门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因表达对肝移植急性排斥的诊断价值
作者：张绍庚 吴孟超 姚和祥 陈汉 钱其军
单位：350001 福州市，南京军区福州总医院(张绍庚，姚和祥)；200433 上海，东方肝胆外科医院(吴孟超，陈汉，钱其军)
关键词：穿孔素；颗粒酶B；排斥反应；肝移植
中华肝胆外科杂志/980306.htm 【摘要】 目的 探讨门静脉和外周血中肝移植急性排斥的早期诊断特异标志物。方法 建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测受体门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，并以同基因肝移植为对照。结果 急性排斥肝移植组术后3天门静脉和外周血中均有穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达，4天后表达明显增强，并贯穿整个排斥反应的全过程，但外周血表达的强度明显较门静脉血为弱，同基因对照组术后14天内无穿孔素和颗粒酶B基因表达。结论 门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因表达对肝移植急性排斥均有早期诊断价值。
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The diagnostic value of perforin and granzyme B genes expression in portal vein and peripherial blood in acute rejection after liver transplantation Zhang Shaogeng, Wu Mengchao, Yao Hexiang, et al. Department of Hepatobiliary Surgery, Fuzhou General Hospital, Nanjing Military Region. Fuzhou 350001
【Abstract】 Objective To explore early specific markers in portal vein and peripherial blood for monitoring acute rejection in orthotopic liver transplantation. Methods Investigating the mRNA expression of perforin and granzyme B genes by a reverse transcriptase ploymerase chain reaction in portal vein and peripherial blood in gold hamster-to-rat orthotopic liver transplantation and the control was rat-to-rat. Results The rejection group began to show the mRNA of perforin and granzyme B up-regulation on day 3 posttransplantation, when no histologic evidence of rejection was found. Levels of expression significantly increased after day 4 posttransplantation and persisted through the whole course of rejection, but levels of expression were obviously lower in the peripherial blood than those in portal vein blood. In contrast, the control group showed no expression of mRNA for perforin and granzyme B in portal vein and peripherial blood. Conclusions The up-regulation of perforin and granzyme B genes in portal vein and peripherial blood are useful early diagnostic markers of acute rejection in liver transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 Perforin Granzyme B Rejection Liver transplatation
免疫排斥反应是肝移植的主要障碍之一，急性排斥反应对机体和移植肝危害极大，其主要由细胞毒T细胞介导的细胞毒性作用，研究急性排斥反应的机理和寻求可靠的早期诊断指标具有十分重要的意义。本研究在建立大鼠肝移植急性排斥反应模型的基础上，探讨了门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因的表达及早期诊断作用。
材料与方法
1.实验动物及分组 分急性排斥组和同基因对照组。急性排斥组供体为雌性金黄地鼠，150～180克，同基因对照组供体为雄性Wistar大鼠，200～240克，受体均为雄性Wistar大鼠，230～260克。急性排斥组35只，同基因对照组45只。
2.肝移植 同基因肝移植模型建立参见文献〔1〕，急性排斥肝移植模型建立参见〔2〕。
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3.细胞的采集与保存 排斥组肝移植术后1～7天和对照组肝移植术后1～7天10、14天每天各组均处死5只受体大鼠，并采集门静脉血、外周血各2～3ml，肝素抗凝，用等量Hank液稀释1倍，加1.077的淋巴细胞分离液3ml 1800rpm离心30分钟，收集淋巴细胞，-80℃保存备用。
(1)RAN制备 采用Qiagen试剂盒抽提RNA，简述如下：将淋巴细胞置于微量组织碾磨器，加350μl裂解缓冲液(3.5μl β-巯基乙醇)8000g离心3分钟，再与等量70%乙醇吹打混匀，进RNA抽提柱8000g离心15秒，加冲洗缓冲液RW1700μl 8000g离心15秒，两次加冲洗RPE 500μl工作液离心，最后加DEPC处理水8000g离心洗脱，收集RNA。用分光光度计在260nm测定RNA浓度，用260与280之比测定RNA纯度，所有RNA纯度均在1.7以上。阳性对照采用大鼠脾细胞，在植物血凝素(pHA，10 μg/ml)、刀豆素A(ConA，10 μg/ml)和白细胞介素-2(20μ/ml)刺激培养18小时，离心收集脾细胞抽提RNA。阴性对照则采用正常大鼠肝组织。RNA置-80℃保存。
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(2)cDNA合成 逆转录采用GIBCOBRL试剂盒合成cDNA。将2μg RNA稀释至11μl，加入低核苷酸1μl(0.5μg)，70℃水浴10分钟，冰水冷却1分钟以上，加入10×PCR缓冲液2μl、25mM氯化镁2μl、10mMdNTP1μl、0.1MDTT2μl，短暂离心混匀，42℃水浴5分钟，加入200μ逆转录酶混匀，42℃水浴50分钟，然后70℃水浴15分钟、冰水冷却，加RNA酶37℃水浴20分钟，收集cDNA，-20℃保存。6. PCR穿孔素、颗粒酶B和β-actin DNA引物序列根据大鼠相应基因外显子DNA序列合成(见附表)。2 μl cDNA加入10 mM去氧核苷1μl、25mM氯化镁3μl、引物正反链各2μl、10×缓冲液5μl、聚合酶(Taq)1μl、双蒸水34μl，共50 μl，加石蜡油封顶，然后进行温度周期循环，包括最初94℃3分钟，其后95℃15秒，60℃20秒，72℃30秒，共30循环，最终步骤为70℃10分钟，产物用琼脂糖电泳溴化乙锭染色分析，相应部分出现阳性染色带表明mRNA的存在。
, http://www.100md.com 附表 PCR引物序列 基因
引物
硷基对
β-actin
正链
5’GCCATCCTGCGTCGTGACCTG3’
599bp
反链
5’CATTTGCGGTGCACGATGGAG3’
穿孔素
正链
5’TGCTACACTGCCACTCGGTCA3’
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566bp
反链
5’GCATGCTCTGTGGAGCTGTTA3’
颗粒酶B
正链
5’GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC3’
465bp
反链
5’TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC3’
结 果
1.门静脉血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达 穿孔素和颗粒酶B基因mRNA测定具有很好的重复性，两组在肝移植术后2天内均无穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，急性排斥组术后3天即有80%(4/5)表达穿孔素和颗粒酶B基因mRNA，4天后各受体均表达该两基因，而且表达明显增强，并贯穿整个排斥反应全过程；同基因对照组术后14天内基本无穿孔素和颗粒酶基因表达，仅1例在术后10天和14天轻度表达该两基因(P<0.001)。而阴性对照均呈阴性，阳性对照均呈阳性，内对照β-actin也衡定表达，30周期后PCR产物电泳可显现。
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2.外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达 在外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达时间与门静脉血一致，两组在肝移植术后2天内也均无该两基因mRNA的表达，排斥组术后3天有4例表达穿孔素和3例表达颗粒酶B基因，但其表达的强度明显较门静脉血为弱，4天后各受体均表达该两基因，且表达程度也明显增强，而对照组两周内均不表达该两基因(P<0.001)。
讨 论
免疫排斥反应是临床肝移植的主要障碍之一。急性排斥一旦发生，对移植肝和受体危害极大，细胞免疫是肝移植急性排斥的主要机制〔3〕。主要效应细胞是细胞毒T淋巴细胞(CTL)，而CTL主要通过穿孔素和颗粒酶途径杀伤靶细胞〔4〕。寻求CTL激活功能标志基因的表达作为诊断急性排斥预见性指标是近年来的研究热点之一，业已证明，在小鼠和大鼠的心、肾、小肠和胰岛同种移植急性排斥模型的移植物中，穿孔素和颗粒酶A、B基因表达水平均显著高于同基因移植者，而且急性排斥早期其mRNA表达明显升高，并贯穿急性排斥反应的全过程。在人的心、肺、肾同种异体移植急性排斥的移植物活检中也有类似的发现。有趣的是，穿孔素和颗粒酶A、B的表达水平与排斥反应的严重程度和经过相平行，而且可用来区分轻度排斥的预后〔4〕。
, 百拇医药
我们的结果显示，在金黄地鼠至大鼠肝移植术后有大量的单核细胞浸润，术后3天肝组织结构完整，仅有少量炎细胞浸润，5天见大量单核细胞浸润，并偶见少量肝细胞坏死，7天则为大量单核细胞浸润，广泛的肝细胞坏死和间隙出血，肝组织结构严重破坏，浸润细胞中存在大量的OX19+和OX8+细胞，说明细胞免疫参与了肝移植急性排斥反应〔5〕。而穿孔素和颗粒酶B基因mRNA在术后3天的门静脉血中即表达，4天后表达明显增强。外周血中也可见穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达，但其表达强度明显弱于门静脉血。提示穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达预示T细胞的激活，急性排斥反应即将出现，其表达较组织学证据早两天〔5〕。
本研究结果表明，CTL的穿孔素途径参与介导肝移植急性排斥反应，其基因表达明显先于病理损害，并且具有阳性率高、取材方便，可避免肝组织活检。该两基因mRNA表达有可能会成为诊断肝移植急性排斥反应的早期预见性指标。为及时进行免疫抑制治疗，避免移植肝的病理损害和功能衰竭具有重要的临床指导意义，但有待于临床进一步的深入研究。
, 百拇医药
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1张绍庚，方石岗，吴孟超，等. 改良三袖套法大鼠原位肝移植. 中华显微外科杂志，1997，20：54.
2Harihara Y, Sanjo k, Idezuki Y. Simplified three-cuff in concordant hamster-to-rat liver xenotransplantation. Tranaplant Proc, 1994, 26:1191.
3Krams SM. New immunologic insights into mechanisms of allograft rejection. Gastroent Clin Nor Am, 1993, 22:381.
4张绍庚，吴孟超，杨甲梅. 穿孔素和颗粒酶在移植排斥中的作用. 《国外医学》免疫学分册，1997，20：35.
5张绍庚，杨甲梅，吴孟超，等. 细胞免疫在金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应中的作用. 中华实验外科杂志，1996，13(增刊)：7.
(收稿：1997-12-23), 百拇医药
单位：350001 福州市，南京军区福州总医院(张绍庚，姚和祥)；200433 上海，东方肝胆外科医院(吴孟超，陈汉，钱其军)
关键词：穿孔素；颗粒酶B；排斥反应；肝移植
中华肝胆外科杂志/980306.htm 【摘要】 目的 探讨门静脉和外周血中肝移植急性排斥的早期诊断特异标志物。方法 建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测受体门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，并以同基因肝移植为对照。结果 急性排斥肝移植组术后3天门静脉和外周血中均有穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达，4天后表达明显增强，并贯穿整个排斥反应的全过程，但外周血表达的强度明显较门静脉血为弱，同基因对照组术后14天内无穿孔素和颗粒酶B基因表达。结论 门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因表达对肝移植急性排斥均有早期诊断价值。
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The diagnostic value of perforin and granzyme B genes expression in portal vein and peripherial blood in acute rejection after liver transplantation Zhang Shaogeng, Wu Mengchao, Yao Hexiang, et al. Department of Hepatobiliary Surgery, Fuzhou General Hospital, Nanjing Military Region. Fuzhou 350001
【Abstract】 Objective To explore early specific markers in portal vein and peripherial blood for monitoring acute rejection in orthotopic liver transplantation. Methods Investigating the mRNA expression of perforin and granzyme B genes by a reverse transcriptase ploymerase chain reaction in portal vein and peripherial blood in gold hamster-to-rat orthotopic liver transplantation and the control was rat-to-rat. Results The rejection group began to show the mRNA of perforin and granzyme B up-regulation on day 3 posttransplantation, when no histologic evidence of rejection was found. Levels of expression significantly increased after day 4 posttransplantation and persisted through the whole course of rejection, but levels of expression were obviously lower in the peripherial blood than those in portal vein blood. In contrast, the control group showed no expression of mRNA for perforin and granzyme B in portal vein and peripherial blood. Conclusions The up-regulation of perforin and granzyme B genes in portal vein and peripherial blood are useful early diagnostic markers of acute rejection in liver transplantation.
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【Key words】 Perforin Granzyme B Rejection Liver transplatation
免疫排斥反应是肝移植的主要障碍之一，急性排斥反应对机体和移植肝危害极大，其主要由细胞毒T细胞介导的细胞毒性作用，研究急性排斥反应的机理和寻求可靠的早期诊断指标具有十分重要的意义。本研究在建立大鼠肝移植急性排斥反应模型的基础上，探讨了门静脉和外周血中穿孔素和颗粒酶B基因的表达及早期诊断作用。
材料与方法
1.实验动物及分组 分急性排斥组和同基因对照组。急性排斥组供体为雌性金黄地鼠，150～180克，同基因对照组供体为雄性Wistar大鼠，200～240克，受体均为雄性Wistar大鼠，230～260克。急性排斥组35只，同基因对照组45只。
2.肝移植 同基因肝移植模型建立参见文献〔1〕，急性排斥肝移植模型建立参见〔2〕。
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3.细胞的采集与保存 排斥组肝移植术后1～7天和对照组肝移植术后1～7天10、14天每天各组均处死5只受体大鼠，并采集门静脉血、外周血各2～3ml，肝素抗凝，用等量Hank液稀释1倍，加1.077的淋巴细胞分离液3ml 1800rpm离心30分钟，收集淋巴细胞，-80℃保存备用。
(1)RAN制备 采用Qiagen试剂盒抽提RNA，简述如下：将淋巴细胞置于微量组织碾磨器，加350μl裂解缓冲液(3.5μl β-巯基乙醇)8000g离心3分钟，再与等量70%乙醇吹打混匀，进RNA抽提柱8000g离心15秒，加冲洗缓冲液RW1700μl 8000g离心15秒，两次加冲洗RPE 500μl工作液离心，最后加DEPC处理水8000g离心洗脱，收集RNA。用分光光度计在260nm测定RNA浓度，用260与280之比测定RNA纯度，所有RNA纯度均在1.7以上。阳性对照采用大鼠脾细胞，在植物血凝素(pHA，10 μg/ml)、刀豆素A(ConA，10 μg/ml)和白细胞介素-2(20μ/ml)刺激培养18小时，离心收集脾细胞抽提RNA。阴性对照则采用正常大鼠肝组织。RNA置-80℃保存。
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(2)cDNA合成 逆转录采用GIBCOBRL试剂盒合成cDNA。将2μg RNA稀释至11μl，加入低核苷酸1μl(0.5μg)，70℃水浴10分钟，冰水冷却1分钟以上，加入10×PCR缓冲液2μl、25mM氯化镁2μl、10mMdNTP1μl、0.1MDTT2μl，短暂离心混匀，42℃水浴5分钟，加入200μ逆转录酶混匀，42℃水浴50分钟，然后70℃水浴15分钟、冰水冷却，加RNA酶37℃水浴20分钟，收集cDNA，-20℃保存。6. PCR穿孔素、颗粒酶B和β-actin DNA引物序列根据大鼠相应基因外显子DNA序列合成(见附表)。2 μl cDNA加入10 mM去氧核苷1μl、25mM氯化镁3μl、引物正反链各2μl、10×缓冲液5μl、聚合酶(Taq)1μl、双蒸水34μl，共50 μl，加石蜡油封顶，然后进行温度周期循环，包括最初94℃3分钟，其后95℃15秒，60℃20秒，72℃30秒，共30循环，最终步骤为70℃10分钟，产物用琼脂糖电泳溴化乙锭染色分析，相应部分出现阳性染色带表明mRNA的存在。
, http://www.100md.com 附表 PCR引物序列 基因
引物
硷基对
β-actin
正链
5’GCCATCCTGCGTCGTGACCTG3’
599bp
反链
5’CATTTGCGGTGCACGATGGAG3’
穿孔素
正链
5’TGCTACACTGCCACTCGGTCA3’
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566bp
反链
5’GCATGCTCTGTGGAGCTGTTA3’
颗粒酶B
正链
5’GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC3’
465bp
反链
5’TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC3’
结 果
1.门静脉血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达 穿孔素和颗粒酶B基因mRNA测定具有很好的重复性，两组在肝移植术后2天内均无穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，急性排斥组术后3天即有80%(4/5)表达穿孔素和颗粒酶B基因mRNA，4天后各受体均表达该两基因，而且表达明显增强，并贯穿整个排斥反应全过程；同基因对照组术后14天内基本无穿孔素和颗粒酶基因表达，仅1例在术后10天和14天轻度表达该两基因(P<0.001)。而阴性对照均呈阴性，阳性对照均呈阳性，内对照β-actin也衡定表达，30周期后PCR产物电泳可显现。
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2.外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达 在外周血中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达时间与门静脉血一致，两组在肝移植术后2天内也均无该两基因mRNA的表达，排斥组术后3天有4例表达穿孔素和3例表达颗粒酶B基因，但其表达的强度明显较门静脉血为弱，4天后各受体均表达该两基因，且表达程度也明显增强，而对照组两周内均不表达该两基因(P<0.001)。
讨 论
免疫排斥反应是临床肝移植的主要障碍之一。急性排斥一旦发生，对移植肝和受体危害极大，细胞免疫是肝移植急性排斥的主要机制〔3〕。主要效应细胞是细胞毒T淋巴细胞(CTL)，而CTL主要通过穿孔素和颗粒酶途径杀伤靶细胞〔4〕。寻求CTL激活功能标志基因的表达作为诊断急性排斥预见性指标是近年来的研究热点之一，业已证明，在小鼠和大鼠的心、肾、小肠和胰岛同种移植急性排斥模型的移植物中，穿孔素和颗粒酶A、B基因表达水平均显著高于同基因移植者，而且急性排斥早期其mRNA表达明显升高，并贯穿急性排斥反应的全过程。在人的心、肺、肾同种异体移植急性排斥的移植物活检中也有类似的发现。有趣的是，穿孔素和颗粒酶A、B的表达水平与排斥反应的严重程度和经过相平行，而且可用来区分轻度排斥的预后〔4〕。
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我们的结果显示，在金黄地鼠至大鼠肝移植术后有大量的单核细胞浸润，术后3天肝组织结构完整，仅有少量炎细胞浸润，5天见大量单核细胞浸润，并偶见少量肝细胞坏死，7天则为大量单核细胞浸润，广泛的肝细胞坏死和间隙出血，肝组织结构严重破坏，浸润细胞中存在大量的OX19+和OX8+细胞，说明细胞免疫参与了肝移植急性排斥反应〔5〕。而穿孔素和颗粒酶B基因mRNA在术后3天的门静脉血中即表达，4天后表达明显增强。外周血中也可见穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达，但其表达强度明显弱于门静脉血。提示穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达预示T细胞的激活，急性排斥反应即将出现，其表达较组织学证据早两天〔5〕。
本研究结果表明，CTL的穿孔素途径参与介导肝移植急性排斥反应，其基因表达明显先于病理损害，并且具有阳性率高、取材方便，可避免肝组织活检。该两基因mRNA表达有可能会成为诊断肝移植急性排斥反应的早期预见性指标。为及时进行免疫抑制治疗，避免移植肝的病理损害和功能衰竭具有重要的临床指导意义，但有待于临床进一步的深入研究。
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注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1张绍庚，方石岗，吴孟超，等. 改良三袖套法大鼠原位肝移植. 中华显微外科杂志，1997，20：54.
2Harihara Y, Sanjo k, Idezuki Y. Simplified three-cuff in concordant hamster-to-rat liver xenotransplantation. Tranaplant Proc, 1994, 26:1191.
3Krams SM. New immunologic insights into mechanisms of allograft rejection. Gastroent Clin Nor Am, 1993, 22:381.
4张绍庚，吴孟超，杨甲梅. 穿孔素和颗粒酶在移植排斥中的作用. 《国外医学》免疫学分册，1997，20：35.
5张绍庚，杨甲梅，吴孟超，等. 细胞免疫在金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应中的作用. 中华实验外科杂志，1996，13(增刊)：7.
(收稿：1997-12-23), 百拇医药