肝部分切除术后肝细胞DNA合成及细胞周期变化的实验研究
作者：陈平 韩本立 陈娟 段恒春
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科
关键词：肝再生；肝切除术；DNA；细胞周期
中华肝胆外科杂志/980307.htm 【摘要】 目的 本文探讨大鼠肝切除术后肝细胞再生时DNA的合成、细胞的增殖周期及增殖系数的变化。方法 采用大鼠部分肝切除模型，体外培养肝细胞，观察术后一周内大鼠肝细胞DNA合成和细胞周期的变化。结果 术后残肝逐渐长大，一周时达到高峰，但在术后48小时内，增长速度较慢。肝细胞DNA合成和增殖系数在后术24小时内增长较快，且在24小时点达到高峰，以后缓慢下降。结论 肝部分切除术后肝细胞的再生可分为三个时期，这种分期观点对如何防止术后肝衰及降低死亡率具有重要意义。
The changes in DNA synthesis and cell cycle of hepatocytes after parital hepatectomy Chen Ping, Han Benli, Chen Juan, et al. Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objecive To probe the changes in DNA synthesis, cell growth cycle and regeneration index during hepatocyte regeneration after parital hepatectomy in rats. Methods The rat model of post partial hepatectomy was used. The rat hepatocytes were cultured in vitro and DNA synthesis and cell cycle changes were studies 1 week after operation. Results The remnant liver enlarged gradually and the growth peak was 7 days after operation, but the growth of remnant liver in the first 2 days was much slower than 2 days after operation. The hepatocyte DNA synthesis and regeneration index had more rapid increase in the first 24 hours postoperation, with the peak at 24 hours after hepatectomy, and then decreased gradually. Conclusion The liver regeneration after partial hepatectomy can be devided into three periods. This study suggests that using the theroy of liver regeneration it would be of importance in preventing liver failure and decreasing post-hepatectomy mortality.
, 百拇医药
【Key words】 Liver regeneration Partial hepatectomy DNA Cell cycle
肝部分切除术是肝胆外科常见的术式，肝脏再生是术后最基本的病理过程。但目前对再生肝细胞动态研究较少，特别是其DNA合成功能及细胞周期等的变化尚不清楚，对肝再生启动的机制国内外学者分歧较大。本试验通过复制大鼠部分肝切除模型，试图动态观察再生肝细胞变化规律，进一步探讨肝脏再生的机制。
材料和方法
1.实验动物分组及模型制作：健康的雄性Wistar大鼠，重220～250g，随机分为肝部分切除术组(PH)和假手术组(SO)。肝叶切除的动物模型采用由Goss介绍的Higgin创建的方法〔1〕，即大鼠在乙醚麻醉下，腹部正中切口入腹，切除大鼠肝脏的左叶和中叶(切除量为全肝的70%)，所有的模型制作是在上午8∶00～9∶00之间进行。SO组方法同上，但不切除肝脏，即正常对照组。手术后腹腔内注射5%GS 5ml。观察时相为大鼠术后0、6、24、48、72小时及一周。
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2.肝细胞的分离与培养：采用Seglen的方法〔2〕，简言之，到时相点的动物乙醚麻醉，门静脉游离插管，向肝内均匀灌注Hank液，同时剪开下腔静脉。然后再向肝内均匀灌注0.05%胶原酶。切除肝脏，将肝脏剪碎，37℃水浴箱内孵育5分钟后，将肝细胞悬液离心(50 g)5分钟，取沉淀的肝细胞，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，细胞浓度为1×105/ml，放入5% CO2孵箱内孵育。24小时后，取出培养的肝细胞，用0.1M的PBS液洗涤两次，调整细胞浓度为1×106/ml，用70%的酒精固定，放入4℃冰箱待测。
3. 流式细胞仪测定细胞周期、DNA含量：将送检样本送往第三军医大学中心实验室测定，(流式细胞仪为美国的Becton Dickinson公司制造，型号为FAC Star-Plus)。采用丫啶橙(AO)一步染色法处理法，使AO分子与核酸结合，分别在530NM波长下用流式细胞仪测定DNA含量和细胞周期的变化。
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统计学处理：资料表达采用
±SD，采用方差分析，t检验，以P<0.05为差异显著。
结 果
1.肝部分切除术后残肝重量的变化：见图1，从图中可以看出，残肝逐渐长大，在48小时内，增长速度较慢。术后3～7天增长速度明显加快，一周时达到高峰，为10.0±0.3g。相当于未切肝时(SO组)肝脏的重量。SO组肝脏重量为9.2±0.4g(两组肝脏重量均含灌注液)，与PH组术后一周点比较差异不明显。
图1 肝切除术后一周残肝重量的变化
2.肝切除术后残肝细胞增殖系数的变化：见图2。从图中可以看出，肝细胞增殖系数在24小时内增长最快，且在24小时点达到高峰，以后呈缓慢下降的趋势。术后6、24和48小时与术后一周比较，均差异显著。
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3.肝切除术后残肝细胞DNA含量的变化：见图3。从图中可以看出，肝细胞G2期和M期DNA含量的变化，是与其增殖系数的变化一致的。肝细胞DNA合成的高峰是在术后24小时点，以后其DNA合成功能逐渐下降，到一周时其细胞的DNA含量降至0时相点的水平，说明肝细胞的再生主要发生在术后一周。特别是在术后3天以内，是肝细胞DNA合成的关键时期。
图2 肝切除术后残肝细胞增殖系数的变化
图3 肝切除术后一周内残肝细胞G2期和M期DNA含量的变化
讨 论
1.关于肝部分切除动物模型：自1933年Higgins和Anderson制作了肝叶部分切除动物模型以来，人们对肝再生进行了广泛研究。采用70%左右的肝切除动物模型(即切除大鼠的左肝和中肝)，具有以下优点：①由于切除的是完整的肝叶，因此结扎线处没有过多的残留组织，创面小，不易感染和出现胆瘘炎症反应较轻；②如果肝切除量大于70%，则易发生肝衰，动物死亡率明显增高，据报道为30%～50%。但此模型死亡率小于5%。因此模型比较稳定。③如果肝切除量小于60%，则对肝再生的诱导差，细胞周期和DNA的变化不明显，不利于研究的进行。因此，目前对肝再生的研究多采用此模型。
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2.肝部分切除术后肝细胞再生规律：从我们的研究可以看出，肝细胞再生大致可以分为三个时期，即肝细胞再生的启动，DNA的大量合成和肝细胞的大量分裂增殖期。在术后48小时内，残肝的重量增加不明显，肝细胞DNA合成不活跃，肝细胞的增殖系数相对较低。这说明肝细胞再生处于启动状态。在枯否氏细胞等分泌的细胞因子和内分泌激素的作用之下，肝细胞再生可迅速被启动。48小时后，残肝的重量增加较快，以3～7天时增长最为显著。这个变化与再生肝细胞的DNA变化一致。从图2可以看出，再生肝细胞的DNA的变化以48、72小时点变化最明显，再生肝细胞的增殖系数也是在这两点达到最高峰，这说明肝细胞的再生在48～72小时时，是肝细胞增殖最活跃的时期，主要表现在DNA的合成上。而72小时至一周时，残肝体积增长迅速，重量明显增加，一周时基本上已恢复到术前水平，这说明肝细胞的再生在这一时期内，以细胞的分裂增殖为主。但是，这三个时期不是截然划分的，相互之间有所重叠，但其主要的变化与这个划分是一致的。
3.从肝切除术后肝细胞再生规律探讨肝衰的发生：从我们以往的实验中可以看到，70%或>70%的大鼠肝切除术后，其死亡的原因多是术后肝衰所致，死亡的时间多在术后三天以内，这与我们提出的肝细胞再生的规律一致。从上面的讨论可看到，肝细胞再生的启动和G2期M期大量DNA的合成主要在术后前三天，一旦肝细胞进入S期，大量、快速地分裂增殖，则肝脏的功能可迅速地恢复，动物的死亡率明显下降。因此，我们认为，要降低肝部分切除术后肝衰，就应当让迅速启动肝细胞的再生，促使G2期和M期的肝细胞大量合成DNA，即尽量缩短肝细胞再生的前两期的时间，使肝细胞能尽快进入S期大量分裂增殖。这样可望降低由肝细胞功能衰竭引起的死亡率。
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注：本课题由国家自然科学基金资助(39670712)
参 考 文 献
1Goss JA, Mangino MJ, Callery, et al. Postaglandin E2 downregulates Kupffer cell production of IL-1 and IL-6 during hepatic regeneration. Am Physio Soci, 1993, G601-608.
2Sgelen G. Preparation of isolated liver cells. Methods in cell biology, 1976, 13:30-6.
(收稿：1998-01-18), http://www.100md.com
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科
关键词：肝再生；肝切除术；DNA；细胞周期
中华肝胆外科杂志/980307.htm 【摘要】 目的 本文探讨大鼠肝切除术后肝细胞再生时DNA的合成、细胞的增殖周期及增殖系数的变化。方法 采用大鼠部分肝切除模型，体外培养肝细胞，观察术后一周内大鼠肝细胞DNA合成和细胞周期的变化。结果 术后残肝逐渐长大，一周时达到高峰，但在术后48小时内，增长速度较慢。肝细胞DNA合成和增殖系数在后术24小时内增长较快，且在24小时点达到高峰，以后缓慢下降。结论 肝部分切除术后肝细胞的再生可分为三个时期，这种分期观点对如何防止术后肝衰及降低死亡率具有重要意义。
The changes in DNA synthesis and cell cycle of hepatocytes after parital hepatectomy Chen Ping, Han Benli, Chen Juan, et al. Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038
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【Abstract】 Objecive To probe the changes in DNA synthesis, cell growth cycle and regeneration index during hepatocyte regeneration after parital hepatectomy in rats. Methods The rat model of post partial hepatectomy was used. The rat hepatocytes were cultured in vitro and DNA synthesis and cell cycle changes were studies 1 week after operation. Results The remnant liver enlarged gradually and the growth peak was 7 days after operation, but the growth of remnant liver in the first 2 days was much slower than 2 days after operation. The hepatocyte DNA synthesis and regeneration index had more rapid increase in the first 24 hours postoperation, with the peak at 24 hours after hepatectomy, and then decreased gradually. Conclusion The liver regeneration after partial hepatectomy can be devided into three periods. This study suggests that using the theroy of liver regeneration it would be of importance in preventing liver failure and decreasing post-hepatectomy mortality.
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【Key words】 Liver regeneration Partial hepatectomy DNA Cell cycle
肝部分切除术是肝胆外科常见的术式，肝脏再生是术后最基本的病理过程。但目前对再生肝细胞动态研究较少，特别是其DNA合成功能及细胞周期等的变化尚不清楚，对肝再生启动的机制国内外学者分歧较大。本试验通过复制大鼠部分肝切除模型，试图动态观察再生肝细胞变化规律，进一步探讨肝脏再生的机制。
材料和方法
1.实验动物分组及模型制作：健康的雄性Wistar大鼠，重220～250g，随机分为肝部分切除术组(PH)和假手术组(SO)。肝叶切除的动物模型采用由Goss介绍的Higgin创建的方法〔1〕，即大鼠在乙醚麻醉下，腹部正中切口入腹，切除大鼠肝脏的左叶和中叶(切除量为全肝的70%)，所有的模型制作是在上午8∶00～9∶00之间进行。SO组方法同上，但不切除肝脏，即正常对照组。手术后腹腔内注射5%GS 5ml。观察时相为大鼠术后0、6、24、48、72小时及一周。
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2.肝细胞的分离与培养：采用Seglen的方法〔2〕，简言之，到时相点的动物乙醚麻醉，门静脉游离插管，向肝内均匀灌注Hank液，同时剪开下腔静脉。然后再向肝内均匀灌注0.05%胶原酶。切除肝脏，将肝脏剪碎，37℃水浴箱内孵育5分钟后，将肝细胞悬液离心(50 g)5分钟，取沉淀的肝细胞，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，细胞浓度为1×105/ml，放入5% CO2孵箱内孵育。24小时后，取出培养的肝细胞，用0.1M的PBS液洗涤两次，调整细胞浓度为1×106/ml，用70%的酒精固定，放入4℃冰箱待测。
3. 流式细胞仪测定细胞周期、DNA含量：将送检样本送往第三军医大学中心实验室测定，(流式细胞仪为美国的Becton Dickinson公司制造，型号为FAC Star-Plus)。采用丫啶橙(AO)一步染色法处理法，使AO分子与核酸结合，分别在530NM波长下用流式细胞仪测定DNA含量和细胞周期的变化。
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统计学处理：资料表达采用
±SD，采用方差分析，t检验，以P<0.05为差异显著。结 果
1.肝部分切除术后残肝重量的变化：见图1，从图中可以看出，残肝逐渐长大，在48小时内，增长速度较慢。术后3～7天增长速度明显加快，一周时达到高峰，为10.0±0.3g。相当于未切肝时(SO组)肝脏的重量。SO组肝脏重量为9.2±0.4g(两组肝脏重量均含灌注液)，与PH组术后一周点比较差异不明显。
图1 肝切除术后一周残肝重量的变化
2.肝切除术后残肝细胞增殖系数的变化：见图2。从图中可以看出，肝细胞增殖系数在24小时内增长最快，且在24小时点达到高峰，以后呈缓慢下降的趋势。术后6、24和48小时与术后一周比较，均差异显著。
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3.肝切除术后残肝细胞DNA含量的变化：见图3。从图中可以看出，肝细胞G2期和M期DNA含量的变化，是与其增殖系数的变化一致的。肝细胞DNA合成的高峰是在术后24小时点，以后其DNA合成功能逐渐下降，到一周时其细胞的DNA含量降至0时相点的水平，说明肝细胞的再生主要发生在术后一周。特别是在术后3天以内，是肝细胞DNA合成的关键时期。
图2 肝切除术后残肝细胞增殖系数的变化
图3 肝切除术后一周内残肝细胞G2期和M期DNA含量的变化
讨 论
1.关于肝部分切除动物模型：自1933年Higgins和Anderson制作了肝叶部分切除动物模型以来，人们对肝再生进行了广泛研究。采用70%左右的肝切除动物模型(即切除大鼠的左肝和中肝)，具有以下优点：①由于切除的是完整的肝叶，因此结扎线处没有过多的残留组织，创面小，不易感染和出现胆瘘炎症反应较轻；②如果肝切除量大于70%，则易发生肝衰，动物死亡率明显增高，据报道为30%～50%。但此模型死亡率小于5%。因此模型比较稳定。③如果肝切除量小于60%，则对肝再生的诱导差，细胞周期和DNA的变化不明显，不利于研究的进行。因此，目前对肝再生的研究多采用此模型。
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2.肝部分切除术后肝细胞再生规律：从我们的研究可以看出，肝细胞再生大致可以分为三个时期，即肝细胞再生的启动，DNA的大量合成和肝细胞的大量分裂增殖期。在术后48小时内，残肝的重量增加不明显，肝细胞DNA合成不活跃，肝细胞的增殖系数相对较低。这说明肝细胞再生处于启动状态。在枯否氏细胞等分泌的细胞因子和内分泌激素的作用之下，肝细胞再生可迅速被启动。48小时后，残肝的重量增加较快，以3～7天时增长最为显著。这个变化与再生肝细胞的DNA变化一致。从图2可以看出，再生肝细胞的DNA的变化以48、72小时点变化最明显，再生肝细胞的增殖系数也是在这两点达到最高峰，这说明肝细胞的再生在48～72小时时，是肝细胞增殖最活跃的时期，主要表现在DNA的合成上。而72小时至一周时，残肝体积增长迅速，重量明显增加，一周时基本上已恢复到术前水平，这说明肝细胞的再生在这一时期内，以细胞的分裂增殖为主。但是，这三个时期不是截然划分的，相互之间有所重叠，但其主要的变化与这个划分是一致的。
3.从肝切除术后肝细胞再生规律探讨肝衰的发生：从我们以往的实验中可以看到，70%或>70%的大鼠肝切除术后，其死亡的原因多是术后肝衰所致，死亡的时间多在术后三天以内，这与我们提出的肝细胞再生的规律一致。从上面的讨论可看到，肝细胞再生的启动和G2期M期大量DNA的合成主要在术后前三天，一旦肝细胞进入S期，大量、快速地分裂增殖，则肝脏的功能可迅速地恢复，动物的死亡率明显下降。因此，我们认为，要降低肝部分切除术后肝衰，就应当让迅速启动肝细胞的再生，促使G2期和M期的肝细胞大量合成DNA，即尽量缩短肝细胞再生的前两期的时间，使肝细胞能尽快进入S期大量分裂增殖。这样可望降低由肝细胞功能衰竭引起的死亡率。
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注：本课题由国家自然科学基金资助(39670712)
参 考 文 献
1Goss JA, Mangino MJ, Callery, et al. Postaglandin E2 downregulates Kupffer cell production of IL-1 and IL-6 during hepatic regeneration. Am Physio Soci, 1993, G601-608.
2Sgelen G. Preparation of isolated liver cells. Methods in cell biology, 1976, 13:30-6.
(收稿：1998-01-18), http://www.100md.com