左旋精氨酸和一氧化氮合成酶抑制剂在大鼠局灶性脑缺血中作用的实验研究
作者：曹非 孙圣刚 童萼塘 骆芳 李红莲 汪薇曦
单位：曹非 孙圣刚 童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；骆芳(湖北省财贸医院内科)；李红莲 汪薇曦(同济医科大学组织胚胎教研室)
关键词：左旋精氨酸；一氧化氮；脑缺血
临床神经病学杂志000510 【摘要】 目的 观察大鼠持续局灶性脑缺血模型一氧化氮作用规律 ，同时或分别应用一氧化氮合成前体物质--左旋精氨酸和一氧化氮合成酶抑制剂--氨基 胍治疗大鼠局灶性脑缺血。方法 通过生化、脑梗死体积测定、超微结构 观察手段，观察左旋精氨酸及一氧化氮合成酶抑制剂对缺血30分钟、60分钟、120分钟、180 分钟 大鼠脑组织的作用。结果 缺血30分钟单用左旋精氨酸大鼠脑组织损伤最 轻， 而两者合用略重于前者，缺血60分钟、120分钟、180分钟两者合用损伤最轻。结论 左旋精氨酸与胍氨酸合用是治疗大鼠局灶性脑缺血理想、可行的方案。
, 百拇医药
目前将一氧化氮(NO)用于脑缺血治疗研究的报道尚不多见，本研究在大鼠局灶性脑缺血模型上，应用左旋精氨酸(L-Arg)或 选择性一氧化氮合成酶抑制剂(sNOSI)--氨基胍(AG)，探讨L-Arg、sNOSI在大鼠局灶 性脑缺血不同时间的作用及机理。
1 材料与方法
1.1 动物选择与分组 选择250～300克健康Wistar大鼠220只(本校实验动物中心提供)，随机分为6组，即正常对 照组、假手术组、缺血组、AG组、L-Arg组、L-Arg和AG共用组，依次称为1、2、3、4、5 、6组。缺血时间分为30分钟、60分钟、120分钟、180分钟，每组每时点5只大鼠， 除1组外的2、3、4、5、6组大鼠行病理检查及电镜观察。
1.2 方法
1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型制备 采用改良的Oawner法[1]，大鼠麻醉、固定， 切皮开骨窗，暴露大脑中动脉、大脑下动脉、嗅束，直视下准确将后两者之间的大脑中动 脉凝闭，确认动脉阻断无出血后缝合。假手术组不电凝；4、5组大鼠在电凝前15分钟分别 经股静 脉注入L-Arg 300 mg/kg、AG 150 mg/kg，6组电凝前15分钟分别经股静脉和尾静脉注射L- Arg 300 mg/kg和AG 150 mg/kg(L-Arg、AG为Sigma公司产品)，3组在电凝前15分钟注入等 量生理盐水。
, 百拇医药
1.2.2 NO测定 因亚硝酸盐是NO代谢稳定终末产物，参照Kader方法[2] 行缺血及对照侧脑组织亚硝酸盐测定。
1.2.3 电镜观察 在预定时间剖颅，取所需海马CA1区组织约1.0 mm3(余下脑组织用 NO测定)固定、酒精脱水、切片、染色,用JEM-1200 EX透射电镜观察。
1.2.4 病理检查 采用IA-I型图像分析仪测量前脑各层面面积、梗死面积，结合切片间距 计算相应体积。
1.2.5 统计学处理 运用Oxstat数理统计程序完成组间、组内配对资料的显著性检验，所 有检测数据用(
±s)表示。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 各组大鼠缺血后NO含量的变化 各组大鼠缺血不同时间脑组织亚硝酸盐含量见表1。
表1 各组大 鼠缺血脑组织亚硝酸盐含量变化(±s,μmol/L) 组别
30 min
60 min
120 min
180 min
1组
2.6±0.3
2.6±0.7
2.6±0.3
, 百拇医药
2.6±0.4
2组
2.8±0.5
3.4±0.7
4.4±0.6
6.2±0.4
3组
4.7±0.8*
2.7±0.5*
6.9±0.8*
10.1±0.3*
, 百拇医药
4组
8.8±0.5△*
2.8±0.6*
7.6±0.6*△
13.5±0.3*△
5组
4.4±0.4*▲
2.4±0.5
3.9±0.4△▲
6.0±0.3△▲
, http://www.100md.com
6组
8.4±0.2△
2.9±0.4
4.2±0.5△▲
8.7±0.7△▲
与2组相比较P<0.05；与3组相比较 △ P<0.05；与4组相比较▲P<0.05
从表1中可看出各缺血组NO含量30分钟到60分钟呈下降趋势；而从60分钟到180分钟呈上 升趋势；用药组亦呈同样变化。
2.2 电镜观察结果 缺血30分钟：3组大鼠脑组织的正常神经细胞减少，个别神经细胞呈退行性变；4组神经细胞 排列密集， 形态正常；5组正常神经细胞略减少，且核不规则，少数呈退行性变；6组示锥体细胞密集排 列，极少数细胞退行性变化。缺血60分钟：3组示部分神经细胞溶解坏死，部分变性。4组示 数个神经细胞坏死，核极不规则，可见染色质凝集成块及残存的线粒体。5组则以变性为主 ，部分细胞坏死。6组正常神经细胞减少，部分神经细胞呈退行性变。缺血120分钟:3组示核 膜明显凹陷,染色质凝集成块,胞质中广泛出现块状或泥沙样致密物,无结构。4组示少数细胞 溶解坏死，神经细胞以变性为主。5组以变性为主，少数细胞坏死。6组示大部神经细胞呈退 行性改变。缺血180分钟：3组示大部分细胞坏死空化，核周可见大量的原纤维，排列紊乱。 4组示神经元变暗、变小、固缩，大部分细胞坏死崩解。5组核不规则，胞质中广泛出现块状 或泥沙样致密物，部分细胞坏死。6组有核固缩，少数细胞坏死。
, 百拇医药
2.3 各组大鼠缺血区脑组织坏死体积测定见表2。表2 各组大鼠缺血 区脑组织坏死体积比较(±s,mm3) 组别
30 min
60 min
120 min
180 min
2组
0
0
0
0
, 百拇医药
3组
3.9±1.5
8.7±3.5
16.5±2.1
24.3±6.5
4组
1.9±0.5△
5.0±2.5△
12.6±4.3
26.0±7.3
5组
3.7±1.8*
, http://www.100md.com
7.9±2.9*
10.4±3.7△
14.8±4.7△*
6组
2.0±0.7△
4.4±1.3△
6.4±1.7△*
10.1±4.8△*
与3组比较△ P<0.05；与4组比较*P <0.05
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 L-Arg、NOS 、NOSI与NO的关系 NO合成的生化途径是底物L-Arg在NOS催化下进行双氧化反应，生成NO及L-胍氨酸。NOS分 为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)。cNOS是NOS生理存在形式，合成NO时间短、量 少；iNOS在脑缺血状态下因各种刺激大量表达激活，长时间大量产生NO，成为脑缺血后神经 元迟发性损伤重要原因。NOS底物L-Arg的衍生物可用于酶的竞争性抑制，NOSI分为非选择 性NOSI和sNOSI，如AG是一种很强的sNOSI，对iNOS作用远远大于对cNOS作用。
3.2 L-Arg、NOSI在脑缺血中的作用及机理 本试验发现大鼠局灶性脑缺血30分钟至60分钟时,缺血脑组织NO呈下降趋势,60分钟 NO浓 度 最低，而且还有新的发现，即从60分钟至180分钟， NO浓度呈上升趋势。本试验30分钟时NO 浓 度：5组<3组<6组<4组，且5组与3组NO浓度差别无统计学意义，4组与6组亦然，说明此时 NO主要来源于cNOS，结合病理及电镜结果，损伤严重程度表现为5组>3组>6组>4组，NO表 现为保护作用，此时cNOS活性明显优于iNOS，L-Arg能减轻大鼠缺血性脑损伤，AG作用不明 显。60分钟时点，NO浓度依次为：5组<3组<6组<4组，但各组数据差别不大，说明此时iN OS、cNOS活性均低，L-Arg、AG作用不明显，病理及电镜示损伤严重程度依次为：3组>5组 >4 组>6组；120分钟，NO浓度依次为： 4组>3组>6组>4组，且后两组数据相差不大，原因 可 能为底物L-Arg浓度较大或iNOS酶抑制不甚完全，病理及电镜结果示缺血脑损伤程度：3组 >4组>5组>6组，说明此时cNOS合成NO能力近于结束，iNOS作用占主导地位，AG作用明显 ，L-Arg减弱。180分钟，NO浓度依次为：4组>3组>6组>5组，与iNOS持久而大量合成NO 有 关，病理及电镜结果示缺血脑损伤程度：4组>3组>5组>6组，AG作用占主导。
, http://www.100md.com
新近 研究认为NO犹如一把“双刃剑”[3],由于NO生成不足或过量、浓度不同、产生部位 、作用部位、产生时间的不同及NO氧化还原状态决定了NO在脑缺血损伤中具有“双重作用” [4]，其共同点是在脑缺血早期NO表现出保护作用，而晚期表现为细胞毒性 作用，本试验结果与之一致。NO在脑缺血早期具有保护作用的可能机理是[6]:通 过升高平滑肌细胞cGMP水平舒张脑血管,减轻脑供血不足;抑制血小板或白细胞粘附聚集;阻 断N MDA受体;对突触传导介质的调节;减少神经元胞浆中游离钙水平。而NO在脑缺血过程中细胞 毒 性作用的可能机理：介导谷氨酸的神经毒性作用。高浓度的NO可与细胞中含铁硫中心的酶结 合并使之失活；NO本身是自由基且还能产生其他有细胞毒性的自由基；NO作用的中心环节 是损伤DNA。Nagafuji[6]认为在脑缺血后不断重复给予低剂量NOSI可以对缺血脑组 织起到保护作用。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，John W,Ricardo J, Prado W,et al. The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in conscious rats. St roke,1993,24:2023
2，Kader A，Frazzini VI，Solomon RA，et al. Nitric oxide production during focal ce rebral ischemia in rats. Stroke,1993,24:1709
3，王韵,韩济生.一氧化氮在医学中的现在和未来.生理科学进展，1999,30:94
4，Zhihong Huang,Paul L Huang, Nariman Panahian,et al. Effect of cerebral ischemia in mice deficiency in neuronal nitric oxide synthase.Science,1994,265:1883
5，Frank M,Faraci,Jonhnny E,et al.Nitric oxide and the cerebral circulation. Stroke ,1994,25:692
6，Nagafuji T，Sugiyama M，Matsui T，et al. Nitric oxide synthase in cerebral ische mia. Mol and Chem Neuropathology,1995,26:107
收稿1999-11-15
修回2000-01-24, 百拇医药
单位：曹非 孙圣刚 童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科 430022)；骆芳(湖北省财贸医院内科)；李红莲 汪薇曦(同济医科大学组织胚胎教研室)
关键词：左旋精氨酸；一氧化氮；脑缺血
临床神经病学杂志000510 【摘要】 目的 观察大鼠持续局灶性脑缺血模型一氧化氮作用规律 ，同时或分别应用一氧化氮合成前体物质--左旋精氨酸和一氧化氮合成酶抑制剂--氨基 胍治疗大鼠局灶性脑缺血。方法 通过生化、脑梗死体积测定、超微结构 观察手段，观察左旋精氨酸及一氧化氮合成酶抑制剂对缺血30分钟、60分钟、120分钟、180 分钟 大鼠脑组织的作用。结果 缺血30分钟单用左旋精氨酸大鼠脑组织损伤最 轻， 而两者合用略重于前者，缺血60分钟、120分钟、180分钟两者合用损伤最轻。结论 左旋精氨酸与胍氨酸合用是治疗大鼠局灶性脑缺血理想、可行的方案。
, 百拇医药
目前将一氧化氮(NO)用于脑缺血治疗研究的报道尚不多见，本研究在大鼠局灶性脑缺血模型上，应用左旋精氨酸(L-Arg)或 选择性一氧化氮合成酶抑制剂(sNOSI)--氨基胍(AG)，探讨L-Arg、sNOSI在大鼠局灶 性脑缺血不同时间的作用及机理。
1 材料与方法
1.1 动物选择与分组 选择250～300克健康Wistar大鼠220只(本校实验动物中心提供)，随机分为6组，即正常对 照组、假手术组、缺血组、AG组、L-Arg组、L-Arg和AG共用组，依次称为1、2、3、4、5 、6组。缺血时间分为30分钟、60分钟、120分钟、180分钟，每组每时点5只大鼠， 除1组外的2、3、4、5、6组大鼠行病理检查及电镜观察。
1.2 方法
1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型制备 采用改良的Oawner法[1]，大鼠麻醉、固定， 切皮开骨窗，暴露大脑中动脉、大脑下动脉、嗅束，直视下准确将后两者之间的大脑中动 脉凝闭，确认动脉阻断无出血后缝合。假手术组不电凝；4、5组大鼠在电凝前15分钟分别 经股静 脉注入L-Arg 300 mg/kg、AG 150 mg/kg，6组电凝前15分钟分别经股静脉和尾静脉注射L- Arg 300 mg/kg和AG 150 mg/kg(L-Arg、AG为Sigma公司产品)，3组在电凝前15分钟注入等 量生理盐水。
, 百拇医药
1.2.2 NO测定 因亚硝酸盐是NO代谢稳定终末产物，参照Kader方法[2] 行缺血及对照侧脑组织亚硝酸盐测定。
1.2.3 电镜观察 在预定时间剖颅，取所需海马CA1区组织约1.0 mm3(余下脑组织用 NO测定)固定、酒精脱水、切片、染色,用JEM-1200 EX透射电镜观察。
1.2.4 病理检查 采用IA-I型图像分析仪测量前脑各层面面积、梗死面积，结合切片间距 计算相应体积。
1.2.5 统计学处理 运用Oxstat数理统计程序完成组间、组内配对资料的显著性检验，所 有检测数据用(
±s)表示。2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 各组大鼠缺血后NO含量的变化 各组大鼠缺血不同时间脑组织亚硝酸盐含量见表1。
表1 各组大 鼠缺血脑组织亚硝酸盐含量变化(
±s,μmol/L) 组别30 min
60 min
120 min
180 min
1组
2.6±0.3
2.6±0.7
2.6±0.3
, 百拇医药
2.6±0.4
2组
2.8±0.5
3.4±0.7
4.4±0.6
6.2±0.4
3组
4.7±0.8*
2.7±0.5*
6.9±0.8*
10.1±0.3*
, 百拇医药
4组
8.8±0.5△*
2.8±0.6*
7.6±0.6*△
13.5±0.3*△
5组
4.4±0.4*▲
2.4±0.5
3.9±0.4△▲
6.0±0.3△▲
, http://www.100md.com
6组
8.4±0.2△
2.9±0.4
4.2±0.5△▲
8.7±0.7△▲
与2组相比较P<0.05；与3组相比较 △ P<0.05；与4组相比较▲P<0.05
从表1中可看出各缺血组NO含量30分钟到60分钟呈下降趋势；而从60分钟到180分钟呈上 升趋势；用药组亦呈同样变化。
2.2 电镜观察结果 缺血30分钟：3组大鼠脑组织的正常神经细胞减少，个别神经细胞呈退行性变；4组神经细胞 排列密集， 形态正常；5组正常神经细胞略减少，且核不规则，少数呈退行性变；6组示锥体细胞密集排 列，极少数细胞退行性变化。缺血60分钟：3组示部分神经细胞溶解坏死，部分变性。4组示 数个神经细胞坏死，核极不规则，可见染色质凝集成块及残存的线粒体。5组则以变性为主 ，部分细胞坏死。6组正常神经细胞减少，部分神经细胞呈退行性变。缺血120分钟:3组示核 膜明显凹陷,染色质凝集成块,胞质中广泛出现块状或泥沙样致密物,无结构。4组示少数细胞 溶解坏死，神经细胞以变性为主。5组以变性为主，少数细胞坏死。6组示大部神经细胞呈退 行性改变。缺血180分钟：3组示大部分细胞坏死空化，核周可见大量的原纤维，排列紊乱。 4组示神经元变暗、变小、固缩，大部分细胞坏死崩解。5组核不规则，胞质中广泛出现块状 或泥沙样致密物，部分细胞坏死。6组有核固缩，少数细胞坏死。
, 百拇医药
2.3 各组大鼠缺血区脑组织坏死体积测定见表2。表2 各组大鼠缺血 区脑组织坏死体积比较(
±s,mm3) 组别30 min
60 min
120 min
180 min
2组
0
0
0
0
, 百拇医药
3组
3.9±1.5
8.7±3.5
16.5±2.1
24.3±6.5
4组
1.9±0.5△
5.0±2.5△
12.6±4.3
26.0±7.3
5组
3.7±1.8*
, http://www.100md.com
7.9±2.9*
10.4±3.7△
14.8±4.7△*
6组
2.0±0.7△
4.4±1.3△
6.4±1.7△*
10.1±4.8△*
与3组比较△ P<0.05；与4组比较*P <0.05
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 L-Arg、NOS 、NOSI与NO的关系 NO合成的生化途径是底物L-Arg在NOS催化下进行双氧化反应，生成NO及L-胍氨酸。NOS分 为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)。cNOS是NOS生理存在形式，合成NO时间短、量 少；iNOS在脑缺血状态下因各种刺激大量表达激活，长时间大量产生NO，成为脑缺血后神经 元迟发性损伤重要原因。NOS底物L-Arg的衍生物可用于酶的竞争性抑制，NOSI分为非选择 性NOSI和sNOSI，如AG是一种很强的sNOSI，对iNOS作用远远大于对cNOS作用。
3.2 L-Arg、NOSI在脑缺血中的作用及机理 本试验发现大鼠局灶性脑缺血30分钟至60分钟时,缺血脑组织NO呈下降趋势,60分钟 NO浓 度 最低，而且还有新的发现，即从60分钟至180分钟， NO浓度呈上升趋势。本试验30分钟时NO 浓 度：5组<3组<6组<4组，且5组与3组NO浓度差别无统计学意义，4组与6组亦然，说明此时 NO主要来源于cNOS，结合病理及电镜结果，损伤严重程度表现为5组>3组>6组>4组，NO表 现为保护作用，此时cNOS活性明显优于iNOS，L-Arg能减轻大鼠缺血性脑损伤，AG作用不明 显。60分钟时点，NO浓度依次为：5组<3组<6组<4组，但各组数据差别不大，说明此时iN OS、cNOS活性均低，L-Arg、AG作用不明显，病理及电镜示损伤严重程度依次为：3组>5组 >4 组>6组；120分钟，NO浓度依次为： 4组>3组>6组>4组，且后两组数据相差不大，原因 可 能为底物L-Arg浓度较大或iNOS酶抑制不甚完全，病理及电镜结果示缺血脑损伤程度：3组 >4组>5组>6组，说明此时cNOS合成NO能力近于结束，iNOS作用占主导地位，AG作用明显 ，L-Arg减弱。180分钟，NO浓度依次为：4组>3组>6组>5组，与iNOS持久而大量合成NO 有 关，病理及电镜结果示缺血脑损伤程度：4组>3组>5组>6组，AG作用占主导。
, http://www.100md.com
新近 研究认为NO犹如一把“双刃剑”[3],由于NO生成不足或过量、浓度不同、产生部位 、作用部位、产生时间的不同及NO氧化还原状态决定了NO在脑缺血损伤中具有“双重作用” [4]，其共同点是在脑缺血早期NO表现出保护作用，而晚期表现为细胞毒性 作用，本试验结果与之一致。NO在脑缺血早期具有保护作用的可能机理是[6]:通 过升高平滑肌细胞cGMP水平舒张脑血管,减轻脑供血不足;抑制血小板或白细胞粘附聚集;阻 断N MDA受体;对突触传导介质的调节;减少神经元胞浆中游离钙水平。而NO在脑缺血过程中细胞 毒 性作用的可能机理：介导谷氨酸的神经毒性作用。高浓度的NO可与细胞中含铁硫中心的酶结 合并使之失活；NO本身是自由基且还能产生其他有细胞毒性的自由基；NO作用的中心环节 是损伤DNA。Nagafuji[6]认为在脑缺血后不断重复给予低剂量NOSI可以对缺血脑组 织起到保护作用。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，John W,Ricardo J, Prado W,et al. The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in conscious rats. St roke,1993,24:2023
2，Kader A，Frazzini VI，Solomon RA，et al. Nitric oxide production during focal ce rebral ischemia in rats. Stroke,1993,24:1709
3，王韵,韩济生.一氧化氮在医学中的现在和未来.生理科学进展，1999,30:94
4，Zhihong Huang,Paul L Huang, Nariman Panahian,et al. Effect of cerebral ischemia in mice deficiency in neuronal nitric oxide synthase.Science,1994,265:1883
5，Frank M,Faraci,Jonhnny E,et al.Nitric oxide and the cerebral circulation. Stroke ,1994,25:692
6，Nagafuji T，Sugiyama M，Matsui T，et al. Nitric oxide synthase in cerebral ische mia. Mol and Chem Neuropathology,1995,26:107
收稿1999-11-15
修回2000-01-24, 百拇医药