钙拮抗剂对马兜铃酸Ⅰ所致LLC-PK1细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的作用
作者：高瑞通 郑法雷 刘彦信* 郑德先* 李雪梅 刘 音*
单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科 北京，100730
关键词：细胞凋亡；马兜铃酸；钙拮抗剂
肾脏病与透析肾移植杂志990103 摘 要 目的：研究马兜铃酸I(AAI)所致LLC-PK1细胞凋亡时细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化和钙拮抗剂拉西地平对细胞凋亡的作用。 方法：应用已建立的AAI所致LLC-PK1细胞凋亡模型，使用光镜、Annexin-V-Fluos凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡，经Fluo-3/AM染色，激光扫描共聚焦显微镜测定平均[Ca2+]i。 结果：0.04 g/L的AAI作用24h可致LLC-PK1细胞出现明显细胞凋亡和平均[Ca2+]i显著升高；拉西地平(100 ng/L，1 μg/L)可显著抑制AAI所致的[Ca2+]i升高并能降低凋亡细胞比例。 结论：在体外条件下AAI所致LLC-PK1细胞凋亡的发生可能与[Ca2+]i升高有关；拉西地平可能通过抑制[Ca2+]i升高而抑制AAI所致的凋亡。
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VARIATION OF INTRACELLULAR FREE CALCIUM CONCENTRATION IN ARISTOLOCHIC ACID I INDUCED APOPTOSIS IN LLC-PK1 CELLS AND INHIBITION OF APOPTOTIC DAMAGE BY LACIDIPINE
Gao Ruitong，Zheng Falei，Liu Yanxin，Zheng Dexian，Li Xuemei，Liu Yin
Peking Union Medical College Hospital，Institute of Basic Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing，100730
OBJECTIVE To examine the changes of intracellular free calcium concentration([Ca2+]i)in aristolochic acid I(AAI) induced apoptosis in LLC-PK1 cells，and the effects of Lacidipine(a calcium antagonist)on the changes of [Ca2+]i and apoptosis induced by AAI.
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METHODOLOGY LLC-PK1 cells were treated in different groups：(a)normal，without treatment；(b)with AAI alone(0.04 g/L)；(c)with Lacidipine alone(10，102，103 ng/L)；(d)with AAI(0.04 g/L)plus Lacidipine(10 or 102 or 103 ng/L).Mean[Ca2+]i was measured by laser confocus microscopy using Fluo-3/AM staining.Light microscopy，Annexin-V-Flous apoptosis detection kit and flow cytometry using propidium iodiode staining were used to identify or quantify the apoptosis of LLC-PK1 cell.
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RESULTS AAI-induced apoptosis of LLC-PK1 cells was found to be dose-dependent.Mean[Ca2+]i was significantly higher in cells treated with AAI than that in normal cells (58.01±18.89 vs 22.66±4.78，P<0.001).In group treated with AAI plus Lacidipine (102 or 103ng/L)，mean[Ca2+]i was significantly lower than that treated with AAI alone (35.47±10.16 ，28.55±12.85 vs 58.01±18.89，P<0.001).And the apoptotic cells ratios in group treated with AAI plus Lacidipine (102，103 ng/L)were also significantly lower than that treated with AAI alone(19.0%，27.8% vs 34.7%，P<0.001).
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CONCLUSION The increase of [Ca2+]i in AAI-treated LLC-PK1 cells may be related to AAI-induced apoptosis.Lacidpine may reduce AAI-induced apoptosis by inhibiting increase of [Ca2+]i in LLC-PK1 cell.
Key words apoptosis aristolochic acid calcium antagonist
近十几年研究表明，肾间质纤维化的发生和发展在慢性肾功能衰竭的发展中起着关键作用[1，2]。不仅慢性肾小管-间质病变，而且中晚期肾小球病变中都有广泛肾间质纤维化存在。因此，关于肾间质纤维化的研究受到许多肾脏病学者的高度重视。近年来，国外文献报道个别中草药或减肥药可引起肾功能损害，主要表现为急性进展性肾间质纤维化(Rapidly Progressive Renal Interstitial Fibrosis)，并将此类肾疾患称为所谓“中草药肾病”(“Chinese Herbs Nephopathy”)[3，4]。据初步研究，此类肾疾患主要由马兜铃酸(Aristolochic Acid，AA)的肾毒作用所引起，因此我们认为应将此类肾疾患称为马兜铃酸肾病(AA Nephropathy，AAN)。由于AAN进展迅速，一年或数年内即可发展为终末期肾功能衰竭，危害较大，因此研究其发生机制及相应的防治方法很有必要，对认识肾间质纤维化的机制及慢性肾衰的预防也有其重要意义。目前关于AAN机制的研究报告极少。我们的动物实验结果初步表明，马兜铃酸所致的急性和慢性肾功能损害均可能与细胞凋亡有关[5]。此后，我们建立了体外条件下马兜铃酸I(AAI)诱导猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1细胞凋亡的模型[6]。目前国内外文献中尚未发现有关于AA肾毒性体外试验的研究报告。本文通过观察AAI所致LLC-PK1细胞凋亡时平均细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i的变化，旨在阐明钙拮抗剂拉西地平对细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的作用。
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1 材料和方法
1.1 LLC-PK1细胞系 来自中国医学科学院基础医学研究所分子生物学国家重点实验室。
1.2 试剂和仪器 AAI纯品(北京生物制品研究所)，Annexin-V-Flous apoptosis detection kit(Boehringer Mannheim公司)，FLUO-3/AM分子探针(Sigma公司)，拉西地平纯品(Glaxo公司)，荧光显微镜(NIKON)，流式细胞仪(FACS420型，Becton-Dickinson公司)，激光扫描共聚焦显微镜(TCS-NT，Leica公司)。
1.3 方法
1.3.1 LLC-PK1细胞的培养 LLC-PK1细胞用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养基(10%FCS RPMI 1640)传代培养，培养条件为37℃，5%CO2。
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1.3.2 AAI溶液 准确称量AAI，搅拌溶于10%FCS RPMI 1640使AAI浓度为0.04g/L，0.22μm滤纸滤过灭菌，分装。
1.3.3 拉西地平母液 准确称量拉西地平，搅拌溶于无水乙醇，加入三蒸水，形成乙醇浓度为75%的拉西地平母液(浓度为10μg/L)。不同浓度的拉西地平溶液由拉西地平母液与10%FCS RPMI 1640混合而得。
1.3.4 Fluo-3/AM染色液 Fluo-3/AM溶于二甲基氧砜(DMSO)，浓度为1g/L。
1.3.5 实验分组 LLC-PK1细胞传代24h后，弃去原培养基，作如下分组：①对照组：只加10%FCS RPMI 1640；②AAI组：AAI终浓度为0.04g/L；③拉西地平组：终浓度分别为10ng/L，100ng/L，1μg/L，；④AAI+拉西地平组：AAI浓度为0.04g/L，拉西地平浓度分别为10ng/L，100ng/L，1μg/L。
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1.3.6 平均[Ca2+]i测定 LLC-PK1分组处理24h后，作如下处理：①用无血清RPMI 1640培养基洗2次，加入Fluo-3/AM分子探针(终浓度为5mg/L)；②37℃温育30～60min后，用无血清RPMI 1640培养基洗一次；③立即于激光扫描共聚焦显微镜下观察，每组随机取3～5个视野，计算总荧光值。
1.3.7 LLC-PK1细胞形态学观察 分组处理后，每隔4h观察细胞形态学改变，24h后于倒置显微镜下观察并照相。
1.3.8 Annexin-V-Flous凋亡检测试剂盒检测 消化并收集细胞，①弃培养基，PBS洗2次；②加入Annexin-V-Flous凋亡检测混合液，避光室温下染色10～15min；③荧光显微镜下观察，照相。
1.3.9 流式细胞仪检测 分组处理24h后，行如下处理：①1500r/min离心10min，收获各组飘浮的细胞和用消化液消化的细胞(约1×106细胞)；②去上清，PBS洗2次，1500r/min离心5min；③去上清，回流液悬浮沉淀，反复轻吹使细胞分散成单个，加入足量冰预冷的70%乙醇混匀，4℃固定3h以上；④1500r/min离心5min，去上清，加入PBS洗2次，1500r/min离心2min；⑤去上清，回流液约0.3～0.5ml混匀细胞；⑥加入RNase(终浓度为50 mg/L)，37℃消化1h；⑦加入碘化丙啶(PI，终浓度为50mg/L)；⑧200目尼龙网过滤；⑨流式细胞仪分析。
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1.4 统计方法 组间平均[Ca2+]i的比较用方差分析，组间凋亡细胞比例的比较用χ2检验。P<0.05表示有统计学上的显著差异。
2 结 果
2.1 AAI所致LLC-PK1细胞凋亡和细胞凋亡时平均[Ca2+]i变化 在体外条件下我们发现0.02g/L，0.04g/L，0.08g/L的AAI作用24h可明显诱导LLC-PK1细胞凋亡(凋亡细胞比例分别为5.3%，48.5%，78.7% vs 2.6%)[6]。为了便于试验观察，我们选用0.04 g/L的AAI来诱导LLC-PK1细胞发生凋亡。平均[Ca2+]i由平均荧光强度表示。对照组荧光强度集中于18～30之间，平均值为22.66，最高达37.58。AAI组凋亡细胞内荧光强度明显增高，荧光强度集中于40～80之间，平均值为58.01，最高达120.24。AAI组平均荧光强度显著地高于对照组(58.01±18.89 vs 22.66±4.78，P<0.001)。
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2.2 拉西地平对LLC-PK1细胞的影响 经光镜，Annexin-V-Fluos凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测发现，实验应用的最高浓度乙醇(0.2%)对细胞凋亡无明显影响(凋亡细胞比例7.6% vs 8.3%，P>0.05)。拉西地平浓度为10μg/L时，LLC-PK1细胞发生非凋亡性形态学改变(凋亡细胞比例9.0% vs 8.3%，P>0.05)，出现许多圆形小泡，增殖变慢；浓度为1 μg/L时，未观察到与正常细胞有明显差异(图1)。
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图1 流式细胞仪检测拉西地平对LLC-PK1的影响
a.对照组；b.乙醇对照组(浓度0.2%)；c.拉西地平组(10μg/L)
2.3 拉西地平对平均[Ca2+]i的影响 单用拉西地平(1μg/L)组平均[Ca2+]i较对照组升高(28.06±7.18 vs 22.66±4.78，P<0.05)；AAI处理的细胞同时加入拉西地平终浓度分别为102ng/L，103ng/L时，平均[Ca2+]i均显著地低于AAI组(28.55±10.16，35.47±12.85 vs 58.01±18.89，P<0.001)。加用的拉西地平浓度为10ng/L时，其平均[Ca2+]i与AAI组无明显差异(57.07±20.33 vs 58.01±18.89，P>0.05)(图2)。
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图2 不同处理对LLC-PK1细胞平均[Ca2+]i的影响
c.对照组；9L：拉西地平(1μg/L)组；AA4：AAI(0.04g/L)组；AA4-9L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(1 μg/L)组；AA4-10L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(100ng/L)组；AA4-11L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(10ng/L)组
2.4 拉西地平对AAI所致LLC-PK1凋亡细胞比例的影响 经流式细胞仪分析发现，在AAI处理的LLC-PK1细胞，加用的拉西地平浓度为100 ng/L，1 μg/L时，凋亡细胞比例较AAI组显著地降低(27.8%，19.0% vs 34.7%，P<0.001)；拉西地平浓度为10 ng/L时，与对照组差异不明显(34.5% vs 34.7%，P>0.05)(图3)。
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图3 不同浓度拉西地平对AAI所致LLC-PK1细胞凋亡的比例的影响
c.对照组；AA4：AAI(0.04g/L)组；AA4-9L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(1 μg/L)组；AA4-10L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(100ng/L)组；AA4-11L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(10ng/L)组
3 讨 论
AA所致的肾脏损伤已引起国内外肾脏病学者的重视，但其机制尚不十分清楚。我们的初步研究表明，AA可引起实验动物急、慢性肾小管损伤，而且在体外条件下AAI可诱导猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1发生凋亡，其作用与AAI浓度有关。为了进一步探讨AAI诱导LLC-PK1细胞凋亡的可能机制，本实验应用Fluo-3/AM染色，经激光扫描共聚焦显微镜测定了LLC-PK1细胞平均[Ca2+]i水平，结果提示加AAI后24h的平均[Ca2+]i升高。我们考虑此平均[Ca2+]i升高是由凋亡细胞[Ca2+]i升高所致，这是因为高[Ca2+]i的细胞在显微镜下呈明显的凋亡形态学表现。所以虽然本实验结果不能证明[Ca2+]i升高与细胞凋亡有因果关系，但二者之间必有某种联系。目前关于[Ca2+]i与细胞凋亡的研究倾向于[Ca2+]i升高可能是细胞凋亡机制的最后共同通道的一环[7]。当然，仍存在某些例外如有些细胞内[Ca2+]i升高可抑制凋亡，某些细胞凋亡与[Ca2+]i无明显相关，也许这与所用的条件和方法有关[8～10]。我们认为应研究各种条件下[Ca2+]i变化与凋亡发生的顺序，从而确定[Ca2+]i变化和凋亡有无因果关系。
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由于观察到加入AAI后[Ca2+]i升高，我们选用了一种钙拮抗剂拉西地平来观察其对[Ca2+]i和细胞凋亡是否有某种影响。据文献报告，拉西地平为L型电压依赖性钙通道拮抗剂，通过阻断细胞外钙离子内流而起作用[11]。我们的结果显示，在本实验的特定条件下，一定浓度的拉西地平可降低AAI所致的高[Ca2+]i水平及细胞凋亡的比例，这与我们以前的研究结果(钙拮抗剂氨氯地平可降低庆大霉素引起的高[Ca2+]i水平和凋亡细胞的比例[12]相符，同时也间接地说明AAI所致LLC-PK1细胞凋亡可能是[Ca2+]i升高引起。正常人口服4～8 g/L的拉西地平后，其血药峰值浓度为1.6～5.7μg/L，这与我们得到的对AAI毒性有抑制作用的拉西地平浓度(10ng/L～1μg/L)比较接近，当然，由于实验对象和研究条件不同，这种比较存在着很大的局限性。此外，考虑到拉西地平仅仅作用于L型钙离子通道，所以进行多种类型钙拮抗剂的研究显得较为必要。
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总之，本文在AAI诱导LLC-PK1细胞凋亡模型的基础上，发现AAI可致LLC-PK1细胞的平均[Ca2+]i增高，提示AAI所致的LLC-PK1细胞凋亡可能与[Ca2+]i增高有关，从而为认识AAI致肾毒作用的发生机制提供了新的研究方向。而钙拮抗剂拉西地平可降低AAI所致的高[Ca2+]i水平且能明显抑制细胞凋亡的发生，提示拉西地平可能通过抑制LLC-PK1细胞[Ca2+]i增高而抑制凋亡发生，从而为将来可能的临床治疗提供了一定的理论依据。
*中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所
参考文献
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4 Cosyns JP，Jadoul M，Squifflet JP et al.Chinese herbs nephropathy：a clue to Balkan endemic nephropathy？Kidney Int，1994；45：1680
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6 高瑞通，郑法雷，刘彦信等.马兜铃酸I诱导的LLC-PK1细胞凋亡及其意义(待发表)。
7 Mcconkey DJ，Orrenius S.The role of calcium in the regulation of apoptosis.Leukoc Biol，1996；59：775
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9 Galli C，Meucci O，Scorzeillo A et al.Apoptosis in cerebellar granule cells is blocked by high Kcl forskolin IGF-I through distince mechanismd of action：the involvement of intracellular calcium and RNA synthesis.J Neuro Sci，1995；15(20)：1172
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10 Preston GA，Barrett JC，Biermann JA et al.Effect of alterations in calcium homeostasis on apoptosis during neoplastic progression.Cancer Res，1997；57(3)：537
11 Lee CR，Bryson HM.Lacidipine，a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic potential in the treatment of hypertension.Drugs，1994；Aug，48(2)：274
12 李雪梅，郑法雷，刘彦信等.庆大霉素引起的肾小管上皮细胞LLC-PK1凋亡及细胞内Ca++浓度的变化.中华内科杂志，1998；37(10)：668
1998-12-01收稿 1998-12-20修回, 百拇医药(高瑞通 郑法雷 刘彦信* 郑德先* 李雪梅 刘 音*)
单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科 北京，100730
关键词：细胞凋亡；马兜铃酸；钙拮抗剂
肾脏病与透析肾移植杂志990103 摘 要 目的：研究马兜铃酸I(AAI)所致LLC-PK1细胞凋亡时细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化和钙拮抗剂拉西地平对细胞凋亡的作用。 方法：应用已建立的AAI所致LLC-PK1细胞凋亡模型，使用光镜、Annexin-V-Fluos凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡，经Fluo-3/AM染色，激光扫描共聚焦显微镜测定平均[Ca2+]i。 结果：0.04 g/L的AAI作用24h可致LLC-PK1细胞出现明显细胞凋亡和平均[Ca2+]i显著升高；拉西地平(100 ng/L，1 μg/L)可显著抑制AAI所致的[Ca2+]i升高并能降低凋亡细胞比例。 结论：在体外条件下AAI所致LLC-PK1细胞凋亡的发生可能与[Ca2+]i升高有关；拉西地平可能通过抑制[Ca2+]i升高而抑制AAI所致的凋亡。
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VARIATION OF INTRACELLULAR FREE CALCIUM CONCENTRATION IN ARISTOLOCHIC ACID I INDUCED APOPTOSIS IN LLC-PK1 CELLS AND INHIBITION OF APOPTOTIC DAMAGE BY LACIDIPINE
Gao Ruitong，Zheng Falei，Liu Yanxin，Zheng Dexian，Li Xuemei，Liu Yin
Peking Union Medical College Hospital，Institute of Basic Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing，100730
OBJECTIVE To examine the changes of intracellular free calcium concentration([Ca2+]i)in aristolochic acid I(AAI) induced apoptosis in LLC-PK1 cells，and the effects of Lacidipine(a calcium antagonist)on the changes of [Ca2+]i and apoptosis induced by AAI.
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METHODOLOGY LLC-PK1 cells were treated in different groups：(a)normal，without treatment；(b)with AAI alone(0.04 g/L)；(c)with Lacidipine alone(10，102，103 ng/L)；(d)with AAI(0.04 g/L)plus Lacidipine(10 or 102 or 103 ng/L).Mean[Ca2+]i was measured by laser confocus microscopy using Fluo-3/AM staining.Light microscopy，Annexin-V-Flous apoptosis detection kit and flow cytometry using propidium iodiode staining were used to identify or quantify the apoptosis of LLC-PK1 cell.
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RESULTS AAI-induced apoptosis of LLC-PK1 cells was found to be dose-dependent.Mean[Ca2+]i was significantly higher in cells treated with AAI than that in normal cells (58.01±18.89 vs 22.66±4.78，P<0.001).In group treated with AAI plus Lacidipine (102 or 103ng/L)，mean[Ca2+]i was significantly lower than that treated with AAI alone (35.47±10.16 ，28.55±12.85 vs 58.01±18.89，P<0.001).And the apoptotic cells ratios in group treated with AAI plus Lacidipine (102，103 ng/L)were also significantly lower than that treated with AAI alone(19.0%，27.8% vs 34.7%，P<0.001).
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CONCLUSION The increase of [Ca2+]i in AAI-treated LLC-PK1 cells may be related to AAI-induced apoptosis.Lacidpine may reduce AAI-induced apoptosis by inhibiting increase of [Ca2+]i in LLC-PK1 cell.
Key words apoptosis aristolochic acid calcium antagonist
近十几年研究表明，肾间质纤维化的发生和发展在慢性肾功能衰竭的发展中起着关键作用[1，2]。不仅慢性肾小管-间质病变，而且中晚期肾小球病变中都有广泛肾间质纤维化存在。因此，关于肾间质纤维化的研究受到许多肾脏病学者的高度重视。近年来，国外文献报道个别中草药或减肥药可引起肾功能损害，主要表现为急性进展性肾间质纤维化(Rapidly Progressive Renal Interstitial Fibrosis)，并将此类肾疾患称为所谓“中草药肾病”(“Chinese Herbs Nephopathy”)[3，4]。据初步研究，此类肾疾患主要由马兜铃酸(Aristolochic Acid，AA)的肾毒作用所引起，因此我们认为应将此类肾疾患称为马兜铃酸肾病(AA Nephropathy，AAN)。由于AAN进展迅速，一年或数年内即可发展为终末期肾功能衰竭，危害较大，因此研究其发生机制及相应的防治方法很有必要，对认识肾间质纤维化的机制及慢性肾衰的预防也有其重要意义。目前关于AAN机制的研究报告极少。我们的动物实验结果初步表明，马兜铃酸所致的急性和慢性肾功能损害均可能与细胞凋亡有关[5]。此后，我们建立了体外条件下马兜铃酸I(AAI)诱导猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1细胞凋亡的模型[6]。目前国内外文献中尚未发现有关于AA肾毒性体外试验的研究报告。本文通过观察AAI所致LLC-PK1细胞凋亡时平均细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i的变化，旨在阐明钙拮抗剂拉西地平对细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的作用。
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1 材料和方法
1.1 LLC-PK1细胞系 来自中国医学科学院基础医学研究所分子生物学国家重点实验室。
1.2 试剂和仪器 AAI纯品(北京生物制品研究所)，Annexin-V-Flous apoptosis detection kit(Boehringer Mannheim公司)，FLUO-3/AM分子探针(Sigma公司)，拉西地平纯品(Glaxo公司)，荧光显微镜(NIKON)，流式细胞仪(FACS420型，Becton-Dickinson公司)，激光扫描共聚焦显微镜(TCS-NT，Leica公司)。
1.3 方法
1.3.1 LLC-PK1细胞的培养 LLC-PK1细胞用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养基(10%FCS RPMI 1640)传代培养，培养条件为37℃，5%CO2。
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1.3.2 AAI溶液 准确称量AAI，搅拌溶于10%FCS RPMI 1640使AAI浓度为0.04g/L，0.22μm滤纸滤过灭菌，分装。
1.3.3 拉西地平母液 准确称量拉西地平，搅拌溶于无水乙醇，加入三蒸水，形成乙醇浓度为75%的拉西地平母液(浓度为10μg/L)。不同浓度的拉西地平溶液由拉西地平母液与10%FCS RPMI 1640混合而得。
1.3.4 Fluo-3/AM染色液 Fluo-3/AM溶于二甲基氧砜(DMSO)，浓度为1g/L。
1.3.5 实验分组 LLC-PK1细胞传代24h后，弃去原培养基，作如下分组：①对照组：只加10%FCS RPMI 1640；②AAI组：AAI终浓度为0.04g/L；③拉西地平组：终浓度分别为10ng/L，100ng/L，1μg/L，；④AAI+拉西地平组：AAI浓度为0.04g/L，拉西地平浓度分别为10ng/L，100ng/L，1μg/L。
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1.3.6 平均[Ca2+]i测定 LLC-PK1分组处理24h后，作如下处理：①用无血清RPMI 1640培养基洗2次，加入Fluo-3/AM分子探针(终浓度为5mg/L)；②37℃温育30～60min后，用无血清RPMI 1640培养基洗一次；③立即于激光扫描共聚焦显微镜下观察，每组随机取3～5个视野，计算总荧光值。
1.3.7 LLC-PK1细胞形态学观察 分组处理后，每隔4h观察细胞形态学改变，24h后于倒置显微镜下观察并照相。
1.3.8 Annexin-V-Flous凋亡检测试剂盒检测 消化并收集细胞，①弃培养基，PBS洗2次；②加入Annexin-V-Flous凋亡检测混合液，避光室温下染色10～15min；③荧光显微镜下观察，照相。
1.3.9 流式细胞仪检测 分组处理24h后，行如下处理：①1500r/min离心10min，收获各组飘浮的细胞和用消化液消化的细胞(约1×106细胞)；②去上清，PBS洗2次，1500r/min离心5min；③去上清，回流液悬浮沉淀，反复轻吹使细胞分散成单个，加入足量冰预冷的70%乙醇混匀，4℃固定3h以上；④1500r/min离心5min，去上清，加入PBS洗2次，1500r/min离心2min；⑤去上清，回流液约0.3～0.5ml混匀细胞；⑥加入RNase(终浓度为50 mg/L)，37℃消化1h；⑦加入碘化丙啶(PI，终浓度为50mg/L)；⑧200目尼龙网过滤；⑨流式细胞仪分析。
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1.4 统计方法 组间平均[Ca2+]i的比较用方差分析，组间凋亡细胞比例的比较用χ2检验。P<0.05表示有统计学上的显著差异。
2 结 果
2.1 AAI所致LLC-PK1细胞凋亡和细胞凋亡时平均[Ca2+]i变化 在体外条件下我们发现0.02g/L，0.04g/L，0.08g/L的AAI作用24h可明显诱导LLC-PK1细胞凋亡(凋亡细胞比例分别为5.3%，48.5%，78.7% vs 2.6%)[6]。为了便于试验观察，我们选用0.04 g/L的AAI来诱导LLC-PK1细胞发生凋亡。平均[Ca2+]i由平均荧光强度表示。对照组荧光强度集中于18～30之间，平均值为22.66，最高达37.58。AAI组凋亡细胞内荧光强度明显增高，荧光强度集中于40～80之间，平均值为58.01，最高达120.24。AAI组平均荧光强度显著地高于对照组(58.01±18.89 vs 22.66±4.78，P<0.001)。
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2.2 拉西地平对LLC-PK1细胞的影响 经光镜，Annexin-V-Fluos凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测发现，实验应用的最高浓度乙醇(0.2%)对细胞凋亡无明显影响(凋亡细胞比例7.6% vs 8.3%，P>0.05)。拉西地平浓度为10μg/L时，LLC-PK1细胞发生非凋亡性形态学改变(凋亡细胞比例9.0% vs 8.3%，P>0.05)，出现许多圆形小泡，增殖变慢；浓度为1 μg/L时，未观察到与正常细胞有明显差异(图1)。
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图1 流式细胞仪检测拉西地平对LLC-PK1的影响
a.对照组；b.乙醇对照组(浓度0.2%)；c.拉西地平组(10μg/L)
2.3 拉西地平对平均[Ca2+]i的影响 单用拉西地平(1μg/L)组平均[Ca2+]i较对照组升高(28.06±7.18 vs 22.66±4.78，P<0.05)；AAI处理的细胞同时加入拉西地平终浓度分别为102ng/L，103ng/L时，平均[Ca2+]i均显著地低于AAI组(28.55±10.16，35.47±12.85 vs 58.01±18.89，P<0.001)。加用的拉西地平浓度为10ng/L时，其平均[Ca2+]i与AAI组无明显差异(57.07±20.33 vs 58.01±18.89，P>0.05)(图2)。
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图2 不同处理对LLC-PK1细胞平均[Ca2+]i的影响
c.对照组；9L：拉西地平(1μg/L)组；AA4：AAI(0.04g/L)组；AA4-9L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(1 μg/L)组；AA4-10L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(100ng/L)组；AA4-11L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(10ng/L)组
2.4 拉西地平对AAI所致LLC-PK1凋亡细胞比例的影响 经流式细胞仪分析发现，在AAI处理的LLC-PK1细胞，加用的拉西地平浓度为100 ng/L，1 μg/L时，凋亡细胞比例较AAI组显著地降低(27.8%，19.0% vs 34.7%，P<0.001)；拉西地平浓度为10 ng/L时，与对照组差异不明显(34.5% vs 34.7%，P>0.05)(图3)。
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图3 不同浓度拉西地平对AAI所致LLC-PK1细胞凋亡的比例的影响
c.对照组；AA4：AAI(0.04g/L)组；AA4-9L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(1 μg/L)组；AA4-10L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(100ng/L)组；AA4-11L：AAI(0.04g/L)+拉西地平(10ng/L)组
3 讨 论
AA所致的肾脏损伤已引起国内外肾脏病学者的重视，但其机制尚不十分清楚。我们的初步研究表明，AA可引起实验动物急、慢性肾小管损伤，而且在体外条件下AAI可诱导猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1发生凋亡，其作用与AAI浓度有关。为了进一步探讨AAI诱导LLC-PK1细胞凋亡的可能机制，本实验应用Fluo-3/AM染色，经激光扫描共聚焦显微镜测定了LLC-PK1细胞平均[Ca2+]i水平，结果提示加AAI后24h的平均[Ca2+]i升高。我们考虑此平均[Ca2+]i升高是由凋亡细胞[Ca2+]i升高所致，这是因为高[Ca2+]i的细胞在显微镜下呈明显的凋亡形态学表现。所以虽然本实验结果不能证明[Ca2+]i升高与细胞凋亡有因果关系，但二者之间必有某种联系。目前关于[Ca2+]i与细胞凋亡的研究倾向于[Ca2+]i升高可能是细胞凋亡机制的最后共同通道的一环[7]。当然，仍存在某些例外如有些细胞内[Ca2+]i升高可抑制凋亡，某些细胞凋亡与[Ca2+]i无明显相关，也许这与所用的条件和方法有关[8～10]。我们认为应研究各种条件下[Ca2+]i变化与凋亡发生的顺序，从而确定[Ca2+]i变化和凋亡有无因果关系。
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由于观察到加入AAI后[Ca2+]i升高，我们选用了一种钙拮抗剂拉西地平来观察其对[Ca2+]i和细胞凋亡是否有某种影响。据文献报告，拉西地平为L型电压依赖性钙通道拮抗剂，通过阻断细胞外钙离子内流而起作用[11]。我们的结果显示，在本实验的特定条件下，一定浓度的拉西地平可降低AAI所致的高[Ca2+]i水平及细胞凋亡的比例，这与我们以前的研究结果(钙拮抗剂氨氯地平可降低庆大霉素引起的高[Ca2+]i水平和凋亡细胞的比例[12]相符，同时也间接地说明AAI所致LLC-PK1细胞凋亡可能是[Ca2+]i升高引起。正常人口服4～8 g/L的拉西地平后，其血药峰值浓度为1.6～5.7μg/L，这与我们得到的对AAI毒性有抑制作用的拉西地平浓度(10ng/L～1μg/L)比较接近，当然，由于实验对象和研究条件不同，这种比较存在着很大的局限性。此外，考虑到拉西地平仅仅作用于L型钙离子通道，所以进行多种类型钙拮抗剂的研究显得较为必要。
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总之，本文在AAI诱导LLC-PK1细胞凋亡模型的基础上，发现AAI可致LLC-PK1细胞的平均[Ca2+]i增高，提示AAI所致的LLC-PK1细胞凋亡可能与[Ca2+]i增高有关，从而为认识AAI致肾毒作用的发生机制提供了新的研究方向。而钙拮抗剂拉西地平可降低AAI所致的高[Ca2+]i水平且能明显抑制细胞凋亡的发生，提示拉西地平可能通过抑制LLC-PK1细胞[Ca2+]i增高而抑制凋亡发生，从而为将来可能的临床治疗提供了一定的理论依据。
*中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所
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12 李雪梅，郑法雷，刘彦信等.庆大霉素引起的肾小管上皮细胞LLC-PK1凋亡及细胞内Ca++浓度的变化.中华内科杂志，1998；37(10)：668
1998-12-01收稿 1998-12-20修回, 百拇医药(高瑞通 郑法雷 刘彦信* 郑德先* 李雪梅 刘 音*)