0.75
刺激3日组
4.02±0.54
刺激5日组
5.13±0.42△*#
注 与对照组比较 △ P<0.01与刺激1日组比较 * P<0.01与刺激3日组比较 # P<0.01
如表3所示,电磁场刺激1日组、3日组及对照组三组间羟脯氨酸量比较无明显差异,而刺激
5日组显著高于刺激1日组、3日组及对照组(P<0.01)。
讨 论
电磁场促进组织修复的病理学基础是刺激细胞增殖〔3〕。DNA作为生命活动的重要信息
, http://www.100md.com
分子,主要功能是传递细胞遗传信息,核总吸光值代表细胞核内DNA总含量〔4〕。本研究发现,电磁场刺激的各处理组人胚腱细胞DNA含量较对照组均明显增加,而且刺激3日组较1日组效果
好,刺激5日组则与3日组无显著差异。说明低频电磁场刺激对人胚腱细胞增殖有促进作用,而
且这种效应主要发生在细胞增殖的早期(1～3日)。从而提示,低频电磁场在临床上用以促进肌
腱愈合,宜尽早进行。
目前公认,电磁场与细胞作用的初始位点是胞膜,随后触发的一切反应都是由胞膜介导的〔1〕。
有研究发现,电磁场使细胞表面蛋白分子产生电泳作用,改变了胞膜表面电荷分布,从而调节受
, 百拇医药
配体结合信号转导系统,最终导致细胞生物学行为的改变〔5〕。cAMP-蛋白激酶A系统是细胞
内重要的第二信使体系,许多理化因素调控细胞分化增殖 ,即是通过调解cAMP代谢而实现的〔2〕。
本实验结果表明,低频电磁场促进人胚腱细胞增殖同时,胞内cAMP水平也呈现升高,其机制可能
是,电磁场作用于胞膜受体,引起腱细胞内cAMP水平改变,继而触发一系列磷酸化生物信号放大
反应,而调控细胞增殖。
胶原是腱细胞分泌的主要胞外基质,通常用以评价腱细胞分泌功能及肌腱愈合强度。羟脯
氨酸在胶原中固定含量为12.5%,测定羟脯氨酸可间接反映胶原量〔6〕。Murry等研究证实,鸡
, http://www.100md.com
胚腱细胞合成的胶原90%在分泌前要发生降解,而该过程是由胞内cAMP水平调控的,改变细胞
内cAMP水平可影响胶原分泌量〔7〕。本实验显示,在电磁场刺激早期(1～3日),人胚腱细胞内
cAMP水平增高时,细胞分泌胶原量无改变,而在后期(3～5日),当细胞cAMP水平不再改变时,细
胞分泌胶原量显著增加,细胞分泌胶原量与胞内cAMP变化呈明显的负相关。因此,低频电磁场
可能通过作用于细胞cAMP-蛋白激酶A系统而促进胶原分泌。其临床意义在于,电磁场促进肌
腱达到坚强愈合,不仅宜尽早进行,而且需要刺激足够长的时间。
在生物电磁学领域中,一些基本作用机制尚需进一步探讨。本课题从一个侧面说明,胞内
, 百拇医药
cAMP代谢是电磁场作用的重要“靶分子”,从而为揭示电磁场作用机制展现了有希望的前景。
(感谢第三军医大学西南医院理疗科吴宗耀教授审修本文)
参 考 文 献1 Lee RC,CanadayDJ,Doong II,et al.A review of the biophysical basis for theclinical application of
electric fields in soft tissue repair. J Burn CareRehabil,1993,14:319-325.
2 Baum BJ,Moss J, Breul SD. Effect of cAMP on the intracellulardegradation of newly synthesized
, 百拇医药
collagen.J Biolchem,1980,255:2843-2847.
3 康庆林,蒋祖言,王爱民,等.不同参数低频电磁场刺激对人胚腱细胞增殖的影响.中华物
理医学杂志,1997,19(2):105-107.
4 赵桂枝,陈华,林珠,等.恒磁场对人牙周膜成纤维细胞DNA代谢的影响.中华口腔医学杂
志,1994,29:75-78.
5 Mclaughlin S,Poo M.The role of electro-osmosis in the electricfield-induced movement of changed
macromolecules on the surface of cells. Biophys J,1981,34:85-93.
, 百拇医药
6 Paul R,Manske PR.Biochemical evidence of flexor tendonparticipation in the repair in vitro study.J
Hand Surg,1994,9B:117-120.
7 Murry JC,Farndale RW.Modulation of collagen production incultured fibroblasts by a low-frequency
pulsed magneticfield. Biochem Biophys Acta,1985,838:98-105.(收稿 1997-06-03 修回1997-12-26), http://www.100md.com