肾炎3号方对离体肾小球培养系膜细胞增殖及IL-1水平的影响
作者：姜德训1 黄文政2 杨洪涛2 陈志强2
单位：姜德训(北京军区总医院 北京100700)；黄文政 杨洪涛2 陈志强2(天津中医学院第一附属医院 天津300192)
关键词：肾炎3号方；肾小球系膜细胞；白细胞介素1；慢性肾炎
北京中医药大学学报000613
摘要：用不同药物喂家兔后取血清加入系膜细胞培养液中观察其增殖及产生IL-1的 水平。结 果：肾炎3号方可显著抑制正常及病理状态下肾小球系膜细胞增殖及其产生IL-1的水平，且 抑制IL-1分泌活性强于雷公藤(P<0.05)。提示肾炎3号方可抑制肾小 球系膜细胞增殖及其 产生IL-1水平，打破以系膜细胞为中心的调节网络，对以系膜增生为主的慢性肾炎有很好 的治疗 作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5
The Effects of Shenyan No.3 on the Multiplication of
Isolated Mesangial Cells and Their IL-1 Level
Jiang Dexun (姜德训), Huang Wenzheng (黄文政), Yang Hongtao (杨洪涛), et al.
(The General Hospital, Beijing Military Region, Beijing 100700)
ABSTRACT: In this experiment, different drugs including Shenyan No.3 (S No .3) were given to the rabbit first, and then the rabbit's serum was separated an d added to into the mesangial cell culture solution; afterwards, an observation on mesangial cell multiplication and mesangial cell IL-1 level was made. The re sults showed that S No.3 could strikingly inhibit mesangial cell multiplication and mesangial cell IL-1 secretion under both normal and pathological conditions (P<0.01), and the inhibiting effect of S No. 3 on mesangial cell IL-1 sec retion was stronger than that of Tripterygium wilfordii (P<0.05). The reults implies t hat S No.3 may have a good effect on the chronic nephritis with mesangial cell proli feration as a main evidence in its pathology.
, 百拇医药
KEY WORDS: Shenyan No.3; Mesangial Cell; Interleukin-1; Chronic Nephritis
1 材料与方法
1.1 实验材料：纯系SD大鼠，雌雄不限，体重150～200 g；纯种大耳白兔，雌雄不限，体重2.0～2 .5 g， 以上动物由国家医药管理局天津药物研究院实验动物室提供。雷公藤片由湖北省黄石市制药 厂提供，批号：960505。肾炎3号口服液由柴胡、黄芩、山茱萸、益母草、白花蛇舌草等组 成，上药按比例称后，水煎，过滤，浓缩至每mL含生药2.5 g，装入瓶中密封，由天津中医 学院第一附属医院药剂室提供。重组IL-1 1×108L-1，LBRM33IA细胞，HT -2细胞由天津医科大学姚智教授提供。
1.2 动物模型及血清的制备[1]： 取大白兔25只。按蒋氏方法行5/6肾切除，术后48 h心脏取血，分离血清，过滤除菌，-2 0 ℃冰箱保存备用。雷公藤片及肾炎3号口服液按成人每日每公斤用量的15倍分2次灌胃，连 续 10 d，于最后1次灌胃后2 h内心脏取血，同时取空白对照血清，余下的处理方法同上。
, http://www.100md.com
1.3 肾小球系膜细胞的培养及鉴定[2]： 无菌取SD大鼠双肾，肾皮质剪成碎片，研磨，分别通过140目、80目、200目筛网，收集肾小 球，胶原酶V消化，完全培养液RPMI 1640悬浮并种植于细胞板内，37 ℃、5%CO2条件下 培养4周左右，系膜细胞布满板底时用胰蛋白酶及EDTA消化并转种，经倒置显微镜及透射电 镜确认为系膜细胞，取第二代细胞用于实验。
1.4 实验分组： ①空白对照组：正常兔血清；②雷公藤组：雷公藤血清；③病模组：促肾因子血清；④观察 组：肾炎3号血清；⑤治疗组：肾炎3号及促肾因子血清。
1.5 肾小球系膜细胞增殖的检测[3]： 系膜细胞以1×104/孔接种于96孔板内，24 h后换成无血清的培养液，继续孵育48 h ，使细 胞同步于静止期，弃上清，然后加入正常兔血清，单纯药物血清，促肾因子血清及含促肾因 子和肾炎3号的血清(均为3%浓度)，再以胎牛血清补齐完全培养液，使血清浓度达10%，37 ℃、5%CO2条件下孵育48 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用滤纸吸干，加入0.5 g /L MTT液50 μL/孔，振荡1 min，37 ℃，5%CO2条件下培养4 h，1 500 r/min，离心5 mi n，弃上清，加入1∶300的盐酸异丙醇振荡3 min，酶标仪上测OD值，波长为570 nm。
, 百拇医药
1.6 含IL-1上清液的制备及检测[3，4]： 系膜细胞以5×108L-1接种于24板内，先以完全培养液培养24 h，再以不含血清的 培养液培 养48 h，使细胞同步于静止期，弃上清，然后加入正常兔血清，单纯药物血清，促肾因子血 清 及含促肾因子和肾炎3号的血清(均为3%浓度)，再加入胎牛血清，使血清浓度达10%，同时设 不加细胞的平行孔，37 ℃，5%CO2条件下培养48 h，收集上清液加入96孔板内。稀释IL- 1原液1/2、1/4、1/8、1/16及待测样品，100 μL/孔，加入1×109L-1 LBRM 33IA 5细胞及400 mg/L PHA，50 μL/孔，混匀，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，将上述各孔 上清 取出100 μL加入另一96孔板内，将1×109L-1 HT-2细胞加入板内，100 μL/孔， 上述条件培养48 h，加入MTT液，余步骤同增殖，绘出标准曲线，求样品IL-1含量。
, 百拇医药
1.7 统计学处理方法： 单因素方差分析法。
2 实验结果
2.1 肾小球系膜细胞增殖的测定： 见表1。
表1 对肾小球系膜细胞增殖的影响 (OD值；
±s) 组 别
n
吸光度值
空白对照组
8
0.388±0.028
雷公藤组
, http://www.100md.com
7
0.309±0.034**
观察组
7
0.296±0.013**
病模组
7
0.434±0.017**
治疗组
7
0.355±0.040△△
, http://www.100md.com
注：与空白对照组比**P<0.01； 与病模组比△△P<0.012.2 IL-1活性的测定： 见表2。
表2 对IL-1活性的影响 (U/mL;±s) 组 别
n
IL-1
空白对照组
7
28.89±2.38
雷公藤组
7
22.14±3.00**
, http://www.100md.com
观察组
7
18.94±3.51**
病模组
7
33.43±2.12**
治疗组
7
17.74±1.22△△
注：与空白对照组比**P<0.01； 与病模组比△△P<0.013 讨论
系膜细胞具有收缩、增殖、吞噬、抗原提呈作用，可以自分泌IL-1等炎症介质，系膜细胞 增殖、炎症介质释放及胞外基质积聚在慢性肾炎发病中起着重要作用[5]：刺激肾 小 球系膜细胞增生，释放中性蛋白酶、前列腺素、活性氧、活性氮，引起肾小球细胞损伤、基 底膜通透性增加，分泌胞外基质，引起肾小球硬化；刺激肾小球脏层上皮细胞增生，合成胶 原以及硫酸类肝素，分泌组织型纤溶酶原抑制剂；刺激血管内皮细胞表达粘附蛋白，促进中 性粒细胞粘附及单核—巨噬细胞粘附，促进凝血。为此探讨肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL -1的抑制因素将可能为慢性肾炎治疗学带来质的突破。
, 百拇医药
雷公藤是临床常用的免疫抑制剂，其对体液免疫和细胞免疫均显示出抑制作用。5/6肾切 除模型可产生促肾因子并明显刺激系膜细胞生长[1]，这样就能从促进和抑制 两个方面观察肾炎3号方对系膜细胞增殖及其分泌IL-1的作用。实验结果表明肾炎3号方对 肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL-1的抑制作用不仅发生于正常大鼠的细胞，而且发生于伴 发促肾因子存在条件的细胞，其抑制作用强于雷公藤。推测肾炎3号方抑制系膜细胞增殖及其分泌IL-1可能通过以下环节：①直接抑制系膜细胞 ，降低IL-1的合成和分泌；②刺激IL-1膜受体脱落，增加可溶性受体数目，中和游离IL- 1活 性；③抑制系膜细胞信号放大及传导，减少IL-1合成。至于详细机理还有待于进一步研究 。
天津科委资助课题
姜德训，男，36岁，医学硕士，主治医师
参 考 文 献
, 百拇医药
1，蒋工伟，陈香美，黎磊石.大黄对体外肾小球系膜细胞生长的影响.中华肾脏 病杂志，1990，6(3)：133～136
2，谌贻璞，高 进，刑宝才，等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报，1989，21(4) ：355～336
3，贾 力，姜新猷，甘卫华.IL-1和IL-6对肾小球系膜细胞炎症效应的作用.南京医科 大学学报，1995，15(2)：289～292
4，汪 谦.现代医学实验方法.北京：人民卫生出版社，1997.480
5，王海燕.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.475～486
(收稿日期：2000-07-11), 百拇医药(姜德训1 黄文政2 杨洪涛2 陈志强2)
单位：姜德训(北京军区总医院 北京100700)；黄文政 杨洪涛2 陈志强2(天津中医学院第一附属医院 天津300192)
关键词：肾炎3号方；肾小球系膜细胞；白细胞介素1；慢性肾炎
北京中医药大学学报000613
摘要：用不同药物喂家兔后取血清加入系膜细胞培养液中观察其增殖及产生IL-1的 水平。结 果：肾炎3号方可显著抑制正常及病理状态下肾小球系膜细胞增殖及其产生IL-1的水平，且 抑制IL-1分泌活性强于雷公藤(P<0.05)。提示肾炎3号方可抑制肾小 球系膜细胞增殖及其 产生IL-1水平，打破以系膜细胞为中心的调节网络，对以系膜增生为主的慢性肾炎有很好 的治疗 作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5
The Effects of Shenyan No.3 on the Multiplication of
Isolated Mesangial Cells and Their IL-1 Level
Jiang Dexun (姜德训), Huang Wenzheng (黄文政), Yang Hongtao (杨洪涛), et al.
(The General Hospital, Beijing Military Region, Beijing 100700)
ABSTRACT: In this experiment, different drugs including Shenyan No.3 (S No .3) were given to the rabbit first, and then the rabbit's serum was separated an d added to into the mesangial cell culture solution; afterwards, an observation on mesangial cell multiplication and mesangial cell IL-1 level was made. The re sults showed that S No.3 could strikingly inhibit mesangial cell multiplication and mesangial cell IL-1 secretion under both normal and pathological conditions (P<0.01), and the inhibiting effect of S No. 3 on mesangial cell IL-1 sec retion was stronger than that of Tripterygium wilfordii (P<0.05). The reults implies t hat S No.3 may have a good effect on the chronic nephritis with mesangial cell proli feration as a main evidence in its pathology.
, 百拇医药
KEY WORDS: Shenyan No.3; Mesangial Cell; Interleukin-1; Chronic Nephritis
1 材料与方法
1.1 实验材料：纯系SD大鼠，雌雄不限，体重150～200 g；纯种大耳白兔，雌雄不限，体重2.0～2 .5 g， 以上动物由国家医药管理局天津药物研究院实验动物室提供。雷公藤片由湖北省黄石市制药 厂提供，批号：960505。肾炎3号口服液由柴胡、黄芩、山茱萸、益母草、白花蛇舌草等组 成，上药按比例称后，水煎，过滤，浓缩至每mL含生药2.5 g，装入瓶中密封，由天津中医 学院第一附属医院药剂室提供。重组IL-1 1×108L-1，LBRM33IA细胞，HT -2细胞由天津医科大学姚智教授提供。
1.2 动物模型及血清的制备[1]： 取大白兔25只。按蒋氏方法行5/6肾切除，术后48 h心脏取血，分离血清，过滤除菌，-2 0 ℃冰箱保存备用。雷公藤片及肾炎3号口服液按成人每日每公斤用量的15倍分2次灌胃，连 续 10 d，于最后1次灌胃后2 h内心脏取血，同时取空白对照血清，余下的处理方法同上。
, http://www.100md.com
1.3 肾小球系膜细胞的培养及鉴定[2]： 无菌取SD大鼠双肾，肾皮质剪成碎片，研磨，分别通过140目、80目、200目筛网，收集肾小 球，胶原酶V消化，完全培养液RPMI 1640悬浮并种植于细胞板内，37 ℃、5%CO2条件下 培养4周左右，系膜细胞布满板底时用胰蛋白酶及EDTA消化并转种，经倒置显微镜及透射电 镜确认为系膜细胞，取第二代细胞用于实验。
1.4 实验分组： ①空白对照组：正常兔血清；②雷公藤组：雷公藤血清；③病模组：促肾因子血清；④观察 组：肾炎3号血清；⑤治疗组：肾炎3号及促肾因子血清。
1.5 肾小球系膜细胞增殖的检测[3]： 系膜细胞以1×104/孔接种于96孔板内，24 h后换成无血清的培养液，继续孵育48 h ，使细 胞同步于静止期，弃上清，然后加入正常兔血清，单纯药物血清，促肾因子血清及含促肾因 子和肾炎3号的血清(均为3%浓度)，再以胎牛血清补齐完全培养液，使血清浓度达10%，37 ℃、5%CO2条件下孵育48 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用滤纸吸干，加入0.5 g /L MTT液50 μL/孔，振荡1 min，37 ℃，5%CO2条件下培养4 h，1 500 r/min，离心5 mi n，弃上清，加入1∶300的盐酸异丙醇振荡3 min，酶标仪上测OD值，波长为570 nm。
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1.6 含IL-1上清液的制备及检测[3，4]： 系膜细胞以5×108L-1接种于24板内，先以完全培养液培养24 h，再以不含血清的 培养液培 养48 h，使细胞同步于静止期，弃上清，然后加入正常兔血清，单纯药物血清，促肾因子血 清 及含促肾因子和肾炎3号的血清(均为3%浓度)，再加入胎牛血清，使血清浓度达10%，同时设 不加细胞的平行孔，37 ℃，5%CO2条件下培养48 h，收集上清液加入96孔板内。稀释IL- 1原液1/2、1/4、1/8、1/16及待测样品，100 μL/孔，加入1×109L-1 LBRM 33IA 5细胞及400 mg/L PHA，50 μL/孔，混匀，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，将上述各孔 上清 取出100 μL加入另一96孔板内，将1×109L-1 HT-2细胞加入板内，100 μL/孔， 上述条件培养48 h，加入MTT液，余步骤同增殖，绘出标准曲线，求样品IL-1含量。
, 百拇医药
1.7 统计学处理方法： 单因素方差分析法。
2 实验结果
2.1 肾小球系膜细胞增殖的测定： 见表1。
表1 对肾小球系膜细胞增殖的影响 (OD值；
±s) 组 别n
吸光度值
空白对照组
8
0.388±0.028
雷公藤组
, http://www.100md.com
7
0.309±0.034**
观察组
7
0.296±0.013**
病模组
7
0.434±0.017**
治疗组
7
0.355±0.040△△
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注：与空白对照组比**P<0.01； 与病模组比△△P<0.012.2 IL-1活性的测定： 见表2。
表2 对IL-1活性的影响 (U/mL;
±s) 组 别n
IL-1
空白对照组
7
28.89±2.38
雷公藤组
7
22.14±3.00**
, http://www.100md.com
观察组
7
18.94±3.51**
病模组
7
33.43±2.12**
治疗组
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17.74±1.22△△
注：与空白对照组比**P<0.01； 与病模组比△△P<0.013 讨论
系膜细胞具有收缩、增殖、吞噬、抗原提呈作用，可以自分泌IL-1等炎症介质，系膜细胞 增殖、炎症介质释放及胞外基质积聚在慢性肾炎发病中起着重要作用[5]：刺激肾 小 球系膜细胞增生，释放中性蛋白酶、前列腺素、活性氧、活性氮，引起肾小球细胞损伤、基 底膜通透性增加，分泌胞外基质，引起肾小球硬化；刺激肾小球脏层上皮细胞增生，合成胶 原以及硫酸类肝素，分泌组织型纤溶酶原抑制剂；刺激血管内皮细胞表达粘附蛋白，促进中 性粒细胞粘附及单核—巨噬细胞粘附，促进凝血。为此探讨肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL -1的抑制因素将可能为慢性肾炎治疗学带来质的突破。
, 百拇医药
雷公藤是临床常用的免疫抑制剂，其对体液免疫和细胞免疫均显示出抑制作用。5/6肾切 除模型可产生促肾因子并明显刺激系膜细胞生长[1]，这样就能从促进和抑制 两个方面观察肾炎3号方对系膜细胞增殖及其分泌IL-1的作用。实验结果表明肾炎3号方对 肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL-1的抑制作用不仅发生于正常大鼠的细胞，而且发生于伴 发促肾因子存在条件的细胞，其抑制作用强于雷公藤。推测肾炎3号方抑制系膜细胞增殖及其分泌IL-1可能通过以下环节：①直接抑制系膜细胞 ，降低IL-1的合成和分泌；②刺激IL-1膜受体脱落，增加可溶性受体数目，中和游离IL- 1活 性；③抑制系膜细胞信号放大及传导，减少IL-1合成。至于详细机理还有待于进一步研究 。
天津科委资助课题
姜德训，男，36岁，医学硕士，主治医师
参 考 文 献
, 百拇医药
1，蒋工伟，陈香美，黎磊石.大黄对体外肾小球系膜细胞生长的影响.中华肾脏 病杂志，1990，6(3)：133～136
2，谌贻璞，高 进，刑宝才，等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报，1989，21(4) ：355～336
3，贾 力，姜新猷，甘卫华.IL-1和IL-6对肾小球系膜细胞炎症效应的作用.南京医科 大学学报，1995，15(2)：289～292
4，汪 谦.现代医学实验方法.北京：人民卫生出版社，1997.480
5，王海燕.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.475～486
(收稿日期：2000-07-11), 百拇医药(姜德训1 黄文政2 杨洪涛2 陈志强2)