褪黑素在急性肾缺血再灌注损伤中的防治作用及其对细胞凋亡的影响
作者：陈 敏 郭仁寿 陈重义 张龙江 许家琪 余立平
单位：湖北医科大学附属第二医院儿科 武汉,430071
关键词：急性缺血再灌注损伤；细胞凋亡；褪黑素
肾脏病与透析肾移植杂志990109 摘 要 目的：探讨急性肾缺血再灌注损伤(ARⅠ)的机制及其与细胞凋亡的关系以及褪黑素(MEL)对ARⅠ的保护作用。 方法：用动脉夹夹闭大鼠双侧肾蒂45min再灌注24h的手术方法制成ARⅠ动物模型，将动物分为假手术对照组、手术组、维生素C预防组、MEL不同剂量预防组，动态检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、肾组织光镜、电镜形态学观察及DNA电泳分析。结果：手术组BUN、Cr升高、SOD、GSH-Px下降，MDA上升，形态学显示肾小管细胞发生凋亡。MEL预防用药能不同程度地逆转上述改变，防止凋亡的发生，效应呈剂量依赖性，且较已知的抗氧化剂作用更明显。 结论：氧自由基(OFR)是ARⅠ的主要机制之一，ARⅠ确实存在着细胞凋亡的病理改变。MEL预防用药能减轻ARⅠ，减少细胞凋亡的发生，效应呈剂量依赖性。
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THE PROTECTIVE EFFECT OF MELATONIN IN ACUTE ISCHEMIA REPERFUSION RENAL INJURY
Chen Min，Cuo Renshou，Chen Zhongyi，Zhang Nongjing，Xu Jiaqi，Yu Liping，Department of Pediatrics，the Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Wuhan，430071
OBJECTIVE To investigate the protective effects of melatonin in acute ischemia reperfusion renal injury in rat model.
METHODOLOGY A rat model of acute ischemia reperfusion renal injury was established by bilateral renal pedical occlusion for 45 minutes followed by reperfusion for 24 hours in SD rats.Rats in the treatment groups were administered with melatonin(0.3 mg/kg，0.95 mg/kg，3.0 mg/kg)30 minutes prior to operation.This study was controlled with sham-operation group，operation group，and vitamin C administered group.Blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，blood superoxide dismutase(SOD)，glutathoine peroxiase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)were determined.Apoptosis was detected by both light and electron microscopy.Agarose gel electrophoresis of DNA isolated from rats′kidney was analyzed.
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RESULTS (1)As compared to the sham-operation group，BUN，Cr and MDA were significantly increased，while SOD and GSH-Px were decreased in the operation group.Pathological changes of apoptosis and typical “ladder pattern”of 180-200bp DNA fragments were observed in the operation group.(2)As compared to the operation group and vitamin C administered group，the changes of BUN，Cr，MDA，SOD and GSH-Px were reversed to some degrees in a dose-dependent manner.The numbers of apoptotic cells were less in the melatonin groups than that of the operation group.No “ladder pattern”of in the gel electrophoresis of DNA was found in the treatment groups.
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CONCLUSION Free oxygenate radicals may be involved in renal tubular cell apoptosis in the acute ischemia reperfusion renal injury model.Melatonin protects the kidney from acute ischemia reperfusion renal injury through a mechanism in which renal tubular cell apoptosis is reduced.The protective effect of melatonin is dose-dependent and greater than that of vitamin C.
Key words acute renal ischemia reperfusion injury apoptosis melatonin
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已有文献报道，肾缺血再灌注损伤伴随着氧自由基(OFR)的产生增加和氧化损伤，其形态学改变不仅仅是肾小管坏死，还有另一种类型——细胞凋亡[1]，但关于肾缺血再灌注损伤、OFR与细胞凋亡的实验研究未见报道。近十年来，褪黑素[2](MEL)在国外已成为一个研究热点，特别是关于其抗氧化作用方面的研究，但在国内尚未见相关报道。本研究用夹闭大鼠双侧肾蒂造成肾缺血再灌注损伤的动物模型，探讨肾缺血再灌注损伤、OFR与细胞凋亡的关系及褪黑素对肾缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 褪黑素为Sigma公司产品。尿素氮试剂盒由元生生物科技有限公司生产。血肌酐试剂盒由上海科华诊断用品公司生产。氧化型谷胱甘肽(GSSG)为上海伯奥生物科技公司产品。5，5’-二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)、硫代巴比妥酸(TBA)为Sigma公司产品。蛋白酶K购于华美公司。PCR marker(目录号MG0781)为SABC公司产品。
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1.2 肾缺血再灌注动物模型的制作[3] SD大鼠，健康、成年、雄性，体重230～260g，由湖北医科大学动物实验中心提供。手术时间选在每天8∶00～17∶00。经1%戊巴比妥纳35～40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，内眦静脉采血作实验前酶学和生化指标检测。俯卧位固定，消毒。于脊柱旁双侧肾区切口，暴露双侧肾脏，钝性分离肾周组织，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂，造成双肾缺血，45min后松开动脉夹，实行再灌注，肉眼可见肾脏由暗红色变为鲜红，表明再灌注成功。缝合伤口后喂养24h，自由摄取水和食物，自然光照。24h后戊巴比妥钠麻醉，内眦静脉采血，作酶学和生化指标检测。活体摘取左肾，送光镜HE染色、电镜观察及DNA分析。假手术对照组在麻醉、采血后，以相同的手术方法切开，暴露出双侧肾脏并分离肾周组织，不夹闭双侧肾蒂，其余处理与手术组相同。
1.3 实验分组 36只SD大鼠，随机分为6组(n＝6)：①假手术对照组；②手术对照组：缺血前30min腹腔注射生理盐水0.3ml作为阴性对照；③手术+维生素C组：按150 mg/kg计算，用生理盐水稀释成0.3ml，于缺血前30min腹腔注射作为阳性对照：④～⑥手术+MEL不同剂量组，先以95%乙醇将MEL配成20mmol/L的母液，临用前按MEL0.3 mg/kg、0.95 mg/kg、3.0 mg/kg三个剂量，以生理盐水稀释成0.3ml于缺血前30min腹腔注射。
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1.4 观察指标
1.4.1 肾功能检测 BUN、Cr用酶法，日本岛津(SHIMADZU)全自动生化分析仪CL-7200测试。
1.4.2 血MDA测定[4]：TBA法，血SOD测定[5]：邻苯三酚法，血GSH-Px[6]：改良的Hafeman直接法。
1.4.3 光镜观察 左肾组织腹面半个肾组织，下极楔形切除约0.3cm3，剩余部分置于4%福尔马林溶液中固定，常规切片(4μm)，作HE染色在HB-2型Olympus光学显微镜下观察其组织学改变。
1.4.4 电镜观察 将从左肾腹侧面半个肾组织下极楔形切下的包括皮质和髓质的肾组织，立即放入2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定，1%锇酸再固定，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，日立-H600型透射电镜下观察。
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1.4.5 肾组织DNA提取及电泳鉴定[7] 按组织DNA常规提取法提取肾组织DNA，在1.8%琼脂糖凝胶电泳板上进行水平微型电泳，泳毕取出凝胶，用紫外灯观察分析，拍照。
1.5 统计学方法 计量资料结果用
±s表示，进行方差分析，q检验。
2 结 果
2.1 肾功能
2.1.1 肾缺血再灌注前各组BUN、Cr水平 如表1所示，各组间比较均无统计学差异。
表1 肾缺血再灌注前后各组BUN、Cr水平(±s) 组别
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术前
术后
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
假手术对照组
10.60±4.23
50.3±6.25
11.20±3.06
54.10±8.17
手术对照组
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10.80±3.28
51.8±4.96
36.60±4.54△△
118.50±4.60△△
手术+VitC组
10.50±4.42
49.6±6.60
26.05±4.66△△**
90.70±8.50△△**
手术+MEL(0.3mg/kg)组
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10.20±3.56
50.9±5.80
33.47±3.92△△ aa bb
115.90±9.60△△ aa bb
手术+MEL(0.95mg/kg)组
10.58±4.00
50.1±5.93
18.27±3.13△**a＃＃
78.50±10.60△△**＃aa
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手术+MEL(3.0mg/kg)组
11.00±3.98
51.6±6.30
13.48±2.69**＃＃
60.22±5.78**＃＃
vs假手术对照组 △P<0.05，△△P<0.01；vs手术对照组 **P<0.01；vs手术+VitC组 ＃P<0.05 ＃＃P<0.01 ；vs手术+MEL(3.0mg/kg)组 aP<0.05 ，aaP<0.01；vs手术+MEL(0.95mg/kg)组 bbP<0.01
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2.1.2 肾缺血再灌注后各组大鼠肾功能变化 (如表1所示)，假手术不引起肾功能的改变，术前术后差异不显著(P>0.05)。缺血再灌注引起肾功能明显损伤，手术组BUN、Cr与假手术对照组相比，差异非常显著(P<0.01)。用大剂量维生素C预防，能明显减轻缺血再灌注所致的肾功能损伤，与手术不用药组相比，差异非常显著(P<0.01)。与假手术对照组相比，差异显著，说明VitC部分保护了肾功能。预先给予MEL能保护肾功能，3.0mg/kg和0.95mg/kg均明显有效(P分别为<0.01和<0.05)，0.3mg/kg组无效(P>0.05)。0.95mg/kg与3.0mg/kg比较，差异显著(P<0.05)，说明作用呈剂量依赖性，且3.0mg/kg组与假手术对照组比较，差异不显著，说明MEL 3.0mg/kg基本上能完全保护肾功能。MEL 3.0mg/kg和0.95mg/kg组肾功能损伤程度较维生素C组轻(P<0.01、P<0.05)。
2.2 血MDA、SOD、GSH-Px 肾缺血再灌注前各组血SOD、GSH-Px、MDA比较，各组间差异均不显著。
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肾缺血再灌注后各组MDA、SOD、GSH-Px的变化(如表2所示)：假手术对照组，术前术后比较差异不显著(P>0.05)。缺血再灌注引起MDA升高，SOD、GSH-Px下降，与假手术对照组比较差异均非常显著(P<0.01)。维生素C预防用药，能够部分减轻缺血再灌注所致的氧化损伤，部分减少了MDA的生成，减少了SOD和GSH-Px的消耗，与手术不用药组相比，差异显著(P<0.01～P<0.05)，与假手术对照组相比差异亦非常显著。MEL预防用药能够部分逆转缺血再灌注损伤所致的MDA、SOD、GSH-Px的改变，作用呈剂量依赖性，0.3mg/kg组作用不明显，与手术非用药组相比，除GSH-Px外，差异不显著(P>0.05)。其余二组作用明显，分别与手术对照组相比，差异非常显著(P<0.01)，且MEL3.0mg/kg与假手术对照组相比，差异不显著，说明基本上能完全逆转手术所致的SOD、GSH-Px和MDA的改变。MEL不同剂量组间比较，0.3mg/kg组、0.95mg/kg与3.0mg/kg组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)；0.3mg/kg组与0.95mg/kg组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)，说明MEL抗自由基作用呈剂量依赖性。MEL0.95mg/kg、3.0 mg/kg组分别与维生素C组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)。具体数据见表2。
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表2 肾缺血再灌注后各组大鼠血SOD、GSH-Px、MDA水平(±s) 组别
SOD(U/gHb)
GSH-Px(kU/L)
MDA(μmol/L)
假手术对照组
6557.17±573.19
64.87±5.46
10.12±0.98
手术对照组
4419.17±450.84△△
, 百拇医药
34.84±2.96△△
16.73±1.35△△
手术+VitC组
5250.98±491.19△△*
47.12±5.90△△**
14.53±1.14△△**
手术+MEL(0.3mg/kg)组
4924.5±479.47△△ aa bb
, 百拇医药 43.07±3.72△△ aabb*
16.38±1.27△△ aa bb
手术+MEL(0.95mg/kg)组
5970.82±307.51△**a＃
51.32±6.06△△**aa
12.69±1.30△△aa＃
手术+MEL(30mg/kg)组
6591.66±440.50**＃＃
, 百拇医药
63.71±10.67**＃＃
10.41±1.03**＃＃
vs假手术对照组 △P<0.05，△△P<0.01；vs手术对照组*P<0.05 **P<0.01；vs手术+VitC组＃P<0.05＃＃P<0.01 ；vs手术+MEL(3.0mg/kg)组aP<0.05 ，aaP<0.01；vs手术+MEL(0.95mg/kg)组bP<0.01bbP<0.01
2.3 形态学改变
2.3.1 光镜观察结果 左肾组织经常规HE染色光镜下见假手术对照组肾小球、肾小管结构正常，手术组部分肾小球内可见红细胞增多，部分肾小管细胞出现混浊肿胀，管腔内出现蛋白管型，但没有炎性细胞浸润及坏死灶。维生素C组病变程度较不用药组减轻。MEL用药各组病变程度较不用药组有不同程度的减轻。
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2.3.2 电镜观察结果 假手术对照组电镜下肾小球结构清晰，滤过膜完整，上皮细胞足突排列有序，无融合。肾小管细胞微绒毛结构清晰、完整，内质网、线粒体结构正常，细胞核近似圆形，核仁清晰，常染色质在镜下呈现出浅亮区，异染色质电子密度稍高。
手术对照组电镜下肾小球结构正常，滤过膜完整，足突无融合。肾小管部分细胞结构正常，其间可见单个存在的凋亡细胞。凋亡细胞核染色质致密，成团块状并附在内核膜上，核的形态也随之发生弯曲，核膜完整，细胞膜完整，无破裂、溶解。细胞器病变相对较轻。
MEL预防用药(3.0mg/kg)组电镜下肾小球结构正常，滤过膜完整，上皮细胞足突无融合。肾小管细胞绝大部分结构正常或基本正常，细胞核、线粒体、微绒毛结构正常。
2.4 DNA电泳结果 手术对照组(C带)，出现了五条清晰的DNA片段，片段大小分别在180bp、360bp、540bp、720bp、900bp。手术+MEL(0.3 mg/kg)组(E带)出现了三条DNA片段，大小分别在180bp、360bp、540bp，说明这两组的DNA出现了片段化，片段大小约为180～200bp的倍数，其余各带为大分子DNA带型。没有坏死组织的拖尾条带(附图)，说明手术组和MEL(0.3mg/kg)组出现了较多的凋亡细胞。
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附图 DNA电泳结果
A.假手术对照组；B.手术+VitC组；C.手术对照组；D.手术+MEL(0.95mg/kg)组；E.手术+MEL(0.3mg/kg)组；F.手术+MEL(3.0mg/kg)组；M.Markes参考片段
3 讨 论
3.1 缺血再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭(IARF)的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素。造成缺血再灌注损伤的相关因素很多，OFR一直是人们所关注的主要因素之一。本实验用无损伤动脉夹夹闭大鼠双侧肾蒂45min后再灌注24h，导致血清BUN、Cr与假手术对照组相比成数倍增高(P<0.01)，造成肾急性缺血再灌注损伤，同时血中MDA升高、抗氧化酶SOD、GSH-Px下降，与假手术对照组相比差异非常显著(P<0.01)，SOD、GSH-Px为内源性抗氧化酶，具有清除OFR和保护组织细胞免受氧化损伤的作用。MDA为细胞脂质过氧化产物之一，可反映机体的氧化损伤状态。缺血再灌注后，SOD、GSH-Px下降，MDA上升，间接说明在这一过程中，OFR大量产生，内源性抗氧化物消耗，细胞发生脂质过氧化损伤，结果显示BUN、Cr增高的程度与MDA增加，SOD、GSH-Px下降的程度相一致，间接说明了缺血再灌注损伤所致的急性肾功能衰竭至少部分是由于OFR损伤的后果。大量的OFR对机体会产生严重损害，使DNA变性，蛋白质氧化，脂质过氧化，严重的导致细胞死亡。
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3.2 传统观点认为肾缺血再灌注损伤所致的IARF是肾小管上皮细胞发生坏死的结果。Schumer[1]于1992年报道了肾小管上皮细胞在缺血再灌注损伤后的另一种死亡类型——细胞凋亡，国内学者廖洪军[3]等也有类似的报道。本实验电镜显示，手术组确实可见一定数量的凋亡细胞，而假手术对照组，手术+MEL(3.0mg/kg)组均没有凋亡细胞。DNA电泳显示手术组及手术+MEL(0.3mg/kg)组出现了约180bp的梯状条带，说明此种实验条件下确实存在肾小管细胞凋亡，此二组的肾功能损害程度、抗氧化物降低，MDA增高的程度与其余各组比较差异明显，(P<0.05～P<0.01)。说明此种条件下的肾功能不全是细胞凋亡所致，而此时的细胞凋亡很可能为OFR所诱导。关于细胞凋亡目前还没有一个很理想的精确定量分析方法。DNA凝胶电泳所呈现的DNA“阶梯状”条带，是细胞凋亡的特征性改变，是一种定性分析方法。但从理论上讲，某一段bp的DNA只有达到一定的量才能在凝胶电泳上显带，也就是说电泳带上没有“阶梯状”条带，说明样本中没有凋亡细胞或凋亡细胞很少，借此可以对各样本作一粗略比较，本实验结果显示抗氧化剂预防用药能够预防或减少细胞凋亡的发生。
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3.3 MEL[2]是松果体合成、分泌的神经内分泌激素，有多种生物学功能。化学名称是N-乙酰-5甲氧基色胺，已能人工合成。近十年来其抗氧化作用得到深入研究。它能中和羟自由基(*OH)和过氧化自由基(ROO.)，直接发挥其抗氧化作用，还可以激活GSH-Px、抑制NO合成酶的活性，从而减少了.OH和NO.的产生，起到了间接抗氧化的作用，是迄今为止已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂。1996年Uz[8]报道了MEL对神经元细胞凋亡的预防保护作用。本实验结果显示，MEL预防用药后，不同程度地减轻了肾功能的损害，逆转了肾缺血再灌注所致的MDA上升和SOD、GSH-Px的下降，效应呈剂量依赖性，MEL 3.0mg/kg几乎能完全保护肾功能，完全逆转手术造成的MDA升高和SOD、GSH-Px的下降。且MEL 0.95mg/kg和3.0mg/kg组作用，较已知的抗氧化剂维生素C作用更明显，证实了MEL具有很强的抗氧化作用。同时MEL能够保护肾小管上皮细胞，减少缺血再灌注所致的细胞凋亡的发生，这一结果支持抗氧化剂能够抑制细胞凋亡的假说。由于MEL抗氧化作用强，靶器官多样，目前还没有发现严重副作用，它很可能成为一种应用广泛的很有前途的新药。
, 百拇医药
参考文献
1 Schumer M，Col?mbel MC，Sawchuk TS et al.Morphologic，biochemical and molecular evidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia.Am J Pathol，1992；140：831
2 Reiter RJ，Metchiorri D，Sewerynek E et al.A review of the evidence supporting melatonins role as an antioxidant.J Pineal Res，1995；18：1
3 廖洪军，陈香美，崔世维.缺血性肾损伤中程序化细胞死亡形态及分子特征.肾脏病与透析肾移植杂志，1994，3(5)：262
, http://www.100md.com
4 八木国夫.过酸化脂质的测定.临床检验，1979；23：114
5 黄维嘉，陈宏础，黄天禄等.邻苯三酚自氧化抑制法测定人红细胞超氧化物歧化酶.中华医学检验杂志，1989；12：206
6 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16：29
7 成 军主编.程序性细胞死亡与疾病.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1997.
8 Uz T，Ciusti P，Franceschini D et al.Protective effect of melatonin against hippocampal DNA damage induced by intraperitancal administration of kainate to rats.Neuroscience，1996；73(3)：631
收稿日期：1998-9-26，修回日期：1998-12-18, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第二医院儿科 武汉,430071
关键词：急性缺血再灌注损伤；细胞凋亡；褪黑素
肾脏病与透析肾移植杂志990109 摘 要 目的：探讨急性肾缺血再灌注损伤(ARⅠ)的机制及其与细胞凋亡的关系以及褪黑素(MEL)对ARⅠ的保护作用。 方法：用动脉夹夹闭大鼠双侧肾蒂45min再灌注24h的手术方法制成ARⅠ动物模型，将动物分为假手术对照组、手术组、维生素C预防组、MEL不同剂量预防组，动态检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、肾组织光镜、电镜形态学观察及DNA电泳分析。结果：手术组BUN、Cr升高、SOD、GSH-Px下降，MDA上升，形态学显示肾小管细胞发生凋亡。MEL预防用药能不同程度地逆转上述改变，防止凋亡的发生，效应呈剂量依赖性，且较已知的抗氧化剂作用更明显。 结论：氧自由基(OFR)是ARⅠ的主要机制之一，ARⅠ确实存在着细胞凋亡的病理改变。MEL预防用药能减轻ARⅠ，减少细胞凋亡的发生，效应呈剂量依赖性。
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THE PROTECTIVE EFFECT OF MELATONIN IN ACUTE ISCHEMIA REPERFUSION RENAL INJURY
Chen Min，Cuo Renshou，Chen Zhongyi，Zhang Nongjing，Xu Jiaqi，Yu Liping，Department of Pediatrics，the Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Wuhan，430071
OBJECTIVE To investigate the protective effects of melatonin in acute ischemia reperfusion renal injury in rat model.
METHODOLOGY A rat model of acute ischemia reperfusion renal injury was established by bilateral renal pedical occlusion for 45 minutes followed by reperfusion for 24 hours in SD rats.Rats in the treatment groups were administered with melatonin(0.3 mg/kg，0.95 mg/kg，3.0 mg/kg)30 minutes prior to operation.This study was controlled with sham-operation group，operation group，and vitamin C administered group.Blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，blood superoxide dismutase(SOD)，glutathoine peroxiase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)were determined.Apoptosis was detected by both light and electron microscopy.Agarose gel electrophoresis of DNA isolated from rats′kidney was analyzed.
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RESULTS (1)As compared to the sham-operation group，BUN，Cr and MDA were significantly increased，while SOD and GSH-Px were decreased in the operation group.Pathological changes of apoptosis and typical “ladder pattern”of 180-200bp DNA fragments were observed in the operation group.(2)As compared to the operation group and vitamin C administered group，the changes of BUN，Cr，MDA，SOD and GSH-Px were reversed to some degrees in a dose-dependent manner.The numbers of apoptotic cells were less in the melatonin groups than that of the operation group.No “ladder pattern”of in the gel electrophoresis of DNA was found in the treatment groups.
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CONCLUSION Free oxygenate radicals may be involved in renal tubular cell apoptosis in the acute ischemia reperfusion renal injury model.Melatonin protects the kidney from acute ischemia reperfusion renal injury through a mechanism in which renal tubular cell apoptosis is reduced.The protective effect of melatonin is dose-dependent and greater than that of vitamin C.
Key words acute renal ischemia reperfusion injury apoptosis melatonin
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已有文献报道，肾缺血再灌注损伤伴随着氧自由基(OFR)的产生增加和氧化损伤，其形态学改变不仅仅是肾小管坏死，还有另一种类型——细胞凋亡[1]，但关于肾缺血再灌注损伤、OFR与细胞凋亡的实验研究未见报道。近十年来，褪黑素[2](MEL)在国外已成为一个研究热点，特别是关于其抗氧化作用方面的研究，但在国内尚未见相关报道。本研究用夹闭大鼠双侧肾蒂造成肾缺血再灌注损伤的动物模型，探讨肾缺血再灌注损伤、OFR与细胞凋亡的关系及褪黑素对肾缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 褪黑素为Sigma公司产品。尿素氮试剂盒由元生生物科技有限公司生产。血肌酐试剂盒由上海科华诊断用品公司生产。氧化型谷胱甘肽(GSSG)为上海伯奥生物科技公司产品。5，5’-二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)、硫代巴比妥酸(TBA)为Sigma公司产品。蛋白酶K购于华美公司。PCR marker(目录号MG0781)为SABC公司产品。
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1.2 肾缺血再灌注动物模型的制作[3] SD大鼠，健康、成年、雄性，体重230～260g，由湖北医科大学动物实验中心提供。手术时间选在每天8∶00～17∶00。经1%戊巴比妥纳35～40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，内眦静脉采血作实验前酶学和生化指标检测。俯卧位固定，消毒。于脊柱旁双侧肾区切口，暴露双侧肾脏，钝性分离肾周组织，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂，造成双肾缺血，45min后松开动脉夹，实行再灌注，肉眼可见肾脏由暗红色变为鲜红，表明再灌注成功。缝合伤口后喂养24h，自由摄取水和食物，自然光照。24h后戊巴比妥钠麻醉，内眦静脉采血，作酶学和生化指标检测。活体摘取左肾，送光镜HE染色、电镜观察及DNA分析。假手术对照组在麻醉、采血后，以相同的手术方法切开，暴露出双侧肾脏并分离肾周组织，不夹闭双侧肾蒂，其余处理与手术组相同。
1.3 实验分组 36只SD大鼠，随机分为6组(n＝6)：①假手术对照组；②手术对照组：缺血前30min腹腔注射生理盐水0.3ml作为阴性对照；③手术+维生素C组：按150 mg/kg计算，用生理盐水稀释成0.3ml，于缺血前30min腹腔注射作为阳性对照：④～⑥手术+MEL不同剂量组，先以95%乙醇将MEL配成20mmol/L的母液，临用前按MEL0.3 mg/kg、0.95 mg/kg、3.0 mg/kg三个剂量，以生理盐水稀释成0.3ml于缺血前30min腹腔注射。
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1.4 观察指标
1.4.1 肾功能检测 BUN、Cr用酶法，日本岛津(SHIMADZU)全自动生化分析仪CL-7200测试。
1.4.2 血MDA测定[4]：TBA法，血SOD测定[5]：邻苯三酚法，血GSH-Px[6]：改良的Hafeman直接法。
1.4.3 光镜观察 左肾组织腹面半个肾组织，下极楔形切除约0.3cm3，剩余部分置于4%福尔马林溶液中固定，常规切片(4μm)，作HE染色在HB-2型Olympus光学显微镜下观察其组织学改变。
1.4.4 电镜观察 将从左肾腹侧面半个肾组织下极楔形切下的包括皮质和髓质的肾组织，立即放入2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定，1%锇酸再固定，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，日立-H600型透射电镜下观察。
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1.4.5 肾组织DNA提取及电泳鉴定[7] 按组织DNA常规提取法提取肾组织DNA，在1.8%琼脂糖凝胶电泳板上进行水平微型电泳，泳毕取出凝胶，用紫外灯观察分析，拍照。
1.5 统计学方法 计量资料结果用
±s表示，进行方差分析，q检验。2 结 果
2.1 肾功能
2.1.1 肾缺血再灌注前各组BUN、Cr水平 如表1所示，各组间比较均无统计学差异。
表1 肾缺血再灌注前后各组BUN、Cr水平(
±s) 组别, 百拇医药
术前
术后
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
假手术对照组
10.60±4.23
50.3±6.25
11.20±3.06
54.10±8.17
手术对照组
, 百拇医药
10.80±3.28
51.8±4.96
36.60±4.54△△
118.50±4.60△△
手术+VitC组
10.50±4.42
49.6±6.60
26.05±4.66△△**
90.70±8.50△△**
手术+MEL(0.3mg/kg)组
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10.20±3.56
50.9±5.80
33.47±3.92△△ aa bb
115.90±9.60△△ aa bb
手术+MEL(0.95mg/kg)组
10.58±4.00
50.1±5.93
18.27±3.13△**a＃＃
78.50±10.60△△**＃aa
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手术+MEL(3.0mg/kg)组
11.00±3.98
51.6±6.30
13.48±2.69**＃＃
60.22±5.78**＃＃
vs假手术对照组 △P<0.05，△△P<0.01；vs手术对照组 **P<0.01；vs手术+VitC组 ＃P<0.05 ＃＃P<0.01 ；vs手术+MEL(3.0mg/kg)组 aP<0.05 ，aaP<0.01；vs手术+MEL(0.95mg/kg)组 bbP<0.01
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2.1.2 肾缺血再灌注后各组大鼠肾功能变化 (如表1所示)，假手术不引起肾功能的改变，术前术后差异不显著(P>0.05)。缺血再灌注引起肾功能明显损伤，手术组BUN、Cr与假手术对照组相比，差异非常显著(P<0.01)。用大剂量维生素C预防，能明显减轻缺血再灌注所致的肾功能损伤，与手术不用药组相比，差异非常显著(P<0.01)。与假手术对照组相比，差异显著，说明VitC部分保护了肾功能。预先给予MEL能保护肾功能，3.0mg/kg和0.95mg/kg均明显有效(P分别为<0.01和<0.05)，0.3mg/kg组无效(P>0.05)。0.95mg/kg与3.0mg/kg比较，差异显著(P<0.05)，说明作用呈剂量依赖性，且3.0mg/kg组与假手术对照组比较，差异不显著，说明MEL 3.0mg/kg基本上能完全保护肾功能。MEL 3.0mg/kg和0.95mg/kg组肾功能损伤程度较维生素C组轻(P<0.01、P<0.05)。
2.2 血MDA、SOD、GSH-Px 肾缺血再灌注前各组血SOD、GSH-Px、MDA比较，各组间差异均不显著。
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肾缺血再灌注后各组MDA、SOD、GSH-Px的变化(如表2所示)：假手术对照组，术前术后比较差异不显著(P>0.05)。缺血再灌注引起MDA升高，SOD、GSH-Px下降，与假手术对照组比较差异均非常显著(P<0.01)。维生素C预防用药，能够部分减轻缺血再灌注所致的氧化损伤，部分减少了MDA的生成，减少了SOD和GSH-Px的消耗，与手术不用药组相比，差异显著(P<0.01～P<0.05)，与假手术对照组相比差异亦非常显著。MEL预防用药能够部分逆转缺血再灌注损伤所致的MDA、SOD、GSH-Px的改变，作用呈剂量依赖性，0.3mg/kg组作用不明显，与手术非用药组相比，除GSH-Px外，差异不显著(P>0.05)。其余二组作用明显，分别与手术对照组相比，差异非常显著(P<0.01)，且MEL3.0mg/kg与假手术对照组相比，差异不显著，说明基本上能完全逆转手术所致的SOD、GSH-Px和MDA的改变。MEL不同剂量组间比较，0.3mg/kg组、0.95mg/kg与3.0mg/kg组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)；0.3mg/kg组与0.95mg/kg组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)，说明MEL抗自由基作用呈剂量依赖性。MEL0.95mg/kg、3.0 mg/kg组分别与维生素C组比较，差异显著或非常显著(P<0.01～P<0.05)。具体数据见表2。
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表2 肾缺血再灌注后各组大鼠血SOD、GSH-Px、MDA水平(
±s) 组别SOD(U/gHb)
GSH-Px(kU/L)
MDA(μmol/L)
假手术对照组
6557.17±573.19
64.87±5.46
10.12±0.98
手术对照组
4419.17±450.84△△
, 百拇医药
34.84±2.96△△
16.73±1.35△△
手术+VitC组
5250.98±491.19△△*
47.12±5.90△△**
14.53±1.14△△**
手术+MEL(0.3mg/kg)组
4924.5±479.47△△ aa bb
, 百拇医药 43.07±3.72△△ aabb*
16.38±1.27△△ aa bb
手术+MEL(0.95mg/kg)组
5970.82±307.51△**a＃
51.32±6.06△△**aa
12.69±1.30△△aa＃
手术+MEL(30mg/kg)组
6591.66±440.50**＃＃
, 百拇医药
63.71±10.67**＃＃
10.41±1.03**＃＃
vs假手术对照组 △P<0.05，△△P<0.01；vs手术对照组*P<0.05 **P<0.01；vs手术+VitC组＃P<0.05＃＃P<0.01 ；vs手术+MEL(3.0mg/kg)组aP<0.05 ，aaP<0.01；vs手术+MEL(0.95mg/kg)组bP<0.01bbP<0.01
2.3 形态学改变
2.3.1 光镜观察结果 左肾组织经常规HE染色光镜下见假手术对照组肾小球、肾小管结构正常，手术组部分肾小球内可见红细胞增多，部分肾小管细胞出现混浊肿胀，管腔内出现蛋白管型，但没有炎性细胞浸润及坏死灶。维生素C组病变程度较不用药组减轻。MEL用药各组病变程度较不用药组有不同程度的减轻。
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2.3.2 电镜观察结果 假手术对照组电镜下肾小球结构清晰，滤过膜完整，上皮细胞足突排列有序，无融合。肾小管细胞微绒毛结构清晰、完整，内质网、线粒体结构正常，细胞核近似圆形，核仁清晰，常染色质在镜下呈现出浅亮区，异染色质电子密度稍高。
手术对照组电镜下肾小球结构正常，滤过膜完整，足突无融合。肾小管部分细胞结构正常，其间可见单个存在的凋亡细胞。凋亡细胞核染色质致密，成团块状并附在内核膜上，核的形态也随之发生弯曲，核膜完整，细胞膜完整，无破裂、溶解。细胞器病变相对较轻。
MEL预防用药(3.0mg/kg)组电镜下肾小球结构正常，滤过膜完整，上皮细胞足突无融合。肾小管细胞绝大部分结构正常或基本正常，细胞核、线粒体、微绒毛结构正常。
2.4 DNA电泳结果 手术对照组(C带)，出现了五条清晰的DNA片段，片段大小分别在180bp、360bp、540bp、720bp、900bp。手术+MEL(0.3 mg/kg)组(E带)出现了三条DNA片段，大小分别在180bp、360bp、540bp，说明这两组的DNA出现了片段化，片段大小约为180～200bp的倍数，其余各带为大分子DNA带型。没有坏死组织的拖尾条带(附图)，说明手术组和MEL(0.3mg/kg)组出现了较多的凋亡细胞。
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附图 DNA电泳结果
A.假手术对照组；B.手术+VitC组；C.手术对照组；D.手术+MEL(0.95mg/kg)组；E.手术+MEL(0.3mg/kg)组；F.手术+MEL(3.0mg/kg)组；M.Markes参考片段
3 讨 论
3.1 缺血再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭(IARF)的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素。造成缺血再灌注损伤的相关因素很多，OFR一直是人们所关注的主要因素之一。本实验用无损伤动脉夹夹闭大鼠双侧肾蒂45min后再灌注24h，导致血清BUN、Cr与假手术对照组相比成数倍增高(P<0.01)，造成肾急性缺血再灌注损伤，同时血中MDA升高、抗氧化酶SOD、GSH-Px下降，与假手术对照组相比差异非常显著(P<0.01)，SOD、GSH-Px为内源性抗氧化酶，具有清除OFR和保护组织细胞免受氧化损伤的作用。MDA为细胞脂质过氧化产物之一，可反映机体的氧化损伤状态。缺血再灌注后，SOD、GSH-Px下降，MDA上升，间接说明在这一过程中，OFR大量产生，内源性抗氧化物消耗，细胞发生脂质过氧化损伤，结果显示BUN、Cr增高的程度与MDA增加，SOD、GSH-Px下降的程度相一致，间接说明了缺血再灌注损伤所致的急性肾功能衰竭至少部分是由于OFR损伤的后果。大量的OFR对机体会产生严重损害，使DNA变性，蛋白质氧化，脂质过氧化，严重的导致细胞死亡。
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3.2 传统观点认为肾缺血再灌注损伤所致的IARF是肾小管上皮细胞发生坏死的结果。Schumer[1]于1992年报道了肾小管上皮细胞在缺血再灌注损伤后的另一种死亡类型——细胞凋亡，国内学者廖洪军[3]等也有类似的报道。本实验电镜显示，手术组确实可见一定数量的凋亡细胞，而假手术对照组，手术+MEL(3.0mg/kg)组均没有凋亡细胞。DNA电泳显示手术组及手术+MEL(0.3mg/kg)组出现了约180bp的梯状条带，说明此种实验条件下确实存在肾小管细胞凋亡，此二组的肾功能损害程度、抗氧化物降低，MDA增高的程度与其余各组比较差异明显，(P<0.05～P<0.01)。说明此种条件下的肾功能不全是细胞凋亡所致，而此时的细胞凋亡很可能为OFR所诱导。关于细胞凋亡目前还没有一个很理想的精确定量分析方法。DNA凝胶电泳所呈现的DNA“阶梯状”条带，是细胞凋亡的特征性改变，是一种定性分析方法。但从理论上讲，某一段bp的DNA只有达到一定的量才能在凝胶电泳上显带，也就是说电泳带上没有“阶梯状”条带，说明样本中没有凋亡细胞或凋亡细胞很少，借此可以对各样本作一粗略比较，本实验结果显示抗氧化剂预防用药能够预防或减少细胞凋亡的发生。
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3.3 MEL[2]是松果体合成、分泌的神经内分泌激素，有多种生物学功能。化学名称是N-乙酰-5甲氧基色胺，已能人工合成。近十年来其抗氧化作用得到深入研究。它能中和羟自由基(*OH)和过氧化自由基(ROO.)，直接发挥其抗氧化作用，还可以激活GSH-Px、抑制NO合成酶的活性，从而减少了.OH和NO.的产生，起到了间接抗氧化的作用，是迄今为止已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂。1996年Uz[8]报道了MEL对神经元细胞凋亡的预防保护作用。本实验结果显示，MEL预防用药后，不同程度地减轻了肾功能的损害，逆转了肾缺血再灌注所致的MDA上升和SOD、GSH-Px的下降，效应呈剂量依赖性，MEL 3.0mg/kg几乎能完全保护肾功能，完全逆转手术造成的MDA升高和SOD、GSH-Px的下降。且MEL 0.95mg/kg和3.0mg/kg组作用，较已知的抗氧化剂维生素C作用更明显，证实了MEL具有很强的抗氧化作用。同时MEL能够保护肾小管上皮细胞，减少缺血再灌注所致的细胞凋亡的发生，这一结果支持抗氧化剂能够抑制细胞凋亡的假说。由于MEL抗氧化作用强，靶器官多样，目前还没有发现严重副作用，它很可能成为一种应用广泛的很有前途的新药。
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参考文献
1 Schumer M，Col?mbel MC，Sawchuk TS et al.Morphologic，biochemical and molecular evidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia.Am J Pathol，1992；140：831
2 Reiter RJ，Metchiorri D，Sewerynek E et al.A review of the evidence supporting melatonins role as an antioxidant.J Pineal Res，1995；18：1
3 廖洪军，陈香美，崔世维.缺血性肾损伤中程序化细胞死亡形态及分子特征.肾脏病与透析肾移植杂志，1994，3(5)：262
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4 八木国夫.过酸化脂质的测定.临床检验，1979；23：114
5 黄维嘉，陈宏础，黄天禄等.邻苯三酚自氧化抑制法测定人红细胞超氧化物歧化酶.中华医学检验杂志，1989；12：206
6 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16：29
7 成 军主编.程序性细胞死亡与疾病.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1997.
8 Uz T，Ciusti P，Franceschini D et al.Protective effect of melatonin against hippocampal DNA damage induced by intraperitancal administration of kainate to rats.Neuroscience，1996；73(3)：631
收稿日期：1998-9-26，修回日期：1998-12-18, 百拇医药