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编号:10278466
大鼠原位肝移植后微循环障碍及前列腺素E1对其保护作用的实验研究
http://www.100md.com 《中华肝胆外科杂志》 1998年第3期
     作者:刘浩 王立明 刘永锋 宋今丹 黄集前 何三光

    单位:110001沈阳,中国医科大学第一临床学院普外一科暨器官移植科(刘浩、王立明、刘永峰、何三光);中国医科大学细胞生物教研室(宋今丹、黄集前)

    关键词:PGE1;肝移植;微循环

    中华肝胆外科杂志/980309.htm 【摘要】 目的 研究大鼠肝脏微循环变化及PGE1对其的作用,同时观察血清酶ALT、LDH变化及超微结构变化。方法 通过供肝切取前静脉输注前列腺素E1(PGE1)(0.5μg/kg/min)及灌洗保存液中加入PGE1(1mg/L),以三袖套法建立大鼠原位肝移植模型,共焦激光扫描活体显微镜技术,生化检测技术、透射电镜技术。结果 1.移植再灌注后,鼠肝微循环紊乱,部分小叶无灌注,肝窦内可见大量白细胞粘附;实验组则好于对照组;实验组灌注指数及灌流率分别高于对照组(P<0.05)。2.移植后血清ALT、LDH升高, 实验组较对照组有明显降低。(P<0.05)。3.实验组电镜下的形态学改变明显轻于对照组。结论 肝移植过程中,缺血再灌注损伤可造成肝脏微循环紊乱,是供肝失活的一个重要原因。供体肝脏切取前静脉应用PGE1及灌洗保存液中加入 PGE1能改善肝脏微循环,减轻缺血再灌注损伤,对供肝有保护作用。
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    Experimental research on rat liver microcirculation disturbance following orthotopic liver transplantation and the protective effect of PGE1 Liu Hao, Wang Liming, Liu Yongfeng, et al. Organ Transplantation Unit, 1st University Hospital, China Medical University, Shenyang 110001.

    【Abstract】 Objective To determine the effect of PGE1 on the liver microcirculation disturbance following orthotopic liver transplantation in rats. Methods PGE1 was injected intravenously to donors before removal of the liver at a dosage of 0.5μg/kg body weight/min as well as adding into the flushout and preservation fluid at a concentration of 1mg/L. Confocal laser scan microscopy, biochemical tests, and electron microscopy were used. Results The reperfusion state of the control group was poor and leukocyte infiltration appeared in the center of lobule following transplantation. Transaminase rose up after transplantation. Ultrastructural findings showed progressive degeneration and necrosis occurred following transplantaion. Distinctive improvement could be seen in the experimental group as compared with the control group by the use of PGE1. Conclusion In the process of liver transplantation, the ischemia reperfusion damage may lead to hepatic microcirculation disturbance, which is a major cause of graft failure. Intravenous infusion of PGE1 into donor liver preischemia and adding PGE1 into the cold storage fluid could improve the hepatic microcirculation,leading to reduction of the ischemic reperfusion damage, therefore, are protective in liver transplantation.
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    【Key words】 PGE1 Liver transplantation Microcirculation

    肝脏移植过程中缺血再灌注损伤引起肝脏微循环紊乱可能是供肝失活的一个重要原因。本实验应用大鼠肝脏原位移植模型,探讨前列腺素E1(PGE1)对肝脏移植后微循环的作用,及其对血清酶学、移植肝组织学及超微结构的影响。

    材料与方法

    1.材料 40只雄性Wista大鼠,体重150~300 g,随机编号分为三组:实验组和对照组各做成8只肝移植模型。对照组供体术前30分钟经阴茎背静脉注射生理盐水1.25 ml/kg体重。供肝切取后,用20 ml冷CMU-1号液(自制仿Euro-Collins液)灌洗,然后4℃CMU-1号液中保存6小时,行受体原位肝移植。实验组供体术前30分钟阴茎背静脉注射PGE1(0.5 μg/kg/min)。灌洗及保存液用CMU-1号液+PGE1(1mg/L)。假手术组:做成8只假移植手术模型。手术同肝移植受体的肝脏游离,只是不做肝切除。目的是作一个正常对照,以排除手术因素或肝动脉结扎对微循环的影响。肝移植模型的建立采用Miyata的三袖套法。
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    2.方法 血流开放后5分钟经腹壁静脉注射荧光标记物吖啶橙(SIGMA)(0.001ml/g体重,0.01%)。将肝左叶置固定台上,应用共焦激光扫描显微镜(CLSM)检测活体肝脏微循环状态。随机选取肝左叶30个部位进行扫描观察及储存图像。根据肝细胞对吖啶橙摄取、分布及肝窦灌注状态,将肝脏灌注状态分为三级:灌注良好(均匀染色);不规则灌注(斑片状染色);没有灌注(无染色)。计算出灌注指数(perfusion index PI)如下:

    公式1:灌注指数=(灌注良好部位数+0.5×不规则灌注部位数)/总数〔1〕

    利用图像分析技术,对每个肝脏所扫描的30个图像进行荧光灰度面积分析,将灰度基数定为50计算出肝脏灌流率(Perfusion Percentage PP)如下:

    公式2:
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    血流开放后1小时,取下腔静脉血2ml,7150自动生化分析仪检测血清酶学LDH、ALT。取肝尾叶电镜标本,于透射电子显微镜下观察。

    3.数据处理

    所得数据以(±S)形式表示,Student检验,进行分析。

    结 果

    1.微循环变化

    假手术组(图1):肝小叶的微循环结构,肝窦、肝细胞索清晰可见,肝脏灌流状态良好。右侧方显示两个小叶中心静脉,左下方有一荧光摄取较多的发亮区,为小叶输入血管系统(门静脉或肝动脉)左上方为一条肝窦后静脉。移植再灌注后,对照组(图2):部分小叶无灌注,肝窦紊乱、中断,肝窦内可见大量白细胞粘附(白色荧光亮点同一扫描平面连续扫描15秒无移动)。实验组(图3)大部分小叶灌注较充分,肝窦明显扩张较连续,肝窦内未见白细胞粘附。各组灌注指数及灌流率分别见表1。
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    图1 正常大鼠肝脏微循环情况(CLSM)

    图2 移植后对照组大鼠肝脏微循环变化

    图3 移植后实验组大鼠肝脏微循环变化

    表1 各组灌注指数及灌流率 组别

    例数

    灌注指数

    灌流率%

    假手术组

    8
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    0.962±0.112*

    94.3±3.35*

    对照组

    8

    0.552±0.126

    56.7±8.18

    实验组

    8

    0.681±0.150**

    68.7±9.02#**

    注:* P<0.005 ** P<0.01 # P<0.05 2.血清酶学变化
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    各组血清ALT、LDH值分别见表2。

    表2 各组血清ALT、LDH值 组 别

    例数

    ALT(IU/L)

    LDH(IU/L)

    假手术组

    8

    34.2± 3.4*

    298.0± 37.5*

    对照组

    8
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    365.4±70.1

    2278.3±300.5

    实验组

    8

    267.0±40.0*

    1750.0±260.5*

    注:* P<0.005 3.肝脏超微结构变化

    假手术组(图4):肝细胞基本正常,偶见内质网轻度扩张;对照组:肝细胞线粒体肿胀明显,基质变淡,部分嵴破坏、结构紊乱。(图5):细胞内有少量溶酶体,可见次级溶酶体;SLC细胞肿胀变性,坏死脱落于窦腔内,肝窦内可见大泡形成。实验组(图6):仅见肝细胞线粒体轻度肿胀,基质稍淡,偶可见嵴减少,无嵴紊乱及消失现象,有的可见内质网轻度扩张;无溶酶体增多。(图7):SLC轻度肿胀,未发生脱落阻塞肝窦现象,肝窦内无大泡形成。
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    图4 移植对照组电镜照片示线粒体变性 ×8000

    图5 移植对照组电镜照片示SLC变性,肝窦内大泡形成 ×8000

    图6 移植实验组电镜照片线料体变性较轻 ×8000

    图7 移植实验组电镜照片SLC轻度变性 ×5000

    讨 论

    1.大鼠肝脏移植后微循环紊乱

    应用CLSM观察移植再灌注后,大鼠肝脏PI、PP较假手术组显著降低,微循环明显紊乱。说明肝脏微循环受到了缺血再灌注损伤,这种损伤原因可能与下列因素有关:
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    (1)细胞肿胀压迫微血管:缺血后,细胞内贮存的能量很快耗尽;代谢产物堆积,细胞内酸中毒引起细胞膜通透性增加;细胞膜Na+-K+ ATP酶由于失去底物而不能运转,导致Cl-、H2O内流而引起细胞水肿。

    (2)SLC损伤:缺血再灌注后,细胞内钙离子超载激活蛋白酶导致氧自由基的大量产生,主要损伤SLC细胞。SLC是肝脏微循环的主要组成细胞,有观点认为肝移植后一个最危险的并发症—原发性无功能与SLC损伤有关。本实验病理观察发现移植再灌注后SLC肿胀变性,向肝窦内伸出造成管腔狭窄,甚至坏死、脱落于肝窦内堵塞肝窦,从而损害了微循环的完整性及连续性。

    (3)白细胞粘附:本实验CLSM观察发现移植后,肝窦内可见大量白细胞粘附。缺血再灌注激活枯否氏细胞及SLC,细胞表面细胞粘附分子过表达,同时细胞膜磷脂降解,花生四烯酸代谢产物增多,趋化吸引大量白细胞浸润并粘附于SLC。粘附的白细胞嵌顿、阻塞毛细血管,同时释放大量炎性介质白介素、肿瘤坏死因子、氧自由基等损伤组织。
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    (4)微血栓形成:缺血缺氧时,花生四烯酸代谢产物比例失衡:一方面SLC损伤引起前列腺素I2产生减少,一方面使血小板释放血栓素A2(TXA2)增多,因而发生强烈的血管收缩和血小板的聚集〔2〕

    (5)微血管收缩:除TXA2增多因素,低温灌洗液、保存液形成的寒冷刺激也可以造成微血管的收缩,是微循环灌注不良的一个因素。

    这些因素造成了肝脏缺血再灌注后的“无复流现象”,从而进一步加重缺血损伤。这种损伤达到一定程度后,细胞内溶酶体膜的稳定性下降,溶酶体酶释放,降解细胞成分,细胞结构进行性损害,导致供肝失活。本实验中电镜观察发现移植后细胞内溶酶体增多,同时肝脏酶学检测发现转氨酶ALT、LDH显著升高,都反应了肝细胞的进行性变性坏死的发生。

    2.PGE1对鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用
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    本实验通过在供体取肝前静脉给予PGE1及将PGE1加入保存液中观察移植再灌后鼠肝微循环情况,发现PI、PP均较对照组有明显提高,微循环得到了显著改善;同时酶学检查有相应程度的好转;病理观察也发现组织损伤明显减轻,说明了PGE1对鼠肝缺血再灌注损伤具有保护作用。这种保护作用可能缘于其丰富的生理作用。

    (1)强效扩张血管,改善微循环作用:E族PG可直接作用于血管平滑肌,有强效的血管扩张作用,它们还可减低血管平滑肌对血管收缩物质的敏感性〔3,4〕。本实验CLSM见到应用PGE1后,肝窦明显扩张,从而增加了肝脏血流量。

    (2)防止微血栓形成:PGE1可激活腺苷酸环化酶(AC)-环磷酸腺苷(CAMP)系统,抑制血小板聚集,减少TXA2产生防止微血栓的形成〔5〕
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    (3)细胞保护作用:PGE1可以通过激活ACCAMP系统,增高细胞内CAMP,促进钙离子外流,通过调节细胞内钙稳定而保护线粒体功能及细胞膜,从而一方面保存细胞能量代谢,另一方面减少毒性氧自由基的产生〔6,7〕。大量的研究表明PGE1对暴发性肝衰及肝移植术后原发性无功能的治疗作用,其机理主要归源于其细胞保护作用。本实验电镜下细胞内线粒体变性改善,SLC细胞坏死脱落现象减少,同时酶学检查也发现了相应程度的改善,从而证明了PGE1的细胞保护作用。

    (4)减轻细胞水肿:升高的CAMP还可促进NA+的主动转运从而减少细胞水肿〔8,9〕。本实验病理观察证实应用PGE1后,细胞水肿的确得到了改善。

    (5)其它:PGE1还可以抑制白细胞粘附,从而减少各种细胞因子介导的损伤;稳定溶酶体膜抑制溶酶释放,这些酶可以引起细胞膜不可逆的损伤及血管阻力的增加。
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    参 考 文 献

    1Post T, Renlsch M, Gonzalez AP, et al. Effects of Carolina rinse and adenosine rinse on interaction after Liver transplantation in the rat. Transplantation, 1993, 55(5):972.

    2Post S, Goerig M, Ollo G, et al. Prostanoid release in experimental liver transplantation. Transplantation, 1990, 49(3): 490-4.

    3Xu HS, Rosenlof LK,Pruett TL, et al. Prostaglandin E1 increases survival with extended an hepatic phase during liver transplantation. Annals of surgery, 1994, 220(1):53-8.
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    4Tojimbara T, Ohsaki S, Teraoka S, et al. Effects of prostaglandin E1 on transplantated kidneys in dogs by laser doppler blood perfusion monitor. Transplantation. Proceedings. 1992, 24(4): 1349.

    5Himmelreich G, Hundt K, Neuheus P,e t al. Evidence that intraoperative prostaglandin E infusion reduces impaired platelet aggregation after reperfusion in orthotopic liver transplantation. Transplantation, 1993, 55(4): 819-26.

    6Othoff KM, Wasef E, Seu P, et al. PGE1 reduces injury in hepatic allografts following preservation. Journal of surgical research, 1991, 50(6):595-601.
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    7Ueda Y, Matsuo K, Kamei T. PGE1 but not PGE2 is cytoprotective of energy metabolism and reliculoendothelial function in the ischemic canine liver. Transplantation proceedings, 1987, (19)1:1329-1330.

    8Higgins RS, letsou GV, Sanchez JA, et al. Improved ultrastructural lung preservation with Prostaglandin E1 as donor pretreatment in a primate model of heart lung transplantions. Journal of Thor & Cardio Surg, 1993, 105(6):965.

    9Ueno T, Horita K, Okazaki Y, et al. The effect of Prostaglandin E1 on heart preservation. Transplantation, 1992, 54(3):418-22.

    10黄集前,宋今丹. 共焦激光扫描显微技术在生物医学中的应用. 解剖学进展,1995,1(3):250-258.

    (收稿:1997-12-18), http://www.100md.com