高效液相色谱-蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲甙的含量
作者：周春玲 鲁静
单位：周春玲(辽宁省药品检验所，辽宁 沈阳 110023)；鲁静(中国药品生物制品检定所,北京 100050)
关键词：黄芪；黄芪甲甙；高效液相色谱-蒸发光散射检测
中国中药杂志000314 摘 要：目的：建立测定黄芪中黄芪甲甙含量的新方法。方法：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定。结果：黄芪甲甙在2.02～10.12 μg与峰面积积分值呈良好的线性(r=0.9997,n=5)，平均回收率为100.5%。结论：为控制黄芪中黄芪甲甙的含量提供了新的方法。
Determination of Astragaloside Ⅳ in Radix Astragali by HPLC
with Evaporative Light Scattering Detector
, http://www.100md.com
ZHOU Chun-ling
(Liaoning Provincial Institute for Drug Control,Shenyang 110023,Liaoling，China)
LU Jing
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract：Objective:To develop a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali.Method:A HPLC-ELSD method was set up,using Hypersil C18 column (150 mm×4.6 mm),acetonitrile-water(1∶2) as mobile phase with a flow rate of 1.0 ml.min-1.The parameters of drift tube and gas flow rate of the detector were set at 105 ℃ and 2.96 L.min-1 respectively.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.02～10.12 μg.The average recovery was 100.5%.Conclusion:The active constituent astragaloside Ⅳ in Radix Astragali can be separated effectively.ELSD detection is appropriate for the determination of constituents with end absorption at low ultra-violet wavelengths.
, 百拇医药
Key words：Radix Astragali;astragaloside Ⅳ;HPLC-ELSD▲
黄芪为重要的益气中药，味甘，性温，有补气固表，利尿，托毒，排脓，敛疮，生肌等功效[1]。我国药典规定以豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根供药用。研究表明黄芪甲甙为黄芪中的主要有效成分。迄今为止，测定黄芪甲甙的方法主要有薄层扫描法[2]，比色法[3]，高效液相色谱法[4]。其中高效液相色谱法灵敏度较高，但因低波长紫外检测时，溶剂背景难以消除。本文试用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了黄芪中黄芪甲甙的含量。
1 仪器与试剂
, 百拇医药
LC-6A型高效液相色谱泵(日本岛津)，ELSD-500检测器(美国Alltech公司)，GCK3302全自动空气源(北京惠普)，3295积分仪(上海惠普)。
乙腈(色谱纯，天津三达生物医学工程有限公司)，其它试剂为分析纯，水为蒸馏水。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所)，黄芪药材(中国药品生物制品检定所标本馆)的拉丁学名见表2。
2 色谱条件
色谱柱 Hypersil，5 μm(4.6 mm×150 mm)，流动相 乙腈-水(1∶2)，室温，流速 1.0 ml.min-1。
3 供试品溶液的制备
本品粗粉约1.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 ml冷浸过夜，再加甲醇适量，回流4 h，提取液蒸干，残渣加水10 ml微热使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨试液洗2次，每次20 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，放冷，通过D101大孔吸附树脂柱(1.5 cm×12cm)，50 ml水洗脱，再40%乙醇30 ml洗脱，继70%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中，滤过，为供试品溶液。对照品及各样品色谱图见图1。
, 百拇医药
图1 对照品及不同种黄芪样品的HPLC色谱图
A.对照品 B.A. mongholicus C.A. membranaceus D.A. floridus E.A. chrysopterus F.A. mongholicus(紫外检测器) a.黄芪甲甙
4 线性关系的考察
精密称定黄芪甲甙对照品10.12 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，精密吸取2，4，6，8，10 μl进样，以进样量(自然对数)为横坐标，峰面积积分值(自然对数)为纵坐标，线性回归方程为Y=1.3943X+12.1417,r=0.9997，进样量在2.02～10.12 μg呈良好的线性关系。
5 精密度实验
精密吸取同一份样品10 μl，重复进样6次，RSD=1.4%。
, 百拇医药
6 重现性实验
同一份样品按制备方法平行制备5份，含量平均值为0.78mg.g-1，RSD=2.0%。
7 回收率实验
精密称定已知含量的样品约0.75 g，精密加入黄芪甲甙对照品溶液20 ml(0.02854mg.ml-1)，按供试品制备方法制备样品，测定，结果见表1。
表1 回收率测定结果 样品量
mg
测得量
mg
回收率
, 百拇医药
%
x
%
RSD
%
0.5911
1.1841
103.9
0.5881
1.1512
98.7
0.5885
1.1611
, http://www.100md.com
100.3
100.5
3.23
0.6134
1.1619
96.1
0.6065
1.1964
103.3
注:加入量为0.5708 mg
8 样品测定
5个不同植物种的样品，测定结果见表2。
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表2 样品测定结果 mg.g-1 样品
产地或规格
含量
蒙古黄芪A. mongholicus
山西冲正芪
0.67
蒙古黄芪A. mongholicus
张家口
0.47
蒙古黄芪A. mongholicus
陕西
, 百拇医药
0.28
蒙古黄芪A. mongholicus
山西
0.78
蒙古黄芪A. mongholicus
日本
0.17
膜荚黄芪A. membranaceus
黑龙江
0.56
多花黄芪A. floridus
四川
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0.93
金翼黄芪A. chrysopterus
四川
0.99
9 讨论
9.1 曾试验了甲醇-水(40∶60)，四氢呋喃-水(25∶75)及乙腈-水(1∶2)等不同流动相，考察黄芪中各成分的分离情况及检测灵敏度，结果表明，采用乙腈-水(1∶2)为流动相时，分离情况良好。
9.2 按流动相的成分和比例，最初设定漂移管温度为100 ℃，气体流速为2.70 L*min-1通过观察基线噪音和信噪比，确定漂移管温度为105 ℃，气体流速为2.96 L*min-1为最佳的实验条件。
, 百拇医药
9.3 实验中尝试供试品溶液制备不经大孔树脂柱处理，但与经大孔树脂柱处理后得到的供试品比较,峰形及样品含量均不及后者，因此柱纯化是必要的。
9.4 同一植物种不同产地的黄芪中黄芪甲甙含量存在着显著差异，可能与不同生长条件及炮制方法有关。不同植物种皂甙类成分色谱存在着差别(见图1)。
9.5 蒸发光散射检测(ELSD)[5]不受流动相溶剂的干扰，对黄芪甲甙类等具紫外末端吸收的物质,检测效果很好。相同色谱条件用紫外检测器测得图谱见图1中F。
参考文献：
[1]中国药典.1995.271.
[2]鲁 静，王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1992，14(6)：34.
[3]陆一心.黄芪甲甙定量方法的研究.中成药，1996，18(2)：38.
[4]付铁军，李伯刚，及元乔，等.高效液相色谱法测定黄芪注射液中黄芪甲甙的含量.天然产物的研究与开发，1997，9(4)：53.
[5]冯埃生，邹汉法，汪海林，等.高效液相色谱-挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察.药物分析杂志，1996，16(6)：414.
收稿日期：1999-03-01, 百拇医药
单位：周春玲(辽宁省药品检验所，辽宁 沈阳 110023)；鲁静(中国药品生物制品检定所,北京 100050)
关键词：黄芪；黄芪甲甙；高效液相色谱-蒸发光散射检测
中国中药杂志000314 摘 要：目的：建立测定黄芪中黄芪甲甙含量的新方法。方法：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定。结果：黄芪甲甙在2.02～10.12 μg与峰面积积分值呈良好的线性(r=0.9997,n=5)，平均回收率为100.5%。结论：为控制黄芪中黄芪甲甙的含量提供了新的方法。
Determination of Astragaloside Ⅳ in Radix Astragali by HPLC
with Evaporative Light Scattering Detector
, http://www.100md.com
ZHOU Chun-ling
(Liaoning Provincial Institute for Drug Control,Shenyang 110023,Liaoling，China)
LU Jing
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract：Objective:To develop a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali.Method:A HPLC-ELSD method was set up,using Hypersil C18 column (150 mm×4.6 mm),acetonitrile-water(1∶2) as mobile phase with a flow rate of 1.0 ml.min-1.The parameters of drift tube and gas flow rate of the detector were set at 105 ℃ and 2.96 L.min-1 respectively.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.02～10.12 μg.The average recovery was 100.5%.Conclusion:The active constituent astragaloside Ⅳ in Radix Astragali can be separated effectively.ELSD detection is appropriate for the determination of constituents with end absorption at low ultra-violet wavelengths.
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Key words：Radix Astragali;astragaloside Ⅳ;HPLC-ELSD▲
黄芪为重要的益气中药，味甘，性温，有补气固表，利尿，托毒，排脓，敛疮，生肌等功效[1]。我国药典规定以豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根供药用。研究表明黄芪甲甙为黄芪中的主要有效成分。迄今为止，测定黄芪甲甙的方法主要有薄层扫描法[2]，比色法[3]，高效液相色谱法[4]。其中高效液相色谱法灵敏度较高，但因低波长紫外检测时，溶剂背景难以消除。本文试用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了黄芪中黄芪甲甙的含量。
1 仪器与试剂
, 百拇医药
LC-6A型高效液相色谱泵(日本岛津)，ELSD-500检测器(美国Alltech公司)，GCK3302全自动空气源(北京惠普)，3295积分仪(上海惠普)。
乙腈(色谱纯，天津三达生物医学工程有限公司)，其它试剂为分析纯，水为蒸馏水。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所)，黄芪药材(中国药品生物制品检定所标本馆)的拉丁学名见表2。
2 色谱条件
色谱柱 Hypersil，5 μm(4.6 mm×150 mm)，流动相 乙腈-水(1∶2)，室温，流速 1.0 ml.min-1。
3 供试品溶液的制备
本品粗粉约1.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 ml冷浸过夜，再加甲醇适量，回流4 h，提取液蒸干，残渣加水10 ml微热使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨试液洗2次，每次20 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，放冷，通过D101大孔吸附树脂柱(1.5 cm×12cm)，50 ml水洗脱，再40%乙醇30 ml洗脱，继70%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中，滤过，为供试品溶液。对照品及各样品色谱图见图1。
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图1 对照品及不同种黄芪样品的HPLC色谱图
A.对照品 B.A. mongholicus C.A. membranaceus D.A. floridus E.A. chrysopterus F.A. mongholicus(紫外检测器) a.黄芪甲甙
4 线性关系的考察
精密称定黄芪甲甙对照品10.12 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，精密吸取2，4，6，8，10 μl进样，以进样量(自然对数)为横坐标，峰面积积分值(自然对数)为纵坐标，线性回归方程为Y=1.3943X+12.1417,r=0.9997，进样量在2.02～10.12 μg呈良好的线性关系。
5 精密度实验
精密吸取同一份样品10 μl，重复进样6次，RSD=1.4%。
, 百拇医药
6 重现性实验
同一份样品按制备方法平行制备5份，含量平均值为0.78mg.g-1，RSD=2.0%。
7 回收率实验
精密称定已知含量的样品约0.75 g，精密加入黄芪甲甙对照品溶液20 ml(0.02854mg.ml-1)，按供试品制备方法制备样品，测定，结果见表1。
表1 回收率测定结果 样品量
mg
测得量
mg
回收率
, 百拇医药
%
x
%
RSD
%
0.5911
1.1841
103.9
0.5881
1.1512
98.7
0.5885
1.1611
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100.3
100.5
3.23
0.6134
1.1619
96.1
0.6065
1.1964
103.3
注:加入量为0.5708 mg
8 样品测定
5个不同植物种的样品，测定结果见表2。
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表2 样品测定结果 mg.g-1 样品
产地或规格
含量
蒙古黄芪A. mongholicus
山西冲正芪
0.67
蒙古黄芪A. mongholicus
张家口
0.47
蒙古黄芪A. mongholicus
陕西
, 百拇医药
0.28
蒙古黄芪A. mongholicus
山西
0.78
蒙古黄芪A. mongholicus
日本
0.17
膜荚黄芪A. membranaceus
黑龙江
0.56
多花黄芪A. floridus
四川
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0.93
金翼黄芪A. chrysopterus
四川
0.99
9 讨论
9.1 曾试验了甲醇-水(40∶60)，四氢呋喃-水(25∶75)及乙腈-水(1∶2)等不同流动相，考察黄芪中各成分的分离情况及检测灵敏度，结果表明，采用乙腈-水(1∶2)为流动相时，分离情况良好。
9.2 按流动相的成分和比例，最初设定漂移管温度为100 ℃，气体流速为2.70 L*min-1通过观察基线噪音和信噪比，确定漂移管温度为105 ℃，气体流速为2.96 L*min-1为最佳的实验条件。
, 百拇医药
9.3 实验中尝试供试品溶液制备不经大孔树脂柱处理，但与经大孔树脂柱处理后得到的供试品比较,峰形及样品含量均不及后者，因此柱纯化是必要的。
9.4 同一植物种不同产地的黄芪中黄芪甲甙含量存在着显著差异，可能与不同生长条件及炮制方法有关。不同植物种皂甙类成分色谱存在着差别(见图1)。
9.5 蒸发光散射检测(ELSD)[5]不受流动相溶剂的干扰，对黄芪甲甙类等具紫外末端吸收的物质,检测效果很好。相同色谱条件用紫外检测器测得图谱见图1中F。
参考文献：
[1]中国药典.1995.271.
[2]鲁 静，王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药，1992，14(6)：34.
[3]陆一心.黄芪甲甙定量方法的研究.中成药，1996，18(2)：38.
[4]付铁军，李伯刚，及元乔，等.高效液相色谱法测定黄芪注射液中黄芪甲甙的含量.天然产物的研究与开发，1997，9(4)：53.
[5]冯埃生，邹汉法，汪海林，等.高效液相色谱-挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察.药物分析杂志，1996，16(6)：414.
收稿日期：1999-03-01, 百拇医药