血小板活化状态与原发性肾病综合征患儿高凝状态的研究
作者：白晓玲 郭卫民* 段晓辉 许 波 孙晓明 尹格平
单位：济南军区总医院儿科 济南，250031
关键词：血小板；肾病综合征；高凝状态
肾脏病与透析肾移植杂志990111 摘 要 目的：探讨原发性肾病综合征(NS)患儿血小板活化程度在诊断高凝状态中的价值。 方法：采用流式细胞仪检测38例NS患儿外周血血小板颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体颗粒膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)，同时检测了血管内皮细胞标志、凝血、抗凝及纤溶指标。 结果： 与对照组比较，NS患儿肾病期血小板CD62P、CD63及TSP表达率明显增高，缓解期接近正常，CD62P、CD63与PAgT、 VWF、PAI及FDP呈明显正相关，与AT-Ⅲ：Ag、AT-Ⅲ：ac呈明显负相关；TSP与VWF、PAI正相关。结论：提示血小板活化与NS高凝状态的发生有关，CD62P及CD63为早期诊断高凝状态的敏感指标。
, 百拇医药
PLATELET ACTIVATION AND HYPERCOAGULABLE STATE IN CHILDHOOD NEPHROTIC SYNDROME
Bai Xiaoling，Guo Weimin，Duan Xiaohui，Xu Bo，Sun Xiaoming，Yi Geping
General Hospital of Jinan Military Command，Jinan，250031
OBJECTIVE To investigate the clinical significance of platelet activation in childhood primary nephrotic syndrome(NS)with the hypercoagulabe state.
METHODOLOGY This study included 38 children of primary NS and 20 healthy children as the control.Platelet alpha-granule membrane protein(CD62P)，platelet lysosomal membrane glycoprotein(CD63)and thrombopondin(TSP)were measured with flow-cytometry.Markers of damaged vascular endothelial cells，indices of coagulation，anticoagulation and fibrinolysis were determined.The parameters of NS children in relapse were compared with those of NS children in remission and the control.
, http://www.100md.com
RESULTS The expression rates of platelet CD62P，CD63 and TSP of NS children in relapse were significantly increased as compared to those of NS children in remission and the control.It was found that the expression of CD62P or CD63 was positively correlated with PAgT，concentration of vascular hemophilia factor(VWF)，plasminogen activator inhibitor(PAI)and fibrin degradation products (9FDP)contents.A negative correlation was found between CD62P or CD63 and antithrombin-Ⅲ agent (AT-Ⅲ：Ag)and antithrombin-Ⅲ activity (AT-Ⅲ：ac).TSP was found positively related to VWF and PAI.
, http://www.100md.com
CONCLUSION CD62P and CD63 can be used as sensitive markers in the early monitoring of the hypercoagulable state in children of primary nephrotic syndrome.
Key words platelet nephrotic syndrome hypercoagulable state
近年来研究证实，肾病综合征常合并高凝状态，易形成血栓，是影响疾病预后的重要因素之一[1]，本研究采用流式细胞仪，检测了38例原发性肾病综合征(NS)患儿外周血血小板α-颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)，同时观察了血管内皮细胞标志、凝血、抗凝及纤溶指标的改变，以探讨NS患儿血小板活化对高凝状态的意义。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 1997年1月以来收治的NS患儿共38例，年龄1岁半～12岁，病程1周～6年。诊断均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组关于NS诊断标准的修订方案，其中单纯性肾病(SNS)26例，男17例，女9例；肾炎性肾病(NNS)12例，男8例，女4例；20例健康儿为正常对照组，其中男12例，女8例，年龄2～12岁。
1.2 方法
1.2.1 CD62P、CD63及TSP测定 EDTA抗凝血2ml，800r/min，5min，取上层血清即为富含血小板血清，调整血小板至109/L，分别加入荧光单抗(法国国际免疫公司提供)，按我院流式细胞室操作规程在FACScan型流式细胞仪上(美国BD公司生产)测试。
1.2.2 主要凝血、抗凝及纤溶指标的检测 3.8%枸橼酸钠抗凝血3 ml，用比浊法(以ADP为诱导剂)在高能双通道血液凝集仪上测定血小板聚集活性(PAgT)；免疫火箭电泳法测定血管性假血友病因子(VWF：Ag)、抗凝血酶-Ⅲ含量(AT-Ⅲ：Ag)；抗凝血酶-Ⅲ活性(AT-Ⅲ：ac)采用免疫扩散法；组织纤溶酶原激活物活性(tPA：ac)及纤溶酶原激活抑制物活性(PAI：ac)采用发光底物法；纤维蛋白降解产物(FDP)采用乳胶法。
, http://www.100md.com
1.2.3 统计学方法 采用方差分析、两两比较采用q检验及直线相关分析。
2 结 果
2.1 NS患儿血小板活化标志及PAgT、VWF的改变 NS患儿外周血血小板CD62P、CD63及TSP在肾病期明显增高，缓解期降低，与PAgT、VWF的改变见表1。
表1 NS患儿血小板活化标志及PAgT、VWF改变(
±s，%) 组别
n
CD62P
CD63
TSP
, 百拇医药
PAgT
VWF
活动期
38
5.01±3.02**△△
4.16±2.05**△△
3.59±1.75**△△
63.0±11.3*△
154.1±42.3**
缓解期
, 百拇医药
31
1.93±1.06
2.13±1.28
2.23±1.11
55.2±13.3
125.8±29.8
对照组
20
1.82±133
2.11±1.25
2.24±2.11
51.5±11.2
, 百拇医药
106.6±17.8
F值
21.02
11.10
8.50
7.02
14.9
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01 与缓解期比较：△P<0.05 △△P<0.012.2 NS患儿凝血、抗凝及纤溶指标的改变 见表2。
表2 NS患儿其他抗凝及纤溶指标的改变(±s) 组别
, http://www.100md.com
n
AT-Ⅲ：Ag(mg/L)
AT-Ⅲ：ac(%)
tPA：ac(×103U/L)
PAI：ac(×103U/L)
FDP(mg/L)
活动期
38
29.2±5.0**
68.1±12.0**△△
, http://www.100md.com
0.67±0.07
10.1±1.2*
13.6±4.7**△△
缓解期
31
39.9±8.1
99.0±21.4
0.72±0.18
8.9±1.4
6.9±2.9
对照组
20
, 百拇医药
37.8±5.4
96.0±18.5
0.74±0.17
7.0±1.8
6.3±2.7
F 值
11.36
9.05
1.55
5.86
14.6
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01 与缓解期比较：△P<0.05，△△P<0.012.3 血小板活化标志与其它凝血、纤溶等指标的相关关系 CD62P、CD63与VWF、PAgT、PAI、FDP呈明显正相关，与AT-Ⅲ：Ag，AT-Ⅲ：ac呈明显负相关；TSP与VWF、PAI呈正相关(见表3)。
, 百拇医药
表3 血小板活化标志与凝血、纤溶指标的相关关系(r值) 活化标志
PAgT
VWF
AT-ⅢAg
ATⅢ-：ac
tPA：ac
PAI：ac
FDP
CD62P
0.486**
0.492**
, 百拇医药 0.406**
0.389**
0.236
0.452**
0.370*
CD63
0.438**
0.386**
0.362*
0.356*
, 百拇医药
0.258
0.380**
0.312*
TSP
0.260
0.320*
0.240
0.209
0.198
0.279*
0.208
*P<0.05，**P<0.013 讨 论
, http://www.100md.com
在某些因素的作用下，与血栓形成相关的凝血蛋白、抗凝蛋白、纤溶因子、血小板及血管内皮细胞发生了变化，表现出某些特征或释放出某些产物，利用先进的技术和灵敏的方法检测，可以特异地反映高凝状态。血小板被激活时，原存于静止血小板胞浆内α-颗粒膜上的膜糖蛋白及基质蛋白CD62P和TSP，溶酶体膜糖蛋白CD63，随着活化血小板的“脱颗粒”发生易位，而在血小板膜表面表达，成为血小板活化的良好标志[2，3]。采用流式细胞仪通过荧光单抗直接检测这些分子标志物，比以往检测其代谢产物β-血小板球蛋白、血小板第4因子灵敏度高、特异性强。本组研究结果显示，NS患儿肾病期CD62P、CD63及TSP均增高，表明NS肾病期血小板高度活化；我们同时观察到凝血指标PAgT、VWF明显增高，抗凝指标AT-Ⅲ：Ag及AT-Ⅲ：ac显著降低，提示NS肾病期血液高凝；而tPA呈降低趋势，PAI、FDP明显增高，提示机体纤溶能力差，有微血栓形成及继发纤溶现象；此外，VWF、PAI增高尚提示存在血管内皮细胞损伤。
CD62P、CD63及TSP与凝血、抗凝、纤溶及血管内皮细胞损伤指标存在不同程度的相关关系，我们还观察到NS肾病期全血比粘度、血浆比粘度增高，与血小板活化标志呈正相关(资料未显示)，表明血小板是否活化及其程度可以判断体内有无血液高凝及血栓形成倾向，可作为高凝状态的敏感指标。
, http://www.100md.com
在三种血小板活化标志中，以CD62P与各项凝血、纤溶指标相关性最好，而在正常对照组外周血血小板中表达率最低，故认为CD62P敏感性及特异性最强，可作为反映NS患儿血小板活化，判断高凝状态的最佳指标，这与吴国新等[4]报道相符；TSP与各项凝血、纤溶指标相关性较差，提示敏感性欠佳，但TSP与血管内皮细胞损伤标志存在正相关关系，又主要在肾炎型肾病中高表达(另文报道)，其相互间关系及意义有待进一步研究；CD63与各项凝血、纤溶指标存在一定的相关关系，而且与CD62P的表达呈明显正相关(r＝0.516)，故认为CD63对判断NS时血小板活化程度亦有较好的临床价值。CD62P、CD63及TSP的阳性细胞表达率随NS的缓解而接近正常，与其它凝血、纤溶及血液流变学等指标的改变相一致，提示血小板活化与肾病时高凝状态的发生有关，是影响肾病预后的重要因素，动态观察CD62P、CD63的改变，有助于早期诊断NS时高凝状态，监测病情变化及抗血小板活性药、抗凝剂的使用。
*济南空军医院
, http://www.100md.com
参考文献
1 Liach F.Hypercoagulability，renal vein thrombosis and other thrombotic complication of nephrotic syndrome.Kidney int，1985；28：429
2 Sedlmayr P，Grobhaupt B，Muntean W et al.Flow cytometric detection intracelluar platelet
antigens.Cytometry，1996；23：284
3 Abrams C，Shatttil SJ.Immunological detection of activated platelets in clinical disorders.Thromb Heamostas，1992；68：378
4 吴国新，阮长耿.检测体外血小板活化程度时4种血小板表面活化标志蛋白的比较.苏州医学院学报，1993；13(1)：263
收稿日期：1998-11-26，修回日期：1999-01-04
本文编辑 刘启成, 百拇医药(白晓玲 郭卫民* 段晓辉 许 波 孙晓明 尹格平)
单位：济南军区总医院儿科 济南，250031
关键词：血小板；肾病综合征；高凝状态
肾脏病与透析肾移植杂志990111 摘 要 目的：探讨原发性肾病综合征(NS)患儿血小板活化程度在诊断高凝状态中的价值。 方法：采用流式细胞仪检测38例NS患儿外周血血小板颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体颗粒膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)，同时检测了血管内皮细胞标志、凝血、抗凝及纤溶指标。 结果： 与对照组比较，NS患儿肾病期血小板CD62P、CD63及TSP表达率明显增高，缓解期接近正常，CD62P、CD63与PAgT、 VWF、PAI及FDP呈明显正相关，与AT-Ⅲ：Ag、AT-Ⅲ：ac呈明显负相关；TSP与VWF、PAI正相关。结论：提示血小板活化与NS高凝状态的发生有关，CD62P及CD63为早期诊断高凝状态的敏感指标。
, 百拇医药
PLATELET ACTIVATION AND HYPERCOAGULABLE STATE IN CHILDHOOD NEPHROTIC SYNDROME
Bai Xiaoling，Guo Weimin，Duan Xiaohui，Xu Bo，Sun Xiaoming，Yi Geping
General Hospital of Jinan Military Command，Jinan，250031
OBJECTIVE To investigate the clinical significance of platelet activation in childhood primary nephrotic syndrome(NS)with the hypercoagulabe state.
METHODOLOGY This study included 38 children of primary NS and 20 healthy children as the control.Platelet alpha-granule membrane protein(CD62P)，platelet lysosomal membrane glycoprotein(CD63)and thrombopondin(TSP)were measured with flow-cytometry.Markers of damaged vascular endothelial cells，indices of coagulation，anticoagulation and fibrinolysis were determined.The parameters of NS children in relapse were compared with those of NS children in remission and the control.
, http://www.100md.com
RESULTS The expression rates of platelet CD62P，CD63 and TSP of NS children in relapse were significantly increased as compared to those of NS children in remission and the control.It was found that the expression of CD62P or CD63 was positively correlated with PAgT，concentration of vascular hemophilia factor(VWF)，plasminogen activator inhibitor(PAI)and fibrin degradation products (9FDP)contents.A negative correlation was found between CD62P or CD63 and antithrombin-Ⅲ agent (AT-Ⅲ：Ag)and antithrombin-Ⅲ activity (AT-Ⅲ：ac).TSP was found positively related to VWF and PAI.
, http://www.100md.com
CONCLUSION CD62P and CD63 can be used as sensitive markers in the early monitoring of the hypercoagulable state in children of primary nephrotic syndrome.
Key words platelet nephrotic syndrome hypercoagulable state
近年来研究证实，肾病综合征常合并高凝状态，易形成血栓，是影响疾病预后的重要因素之一[1]，本研究采用流式细胞仪，检测了38例原发性肾病综合征(NS)患儿外周血血小板α-颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)，同时观察了血管内皮细胞标志、凝血、抗凝及纤溶指标的改变，以探讨NS患儿血小板活化对高凝状态的意义。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 1997年1月以来收治的NS患儿共38例，年龄1岁半～12岁，病程1周～6年。诊断均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组关于NS诊断标准的修订方案，其中单纯性肾病(SNS)26例，男17例，女9例；肾炎性肾病(NNS)12例，男8例，女4例；20例健康儿为正常对照组，其中男12例，女8例，年龄2～12岁。
1.2 方法
1.2.1 CD62P、CD63及TSP测定 EDTA抗凝血2ml，800r/min，5min，取上层血清即为富含血小板血清，调整血小板至109/L，分别加入荧光单抗(法国国际免疫公司提供)，按我院流式细胞室操作规程在FACScan型流式细胞仪上(美国BD公司生产)测试。
1.2.2 主要凝血、抗凝及纤溶指标的检测 3.8%枸橼酸钠抗凝血3 ml，用比浊法(以ADP为诱导剂)在高能双通道血液凝集仪上测定血小板聚集活性(PAgT)；免疫火箭电泳法测定血管性假血友病因子(VWF：Ag)、抗凝血酶-Ⅲ含量(AT-Ⅲ：Ag)；抗凝血酶-Ⅲ活性(AT-Ⅲ：ac)采用免疫扩散法；组织纤溶酶原激活物活性(tPA：ac)及纤溶酶原激活抑制物活性(PAI：ac)采用发光底物法；纤维蛋白降解产物(FDP)采用乳胶法。
, http://www.100md.com
1.2.3 统计学方法 采用方差分析、两两比较采用q检验及直线相关分析。
2 结 果
2.1 NS患儿血小板活化标志及PAgT、VWF的改变 NS患儿外周血血小板CD62P、CD63及TSP在肾病期明显增高，缓解期降低，与PAgT、VWF的改变见表1。
表1 NS患儿血小板活化标志及PAgT、VWF改变(
±s，%) 组别n
CD62P
CD63
TSP
, 百拇医药
PAgT
VWF
活动期
38
5.01±3.02**△△
4.16±2.05**△△
3.59±1.75**△△
63.0±11.3*△
154.1±42.3**
缓解期
, 百拇医药
31
1.93±1.06
2.13±1.28
2.23±1.11
55.2±13.3
125.8±29.8
对照组
20
1.82±133
2.11±1.25
2.24±2.11
51.5±11.2
, 百拇医药
106.6±17.8
F值
21.02
11.10
8.50
7.02
14.9
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01 与缓解期比较：△P<0.05 △△P<0.012.2 NS患儿凝血、抗凝及纤溶指标的改变 见表2。
表2 NS患儿其他抗凝及纤溶指标的改变(
±s) 组别, http://www.100md.com
n
AT-Ⅲ：Ag(mg/L)
AT-Ⅲ：ac(%)
tPA：ac(×103U/L)
PAI：ac(×103U/L)
FDP(mg/L)
活动期
38
29.2±5.0**
68.1±12.0**△△
, http://www.100md.com
0.67±0.07
10.1±1.2*
13.6±4.7**△△
缓解期
31
39.9±8.1
99.0±21.4
0.72±0.18
8.9±1.4
6.9±2.9
对照组
20
, 百拇医药
37.8±5.4
96.0±18.5
0.74±0.17
7.0±1.8
6.3±2.7
F 值
11.36
9.05
1.55
5.86
14.6
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01 与缓解期比较：△P<0.05，△△P<0.012.3 血小板活化标志与其它凝血、纤溶等指标的相关关系 CD62P、CD63与VWF、PAgT、PAI、FDP呈明显正相关，与AT-Ⅲ：Ag，AT-Ⅲ：ac呈明显负相关；TSP与VWF、PAI呈正相关(见表3)。
, 百拇医药
表3 血小板活化标志与凝血、纤溶指标的相关关系(r值) 活化标志
PAgT
VWF
AT-ⅢAg
ATⅢ-：ac
tPA：ac
PAI：ac
FDP
CD62P
0.486**
0.492**
, 百拇医药 0.406**
0.389**
0.236
0.452**
0.370*
CD63
0.438**
0.386**
0.362*
0.356*
, 百拇医药
0.258
0.380**
0.312*
TSP
0.260
0.320*
0.240
0.209
0.198
0.279*
0.208
*P<0.05，**P<0.013 讨 论
, http://www.100md.com
在某些因素的作用下，与血栓形成相关的凝血蛋白、抗凝蛋白、纤溶因子、血小板及血管内皮细胞发生了变化，表现出某些特征或释放出某些产物，利用先进的技术和灵敏的方法检测，可以特异地反映高凝状态。血小板被激活时，原存于静止血小板胞浆内α-颗粒膜上的膜糖蛋白及基质蛋白CD62P和TSP，溶酶体膜糖蛋白CD63，随着活化血小板的“脱颗粒”发生易位，而在血小板膜表面表达，成为血小板活化的良好标志[2，3]。采用流式细胞仪通过荧光单抗直接检测这些分子标志物，比以往检测其代谢产物β-血小板球蛋白、血小板第4因子灵敏度高、特异性强。本组研究结果显示，NS患儿肾病期CD62P、CD63及TSP均增高，表明NS肾病期血小板高度活化；我们同时观察到凝血指标PAgT、VWF明显增高，抗凝指标AT-Ⅲ：Ag及AT-Ⅲ：ac显著降低，提示NS肾病期血液高凝；而tPA呈降低趋势，PAI、FDP明显增高，提示机体纤溶能力差，有微血栓形成及继发纤溶现象；此外，VWF、PAI增高尚提示存在血管内皮细胞损伤。
CD62P、CD63及TSP与凝血、抗凝、纤溶及血管内皮细胞损伤指标存在不同程度的相关关系，我们还观察到NS肾病期全血比粘度、血浆比粘度增高，与血小板活化标志呈正相关(资料未显示)，表明血小板是否活化及其程度可以判断体内有无血液高凝及血栓形成倾向，可作为高凝状态的敏感指标。
, http://www.100md.com
在三种血小板活化标志中，以CD62P与各项凝血、纤溶指标相关性最好，而在正常对照组外周血血小板中表达率最低，故认为CD62P敏感性及特异性最强，可作为反映NS患儿血小板活化，判断高凝状态的最佳指标，这与吴国新等[4]报道相符；TSP与各项凝血、纤溶指标相关性较差，提示敏感性欠佳，但TSP与血管内皮细胞损伤标志存在正相关关系，又主要在肾炎型肾病中高表达(另文报道)，其相互间关系及意义有待进一步研究；CD63与各项凝血、纤溶指标存在一定的相关关系，而且与CD62P的表达呈明显正相关(r＝0.516)，故认为CD63对判断NS时血小板活化程度亦有较好的临床价值。CD62P、CD63及TSP的阳性细胞表达率随NS的缓解而接近正常，与其它凝血、纤溶及血液流变学等指标的改变相一致，提示血小板活化与肾病时高凝状态的发生有关，是影响肾病预后的重要因素，动态观察CD62P、CD63的改变，有助于早期诊断NS时高凝状态，监测病情变化及抗血小板活性药、抗凝剂的使用。
*济南空军医院
, http://www.100md.com
参考文献
1 Liach F.Hypercoagulability，renal vein thrombosis and other thrombotic complication of nephrotic syndrome.Kidney int，1985；28：429
2 Sedlmayr P，Grobhaupt B，Muntean W et al.Flow cytometric detection intracelluar platelet
antigens.Cytometry，1996；23：284
3 Abrams C，Shatttil SJ.Immunological detection of activated platelets in clinical disorders.Thromb Heamostas，1992；68：378
4 吴国新，阮长耿.检测体外血小板活化程度时4种血小板表面活化标志蛋白的比较.苏州医学院学报，1993；13(1)：263
收稿日期：1998-11-26，修回日期：1999-01-04
本文编辑 刘启成, 百拇医药(白晓玲 郭卫民* 段晓辉 许 波 孙晓明 尹格平)