低功率毫米波对人外周血淋巴细胞钙离子浓度及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响
作者：陈念永 张伟 赵勇 杨家林 陈乐 张富鑫 刘盛纲
单位： 610041 成都，四川省肿瘤研究所(陈念永、张伟、赵勇、杨家林、陈乐)；中国电子科技大学(刘盛纲、张富鑫)
关键词：淋巴细胞/代谢，辐射损伤，实验性，腺苷三磷酸酶类/代谢
中华物理医学杂志980102.htm 摘 要 目的 探索毫米波对细胞质膜通透性及细胞功能的影响。方法 以波长7.1mm，功率密度为10 mW/cm2毫米波辐照人外周血淋巴细胞15、30、60分钟， 并采用钙荧光指示
剂Fura-2/Am定量测试法检测淋巴细胞内游离钙浓度和质膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化。结果
, http://www.100md.com
辐照后淋巴细胞内游离钙浓度明显低于正常(P<0.05)；同时细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增
加(P<0.05)；而且辐照后细胞内游离钙浓度降低与质膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶的激活呈负相关。
结论 一定频率窗和能量窗的毫米波辐照激活细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，使细胞膜对钙
通透性发生变化，且影响到细胞内Ca2+贮存，造成细胞膜通透性和细胞功能的改变。
中图号 R318.03
, 百拇医药
LowPower Density Millimetre-wave Radiation on Cytoplasmic FreeCalcium Concentration and
Plasma Membrane Ca2+Mg2+ATPase Activity of Human Peripheral Blood Lymphocytes Chen
Nianyong,ZhangWei,Zhao Yong,et al.Cancer Hospital & Institute ofSichuan Province,Chengdu
610041
, 百拇医药
Abstract Objective To investigate the effect of low power density millimeter-wave radiation on
cytoplasmic free calcium concentration and the change of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase activity
of human peripheral blood lymphocytes.Methods Human peripheral blood lymphocytes,in vitro,randomized
into radiated group or control group. Lymphocytes were exposed to 7.1mm millimeter-wave for 15,30,60min, and then the cytoplasmic free calcium concentration in human peripheral blood lymphocytes were
, 百拇医药
measured by fluorescent indicator Fura- 2/Am estimating technique and the change of plasma membrane
Ca2+-Mg2+-ATPase activity in lymphocytes were measured by Lowry's technique.Results The concentration
of intracellular plasmic free calcium was lower in radiated group than in control group(P<0.05), and the
activity of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase increased significantly. Those changes reduced along
, 百拇医药
with the length of exposing time. It showed that the concentration of intracellular free calcium correlated
with the change of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase activity. Conclusion The activity of plasma
membrane Ca2+-Mg2+-ATPase was activated by millimeter -wave radiation of certain “radiofrequency
window” and “energy window”,andthen followed by the change of permeability of plasma membrane,influencing the change of storage of intracellular free calciumand the change of permeability of cell membrane
, 百拇医药
and also cellular function.
Key words lymphocytes/metab;radiation injuries,experimental;adenosine triphosphatase/metab
国内外研究资料证明，低功率毫米波对生物体产生广谱的生物效应，尤其是非热生物效应及
其医学应用已引起广泛兴趣，但人们对毫米波产生的非热生物效应机理了解甚少。本试验研究低
功率毫米波辐照人外周血(离体)正常淋巴细胞，测定细胞内Ca2+浓度及细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶
活性的变化，了解毫米波对正常细胞质膜通透性及细胞功能的影响。
, 百拇医药
材 料 与 方 法
一、材料
1.人外周血淋巴细胞的分离与培养：采集住院肿瘤病人外周血(静脉血)，按文献〔1〕方法加
以改进，无菌分离并获得人外周血正常淋巴细胞于37℃、5%CO2孵箱内培养24小时，备用。
2.毫米波辐射装置：中国电子科技大学研制提供的“EHF毫米波多功能治疗仪”。
3.毫米波辐照参量：波长为7.1 mm，功率密度为10 mW/cm2，辐射喇叭口径20×20 mm2。
二、实验设计与分组
, 百拇医药 将分离获得的淋巴细胞分为对照组和辐照组，每组按辐照时间分为15、30及60分钟三组，每
组细胞样本均为5例，即分别将5例病人的外周血分离培养的淋巴细胞按辐照时间15、30、60分钟
等分为三组。
三、实验方法与观察指标
1.辐照方法：在室温下，毫米波辐射头直接照射细胞培养皿，每组按辐照时间分组分别辐照
每天一次，共三次。
2.淋巴细胞内钙离子浓度测定：
按文献〔2〕方法，细胞经毫米波辐照后先经Fura-2/Am(分子式C44H47O24N3，MW1001.86,Sigma公司)负载。取Fura-2/Am 100 μg溶于100 μl 二甲基亚砜， 制成100 μmol/L的应用液，转
, http://www.100md.com
入40 ml RPMI-1640细胞悬液内，混匀后,置于37℃水浴振荡温育40 min，同时充入95%O2与5%CO2
气体，速度为60个气泡/min。负载后， 细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，并用无钙离
子缓冲液(按文献〔3〕配方)再悬浮，保持在37℃水浴中待测。而后行荧光强度测定，取1011/L
细胞悬液1 ml 入锥形塑料小管中，用微型离心机以10 000 r/min离心15 s，弃上清液，加2 ml
10 mmol/L无钙离子缓冲液使细胞悬浮混匀，迅速转入荧光测定杯中，置于日立850 荧光分光光度
仪测定细胞荧光强度，并以0.1%伊文思蓝染色法观测细胞活度。其结果先按公式：Fmin=FMn2++1/6
, http://www.100md.com
(Fmax-FMn)计算出未与Ca2+结合时 Fura-2自身的荧光强度(Fmin)，然后用下式推算出淋巴细
胞内游离钙离子浓度〔3〕。〔Ca2+〕=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)。Kd为Fura-2与Ca2+的解离参数，其
值为224 nm。
3.细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶活性测定：参照文献〔4〕提取细胞膜，用Lowry法进行蛋白定量，用钼铵定磷法测定质膜Ca2+Mg2+-ATP酶活性〔5〕。
结 果
, 百拇医药 一、低功率毫米波辐照后淋巴细胞内钙离子浓度变化：人外周血淋巴细胞经10 mW/cm2的功
率密度辐照后，细胞内游离钙离子浓度明显低于正常(对照组)，见表1。
表1 毫米波对正常淋巴细胞内
游离钙影响(nmol/106cell)
时间(min)
对照组
辐照组
P值
15
, 百拇医药 135.82±2.51
90.10±1.60
<0.05
30
134.90±3.44
99.34±3.80
<0.05
60
130.36±2.93
111.06±3.71
<0.05
提示低功率毫米波辐照影响了正常淋巴细胞质膜对钙离子通透性及细胞内钙离子的贮存，且随着辐照时间的延长，细胞内钙离子降低幅度逐渐减小，并趋于接近正常。
, 百拇医药
二、低功率毫米波辐照对淋巴细胞膜钙镁离子-ATP酶活性的影响：淋巴细胞辐照后细胞膜
Ca2+Mg2+-ATP酶活性增加，并随辐照时间延长该酶的激活作用趋于变小，见表2。
表2 毫米波对细胞膜Ca2+Mg2+-ATP
酶活性影响(nmolPi/mgPr.min-1)
时间(min)
对照组
辐照组
P值
, http://www.100md.com 15
68.74±8.34
225.10±29.14
<0.05
30
70.90±7.63
131.71±9.23
<0.05
60
67.42±6.46
110.81±10.48
<0.05
, 百拇医药
三、低功率毫米波辐照后人外周血淋巴细胞内钙离子变化与质膜钙镁离子-ATP酶活性改变的关系：
从表1、表2看出人外周血淋巴细胞经10 mW/cm2毫米波辐照后细胞内的钙离子浓度降低与其质膜上
Ca2+Mg2+-ATP酶(钙泵)活性激活呈负相关关系。(相关系数r=-0.834)。
讨 论
毫米波对生物体产生具有重要意义的非热生物效应，近来受到广泛重视，其作用主要是基于
信息作用机制，并以恢复机体功能为作用方向。目前有限的研究资料提示毫米波辐射对生物大分
子、细胞增殖、机体代谢等产生不同层次上的影响〔6〕，因此进一步研究生物体对毫米波辐射是
, 百拇医药
怎样产生反应的就具有重要意义。已有资料〔7〕表明，微波具有“频率窗效应”和“能量窗效应”，并且所产生的生物效应与细胞所处的状态有关。因此本试验在研究毫米波对细胞的作用时，在固
定频率窗和能量窗条件下，按质控要求，用波长为7.1mm的毫米波辐照人外周血淋巴细胞， 通过
测定细胞内钙离子浓度的变化和质膜“钙泵”活性，研究对细胞结构和功能的影响，为阐述毫米
波对细胞作用机理提供依据。
本试验研究发现人外周血淋巴细胞经低功率毫米波辐射后细胞内钙离子浓度发生变化，较对
照组降低且有统计学意义(P<0.05)，并随每次辐照时间延长， 细胞内钙离子浓度降低幅度逐
渐减小，提示一定频率窗和能量窗的毫米波辐射影响了细胞膜对Ca2+通透和细胞内Ca2+贮存；而
, 百拇医药
且还发现细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶被激活，亦随辐照时间延长激活作用减弱，并与细胞内钙离子浓
度呈显著负相关。对于变化是否存在一定的时间阈值，尚需研究，但是每次辐照时间超过60分钟
后作用减弱。
细胞内钙离子通过与CaM结合而激活蛋白激酶或磷酸酶， 产生一系列蛋白磷酸化反应，向细
胞核内传递增殖信号，诱导核内基因表达增殖，进而促进DNA 合成。因此细胞内钙离子的平衡对
维持细胞的作用，主要是在对细胞膜的作用上可能起着关键性的作用。本试验提示毫米波通过对
正常淋巴细胞膜通透性的影响造成细胞内钙离子浓度的变化。这种改变是否影响细胞DNA合成和
, 百拇医药
细胞功能， 增加照射次数后对细胞内钙离子、“钙泵”的影响，以及毫米波辐射对病态细胞，尤其是对癌细胞钙离子、“钙泵”活性的影响，有待进一步深入研究。
本试验结果支持这样的作用机理：高频电磁波可能通过生物体内尤其是细胞极性分子和离子
产生非线性振荡和谐振而产生生物效应，且高频电磁波作用于胞膜并穿透胞膜作用于细胞内物质。
质膜极性物质和胞内钙离子可能是电磁场中的敏感共振谐子。
本文为国家863计划强辐射基金资助项目(863-H96-2)
参 考 文 献1 Brown SL,Dennis EVE. Suppression of T lymphocyte chemotactic factorproduction by the opioid peptides
, http://www.100md.com
B-endorphin and MEF-enkephalin. J Immunol,1985,134(5):3384-3387.
2 程锦轩,张一彬,段全虹,等.蝙蝠葛苏林碱对兔淋巴细胞内钙含量的影响.中国药理学通报,1992，8(3)：198-201.
3 Tsion RY,Pozzan T,Rink TJ.Calcium homeostsis in intactlymphocytes: cytoplasmic free calcium-monitored
with a new intracellularly trapped fluorescent indicator.J CellBiol,1982,94:325-328.
4 Trevillyan JM. High tyrosine-specific protein kinase activityin normal human peripheral blood lymphocytes.
, http://www.100md.com
Biochem Biophys Acta,1985, 845:1-4.
5 Reinila M, MacDonald E, Salem N,et al. Standardized method forthe determination of human erythrocyte
membrane adenosinetriphosphatase. AnalyticBiochem,1982,124:19-21.
6 张富鑫,林崇文.极高频生物医学电子学.成都:电子科技大学出版社，1993:53-62.
7 Adey WR. Effects of microwave on cell andmolecules.Nature,1988,332 :401-403.
(收稿 1997-09-15 修回 1997-12-10), 百拇医药
单位： 610041 成都，四川省肿瘤研究所(陈念永、张伟、赵勇、杨家林、陈乐)；中国电子科技大学(刘盛纲、张富鑫)
关键词：淋巴细胞/代谢，辐射损伤，实验性，腺苷三磷酸酶类/代谢
中华物理医学杂志980102.htm 摘 要 目的 探索毫米波对细胞质膜通透性及细胞功能的影响。方法 以波长7.1mm，功率密度为10 mW/cm2毫米波辐照人外周血淋巴细胞15、30、60分钟， 并采用钙荧光指示
剂Fura-2/Am定量测试法检测淋巴细胞内游离钙浓度和质膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化。结果
, http://www.100md.com
辐照后淋巴细胞内游离钙浓度明显低于正常(P<0.05)；同时细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增
加(P<0.05)；而且辐照后细胞内游离钙浓度降低与质膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶的激活呈负相关。
结论 一定频率窗和能量窗的毫米波辐照激活细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，使细胞膜对钙
通透性发生变化，且影响到细胞内Ca2+贮存，造成细胞膜通透性和细胞功能的改变。
中图号 R318.03
, 百拇医药
LowPower Density Millimetre-wave Radiation on Cytoplasmic FreeCalcium Concentration and
Plasma Membrane Ca2+Mg2+ATPase Activity of Human Peripheral Blood Lymphocytes Chen
Nianyong,ZhangWei,Zhao Yong,et al.Cancer Hospital & Institute ofSichuan Province,Chengdu
610041
, 百拇医药
Abstract Objective To investigate the effect of low power density millimeter-wave radiation on
cytoplasmic free calcium concentration and the change of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase activity
of human peripheral blood lymphocytes.Methods Human peripheral blood lymphocytes,in vitro,randomized
into radiated group or control group. Lymphocytes were exposed to 7.1mm millimeter-wave for 15,30,60min, and then the cytoplasmic free calcium concentration in human peripheral blood lymphocytes were
, 百拇医药
measured by fluorescent indicator Fura- 2/Am estimating technique and the change of plasma membrane
Ca2+-Mg2+-ATPase activity in lymphocytes were measured by Lowry's technique.Results The concentration
of intracellular plasmic free calcium was lower in radiated group than in control group(P<0.05), and the
activity of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase increased significantly. Those changes reduced along
, 百拇医药
with the length of exposing time. It showed that the concentration of intracellular free calcium correlated
with the change of plasma membrane Ca2+-Mg2+-ATPase activity. Conclusion The activity of plasma
membrane Ca2+-Mg2+-ATPase was activated by millimeter -wave radiation of certain “radiofrequency
window” and “energy window”,andthen followed by the change of permeability of plasma membrane,influencing the change of storage of intracellular free calciumand the change of permeability of cell membrane
, 百拇医药
and also cellular function.
Key words lymphocytes/metab;radiation injuries,experimental;adenosine triphosphatase/metab
国内外研究资料证明，低功率毫米波对生物体产生广谱的生物效应，尤其是非热生物效应及
其医学应用已引起广泛兴趣，但人们对毫米波产生的非热生物效应机理了解甚少。本试验研究低
功率毫米波辐照人外周血(离体)正常淋巴细胞，测定细胞内Ca2+浓度及细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶
活性的变化，了解毫米波对正常细胞质膜通透性及细胞功能的影响。
, 百拇医药
材 料 与 方 法
一、材料
1.人外周血淋巴细胞的分离与培养：采集住院肿瘤病人外周血(静脉血)，按文献〔1〕方法加
以改进，无菌分离并获得人外周血正常淋巴细胞于37℃、5%CO2孵箱内培养24小时，备用。
2.毫米波辐射装置：中国电子科技大学研制提供的“EHF毫米波多功能治疗仪”。
3.毫米波辐照参量：波长为7.1 mm，功率密度为10 mW/cm2，辐射喇叭口径20×20 mm2。
二、实验设计与分组
, 百拇医药 将分离获得的淋巴细胞分为对照组和辐照组，每组按辐照时间分为15、30及60分钟三组，每
组细胞样本均为5例，即分别将5例病人的外周血分离培养的淋巴细胞按辐照时间15、30、60分钟
等分为三组。
三、实验方法与观察指标
1.辐照方法：在室温下，毫米波辐射头直接照射细胞培养皿，每组按辐照时间分组分别辐照
每天一次，共三次。
2.淋巴细胞内钙离子浓度测定：
按文献〔2〕方法，细胞经毫米波辐照后先经Fura-2/Am(分子式C44H47O24N3，MW1001.86,Sigma公司)负载。取Fura-2/Am 100 μg溶于100 μl 二甲基亚砜， 制成100 μmol/L的应用液，转
, http://www.100md.com
入40 ml RPMI-1640细胞悬液内，混匀后,置于37℃水浴振荡温育40 min，同时充入95%O2与5%CO2
气体，速度为60个气泡/min。负载后， 细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，并用无钙离
子缓冲液(按文献〔3〕配方)再悬浮，保持在37℃水浴中待测。而后行荧光强度测定，取1011/L
细胞悬液1 ml 入锥形塑料小管中，用微型离心机以10 000 r/min离心15 s，弃上清液，加2 ml
10 mmol/L无钙离子缓冲液使细胞悬浮混匀，迅速转入荧光测定杯中，置于日立850 荧光分光光度
仪测定细胞荧光强度，并以0.1%伊文思蓝染色法观测细胞活度。其结果先按公式：Fmin=FMn2++1/6
, http://www.100md.com
(Fmax-FMn)计算出未与Ca2+结合时 Fura-2自身的荧光强度(Fmin)，然后用下式推算出淋巴细
胞内游离钙离子浓度〔3〕。〔Ca2+〕=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)。Kd为Fura-2与Ca2+的解离参数，其
值为224 nm。
3.细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶活性测定：参照文献〔4〕提取细胞膜，用Lowry法进行蛋白定量，用钼铵定磷法测定质膜Ca2+Mg2+-ATP酶活性〔5〕。
结 果
, 百拇医药 一、低功率毫米波辐照后淋巴细胞内钙离子浓度变化：人外周血淋巴细胞经10 mW/cm2的功
率密度辐照后，细胞内游离钙离子浓度明显低于正常(对照组)，见表1。
表1 毫米波对正常淋巴细胞内
游离钙影响(nmol/106cell)
时间(min)
对照组
辐照组
P值
15
, 百拇医药 135.82±2.51
90.10±1.60
<0.05
30
134.90±3.44
99.34±3.80
<0.05
60
130.36±2.93
111.06±3.71
<0.05
提示低功率毫米波辐照影响了正常淋巴细胞质膜对钙离子通透性及细胞内钙离子的贮存，且随着辐照时间的延长，细胞内钙离子降低幅度逐渐减小，并趋于接近正常。
, 百拇医药
二、低功率毫米波辐照对淋巴细胞膜钙镁离子-ATP酶活性的影响：淋巴细胞辐照后细胞膜
Ca2+Mg2+-ATP酶活性增加，并随辐照时间延长该酶的激活作用趋于变小，见表2。
表2 毫米波对细胞膜Ca2+Mg2+-ATP
酶活性影响(nmolPi/mgPr.min-1)
时间(min)
对照组
辐照组
P值
, http://www.100md.com 15
68.74±8.34
225.10±29.14
<0.05
30
70.90±7.63
131.71±9.23
<0.05
60
67.42±6.46
110.81±10.48
<0.05
, 百拇医药
三、低功率毫米波辐照后人外周血淋巴细胞内钙离子变化与质膜钙镁离子-ATP酶活性改变的关系：
从表1、表2看出人外周血淋巴细胞经10 mW/cm2毫米波辐照后细胞内的钙离子浓度降低与其质膜上
Ca2+Mg2+-ATP酶(钙泵)活性激活呈负相关关系。(相关系数r=-0.834)。
讨 论
毫米波对生物体产生具有重要意义的非热生物效应，近来受到广泛重视，其作用主要是基于
信息作用机制，并以恢复机体功能为作用方向。目前有限的研究资料提示毫米波辐射对生物大分
子、细胞增殖、机体代谢等产生不同层次上的影响〔6〕，因此进一步研究生物体对毫米波辐射是
, 百拇医药
怎样产生反应的就具有重要意义。已有资料〔7〕表明，微波具有“频率窗效应”和“能量窗效应”，并且所产生的生物效应与细胞所处的状态有关。因此本试验在研究毫米波对细胞的作用时，在固
定频率窗和能量窗条件下，按质控要求，用波长为7.1mm的毫米波辐照人外周血淋巴细胞， 通过
测定细胞内钙离子浓度的变化和质膜“钙泵”活性，研究对细胞结构和功能的影响，为阐述毫米
波对细胞作用机理提供依据。
本试验研究发现人外周血淋巴细胞经低功率毫米波辐射后细胞内钙离子浓度发生变化，较对
照组降低且有统计学意义(P<0.05)，并随每次辐照时间延长， 细胞内钙离子浓度降低幅度逐
渐减小，提示一定频率窗和能量窗的毫米波辐射影响了细胞膜对Ca2+通透和细胞内Ca2+贮存；而
, 百拇医药
且还发现细胞膜Ca2+Mg2+-ATP酶被激活，亦随辐照时间延长激活作用减弱，并与细胞内钙离子浓
度呈显著负相关。对于变化是否存在一定的时间阈值，尚需研究，但是每次辐照时间超过60分钟
后作用减弱。
细胞内钙离子通过与CaM结合而激活蛋白激酶或磷酸酶， 产生一系列蛋白磷酸化反应，向细
胞核内传递增殖信号，诱导核内基因表达增殖，进而促进DNA 合成。因此细胞内钙离子的平衡对
维持细胞的作用，主要是在对细胞膜的作用上可能起着关键性的作用。本试验提示毫米波通过对
正常淋巴细胞膜通透性的影响造成细胞内钙离子浓度的变化。这种改变是否影响细胞DNA合成和
, 百拇医药
细胞功能， 增加照射次数后对细胞内钙离子、“钙泵”的影响，以及毫米波辐射对病态细胞，尤其是对癌细胞钙离子、“钙泵”活性的影响，有待进一步深入研究。
本试验结果支持这样的作用机理：高频电磁波可能通过生物体内尤其是细胞极性分子和离子
产生非线性振荡和谐振而产生生物效应，且高频电磁波作用于胞膜并穿透胞膜作用于细胞内物质。
质膜极性物质和胞内钙离子可能是电磁场中的敏感共振谐子。
本文为国家863计划强辐射基金资助项目(863-H96-2)
参 考 文 献1 Brown SL,Dennis EVE. Suppression of T lymphocyte chemotactic factorproduction by the opioid peptides
, http://www.100md.com
B-endorphin and MEF-enkephalin. J Immunol,1985,134(5):3384-3387.
2 程锦轩,张一彬,段全虹,等.蝙蝠葛苏林碱对兔淋巴细胞内钙含量的影响.中国药理学通报,1992，8(3)：198-201.
3 Tsion RY,Pozzan T,Rink TJ.Calcium homeostsis in intactlymphocytes: cytoplasmic free calcium-monitored
with a new intracellularly trapped fluorescent indicator.J CellBiol,1982,94:325-328.
4 Trevillyan JM. High tyrosine-specific protein kinase activityin normal human peripheral blood lymphocytes.
, http://www.100md.com
Biochem Biophys Acta,1985, 845:1-4.
5 Reinila M, MacDonald E, Salem N,et al. Standardized method forthe determination of human erythrocyte
membrane adenosinetriphosphatase. AnalyticBiochem,1982,124:19-21.
6 张富鑫,林崇文.极高频生物医学电子学.成都:电子科技大学出版社，1993:53-62.
7 Adey WR. Effects of microwave on cell andmolecules.Nature,1988,332 :401-403.
(收稿 1997-09-15 修回 1997-12-10), 百拇医药