实验性脑梗塞中小胶质细胞、NO、H2O2的动态观察
作者：殷 伟 吕传真
单位：上海医科大学神经病学研究所(200040)
关键词：脑梗塞；小胶质细胞；一氧化氮；过氧化氢
中国临床神经科学/990106 摘要 本研究采用线栓法制备了大鼠的实验性脑梗塞模型，通过Lectin染色观察小胶质细胞的变化，通过微透析获得缺血基底区的细胞外液，测定了NO、H2O2的变化。结果表明，脑缺血30 min，再灌注早期0.5 h神经元变性坏死较轻，随着再灌注时间的延长，神经元坏死程度逐渐扩大。再灌注0.5 h基底区的小胶质细胞活化，NO及H2O2水平增高(P<0.05)。随着再灌注时间的延长至6 h，小胶质细胞的变化不大，而NO及H2O2水平降低。
The Dynamic Observation of Microglial Cell,NO
, 百拇医药
and H2O2 in Experimental Cerebral Ischemia
Yin Wei,Lu Chuanzhen
Institute of Neurology,Shanghai Medical University 200040
Abstract:This study prepared rat experimental cerebral ischemia model by suture occlusion.The change of microglial cell was observed by Lectin labelling.In the meantime,the changs of NO,H2O2 in microdialyses from basal ganglia were measured.The results showed that after occlusion of 30 minutes,reperfusing for 0.5 hours caused mild necrosis,with reperfusing,the zone of necrosis was enlarged.After reperfusing for 0.5 hours,microglial cell was activated,the level of NO and H2O2 was increased(P<0.05),with reperfusing up to 6 hours,the change of microglial cell was little,but the level of NO and H2O2 was decreased gradually.
, http://www.100md.com
Key Words Cerebral ischemia microglial Nitric Oxide(NO) Hydrogen peroxide(H2O2)
脑梗塞中，多种细胞及效应分子参与其病理生理过程，而且互相形成网络，作用十分复杂。为此，有必要观察一下脑梗塞后不同时间细胞及效应分子的动态变化。文献表明，缺血引起的神经元变化常伴随着胶质反应，在轻度神经元损伤而血脑屏障未受损时，小胶质细胞是主要的反应细胞[1]，并分泌多种介质，其中包括反应性氧产物。鉴于小胶质细胞及多种介质在脑梗塞中的变化和作用具有双相性[2]，本实验采用局灶性脑缺血模型，动态观察脑缺血后不同再灌注时间点的神经元变性坏死、小胶质细胞、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)等的变化及其相关性，试图为脑缺血再灌注损伤的病理生理过程的研究提供理论依据。
, http://www.100md.com 材料与方法
1、大鼠实验性脑梗塞模型的制备
健康雄性SD大鼠，体重230～300 g，上海医科大学动物部提供。随机将动物分成7组：正常组3只，假手术组3只，缺血30 min再灌注0.5 h组、1 h组、2 h组、4 h组、6 h组各3只。采用进口的3-0单股尼龙手术结扎线阻塞左侧大脑中动脉30 min，建立大鼠局灶性脑缺血模型，拔掉插线，进行再灌注。
2、神经元变性坏死的检测
分别于再灌注0.5、1、2、4、6h，4%多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片，经H-E染色，光镜下观察。
3、小胶质细胞活性的观察
石蜡切片，脱蜡后进行Lectin染色，方法简介如下：含0.1% Triton X-100的PBS中平衡15 min，加入40 μg/ml GSA I-B4-HRP(辣根过氧化物酶标记的Griffonia Simplicifoia B4-isolectin)，4℃孵育过夜，DAB-H2O2显色5 min，脱水，透明，封片，光镜下观察小胶质细胞染色情况[3]。
, 百拇医药
4、采用微透析技术获得缺血区的细胞外液
模型鼠固定在立体定向仪上，定位坐标是：Ap-0.3 mm，L-0.4 mm，H-0.5 mm稳定1～2 h，CMA/140微量收集器，每20 min搜集一管标本，分别收集再灌注0.5、1、2、4、6 h的透析液。
5、透析液中NO浓度的测定：以亚硝酸钠作为标准品，采用Griess试剂测定[4]。
6、透析液中H2O2浓度的测定：采用改良的ELISA法测定[5]。
7、统计学处理：
实验数据均采用均数±标准误表示。采用多因素直线回归分析及t检验，P<0.05则具有统计学意义。
, 百拇医药
结果
1、缺血30 min后再灌注不同时间点神经元坏死的变化
缺血30 min后再灌注0.5 h便可在基底区观察到散在的神经元的变性坏死，随着再灌注时间的延长，神经元变性坏死的范围逐渐扩大。
2、缺血30 min后再灌注不同时间点小胶质细胞活性的变化
小胶质细胞的GSA I-B4-HRP染色细胞呈棕黄色，蜘蛛状。正常组及假手术组中可见小胶质细胞少量表达，在本实验检测的最早时间点上即再灌注0.5 h，小胶质细胞的染色明显增加，再灌注6 h之内变化不大。
3、缺血30 min后再灌注不同时间点NO的动态变化
通过检测透析液中NO的代谢终产物亚硝酸盐的浓度反映NO的变化。结果表明(如图1)，再灌注0.5 h，NO的水平升高(与正常组及假手术组相比，P<0.05)，再灌注1 h即降为正常水平，持续至6 h。
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图1 缺血30 min后不同再灌注时间上缺血纹状体细胞外液中NO的变化
4、缺血30 min后再灌注不同时间点H2O2的动态变化：
图2可见，H2O2的含量在再灌注0.5 h时最高，达本实验时间点上的最高值，随后其水平下降，再灌注2 h已降为正常水平。
*与正常组相比P<0.05
图2 缺血30 min后不同再灌注时间上缺血纹状体细胞外液中H2O2的变化
5.神经元的坏死、小胶质细胞的反应性及自由基变化的相关性分析：
, 百拇医药
采用多因素直线回归分析可见，神经元的坏死与小胶质细胞的反应性、与自由基的变化均无明显的相关性(P>0.05)。
讨论
在脑缺血再灌注早期，快速发生的一个细胞反应是小胶质细胞的活化。文献表明，Griffonia Simplicifolia B4-isolectin能选择性结合大鼠脑内正常及病理状态下的小胶质细胞，偶联的HRP通过DAB显色而使小胶质细胞着色，而其他类型的细胞均不能与之结合，因此可以通过组织化学方法观察小胶质细胞的活化状态。结果表明，在本实验检测的最早时间点上即再灌注0.5 h，小胶质细胞的染色明显增加，但6 h之内变化不大，说明该过程中在大脑中动脉供血的基底区有小胶质细胞反应性的增加，但反应尚未达到最强。此外，本实验表明，小胶质细胞的活化与神经元的坏死无明显相关性，可能的原因为小胶质细胞的双相作用，即一方面通过分泌克隆刺激因子、纤维母细胞生长因子、转化生长因子等发挥促神经元存活作用；另一方面，分泌氧自由基、淋巴毒素、肿瘤坏死因子等，发挥损伤神经元的作用[6]。至于脑缺血再灌注后早期小胶质细胞活化的原因可能与缺血后引起的代谢变化、离子失衡及活化的小胶质细胞本身分泌的产物有关。
, 百拇医药
通过微透析方法测定脑内H2O2、NO是监测反应性氧产物、氮产物的快速直接的方法。小胶质细胞产生的重要介质是氧自由基，其中H2O2是脑缺血再灌注损伤中产生的主要反应性氧产物。它通过引起脂质过氧化、兴奋性氨基酸释放、诱导凋亡等破坏神经元。本实验表明，H2O2的含量在再灌注0.5 h时最高，随后其水平下降，再灌注2 h已降为正常水平。其变化与小胶质细胞的变化不呈明显相关，说明还有其他的细胞产生H2O2。H2O2持续时间的长短主要取决于缺血的严重程度[7]。缺血组织中的超氧阴离子在超氧化物歧化酶的作用下被转化为H2O2，它可与超氧阴离子形成更具毒性的羟自由基，导致组织坏死。测定透析液中NO的变化表明，再灌注0.5 h，NO的浓度最高，然后开始下降，再灌注1 h已达正常水平，NO减少的原因可能是由于在严重的缺血性损伤下，产生NO所必须的氧NADPH-L-精氨酸的减少。NO在缺血再灌注损伤中的作用是双相的[8]，局灶性脑缺血后最初数小时eNOS、nNOS表达增加，有利于保护神经元，12～48 h后iNOS才增加，发挥神经元损伤作用。可以认为本实验中的NO增高具有保护作用。
, 百拇医药
本实验观察到的缺血再灌注神经元损伤中，小胶质细胞、H2O2、NO动态变化，为探讨神经元保护方案提供了新的视角。
参考文献
[1].Morioka T, et al. The microglial reaction in the rat dorsal hippocampus following transient forebrain ischemia.J Cereb Blood Flow Metabolish,1991,11:966.
[2].Hyslop PA, et al. Measurement of striatal H2O2 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rate with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro.Brain Res,1995,671:181.
, 百拇医药
[3].Striet WJ, et al. An improved staining method for rat macroglial cells.J Histochem Cytochem,1990,38(11):1683.
[4].Fahmi H, et al. Endotoxin induced desensitization of mouse microphages is mediated in part by nitric oxide production. Infection Immunity,1995(5):1863.
[5].杨抗抗等.EHFV触发中性粒细胞呼吸爆发的探讨.中国免疫学杂志，1994，10(4)：233.
[6].Lees GJ, et al. The possible contribution of microglial and macrophages to delayed neuronal death after ischemia.J Neruol Sci,1993,114:119.
, 百拇医药
[7].Zhang J ,et al. Prolonged production of hydroxyl radical in rat hippocampus after brain ischemia-reperfusion is decreased by 21-aminosteroids.Neurosci Lett,1994,177:127.
[8].Iadecola C, et al. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends Neurosci,1997,20:132.
(1998年6月25日收稿 1999年1月15日修回), 百拇医药
单位：上海医科大学神经病学研究所(200040)
关键词：脑梗塞；小胶质细胞；一氧化氮；过氧化氢
中国临床神经科学/990106 摘要 本研究采用线栓法制备了大鼠的实验性脑梗塞模型，通过Lectin染色观察小胶质细胞的变化，通过微透析获得缺血基底区的细胞外液，测定了NO、H2O2的变化。结果表明，脑缺血30 min，再灌注早期0.5 h神经元变性坏死较轻，随着再灌注时间的延长，神经元坏死程度逐渐扩大。再灌注0.5 h基底区的小胶质细胞活化，NO及H2O2水平增高(P<0.05)。随着再灌注时间的延长至6 h，小胶质细胞的变化不大，而NO及H2O2水平降低。
The Dynamic Observation of Microglial Cell,NO
, 百拇医药
and H2O2 in Experimental Cerebral Ischemia
Yin Wei,Lu Chuanzhen
Institute of Neurology,Shanghai Medical University 200040
Abstract:This study prepared rat experimental cerebral ischemia model by suture occlusion.The change of microglial cell was observed by Lectin labelling.In the meantime,the changs of NO,H2O2 in microdialyses from basal ganglia were measured.The results showed that after occlusion of 30 minutes,reperfusing for 0.5 hours caused mild necrosis,with reperfusing,the zone of necrosis was enlarged.After reperfusing for 0.5 hours,microglial cell was activated,the level of NO and H2O2 was increased(P<0.05),with reperfusing up to 6 hours,the change of microglial cell was little,but the level of NO and H2O2 was decreased gradually.
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Key Words Cerebral ischemia microglial Nitric Oxide(NO) Hydrogen peroxide(H2O2)
脑梗塞中，多种细胞及效应分子参与其病理生理过程，而且互相形成网络，作用十分复杂。为此，有必要观察一下脑梗塞后不同时间细胞及效应分子的动态变化。文献表明，缺血引起的神经元变化常伴随着胶质反应，在轻度神经元损伤而血脑屏障未受损时，小胶质细胞是主要的反应细胞[1]，并分泌多种介质，其中包括反应性氧产物。鉴于小胶质细胞及多种介质在脑梗塞中的变化和作用具有双相性[2]，本实验采用局灶性脑缺血模型，动态观察脑缺血后不同再灌注时间点的神经元变性坏死、小胶质细胞、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)等的变化及其相关性，试图为脑缺血再灌注损伤的病理生理过程的研究提供理论依据。
, http://www.100md.com 材料与方法
1、大鼠实验性脑梗塞模型的制备
健康雄性SD大鼠，体重230～300 g，上海医科大学动物部提供。随机将动物分成7组：正常组3只，假手术组3只，缺血30 min再灌注0.5 h组、1 h组、2 h组、4 h组、6 h组各3只。采用进口的3-0单股尼龙手术结扎线阻塞左侧大脑中动脉30 min，建立大鼠局灶性脑缺血模型，拔掉插线，进行再灌注。
2、神经元变性坏死的检测
分别于再灌注0.5、1、2、4、6h，4%多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片，经H-E染色，光镜下观察。
3、小胶质细胞活性的观察
石蜡切片，脱蜡后进行Lectin染色，方法简介如下：含0.1% Triton X-100的PBS中平衡15 min，加入40 μg/ml GSA I-B4-HRP(辣根过氧化物酶标记的Griffonia Simplicifoia B4-isolectin)，4℃孵育过夜，DAB-H2O2显色5 min，脱水，透明，封片，光镜下观察小胶质细胞染色情况[3]。
, 百拇医药
4、采用微透析技术获得缺血区的细胞外液
模型鼠固定在立体定向仪上，定位坐标是：Ap-0.3 mm，L-0.4 mm，H-0.5 mm稳定1～2 h，CMA/140微量收集器，每20 min搜集一管标本，分别收集再灌注0.5、1、2、4、6 h的透析液。
5、透析液中NO浓度的测定：以亚硝酸钠作为标准品，采用Griess试剂测定[4]。
6、透析液中H2O2浓度的测定：采用改良的ELISA法测定[5]。
7、统计学处理：
实验数据均采用均数±标准误表示。采用多因素直线回归分析及t检验，P<0.05则具有统计学意义。
, 百拇医药
结果
1、缺血30 min后再灌注不同时间点神经元坏死的变化
缺血30 min后再灌注0.5 h便可在基底区观察到散在的神经元的变性坏死，随着再灌注时间的延长，神经元变性坏死的范围逐渐扩大。
2、缺血30 min后再灌注不同时间点小胶质细胞活性的变化
小胶质细胞的GSA I-B4-HRP染色细胞呈棕黄色，蜘蛛状。正常组及假手术组中可见小胶质细胞少量表达，在本实验检测的最早时间点上即再灌注0.5 h，小胶质细胞的染色明显增加，再灌注6 h之内变化不大。
3、缺血30 min后再灌注不同时间点NO的动态变化
通过检测透析液中NO的代谢终产物亚硝酸盐的浓度反映NO的变化。结果表明(如图1)，再灌注0.5 h，NO的水平升高(与正常组及假手术组相比，P<0.05)，再灌注1 h即降为正常水平，持续至6 h。
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图1 缺血30 min后不同再灌注时间上缺血纹状体细胞外液中NO的变化
4、缺血30 min后再灌注不同时间点H2O2的动态变化：
图2可见，H2O2的含量在再灌注0.5 h时最高，达本实验时间点上的最高值，随后其水平下降，再灌注2 h已降为正常水平。
*与正常组相比P<0.05
图2 缺血30 min后不同再灌注时间上缺血纹状体细胞外液中H2O2的变化
5.神经元的坏死、小胶质细胞的反应性及自由基变化的相关性分析：
, 百拇医药
采用多因素直线回归分析可见，神经元的坏死与小胶质细胞的反应性、与自由基的变化均无明显的相关性(P>0.05)。
讨论
在脑缺血再灌注早期，快速发生的一个细胞反应是小胶质细胞的活化。文献表明，Griffonia Simplicifolia B4-isolectin能选择性结合大鼠脑内正常及病理状态下的小胶质细胞，偶联的HRP通过DAB显色而使小胶质细胞着色，而其他类型的细胞均不能与之结合，因此可以通过组织化学方法观察小胶质细胞的活化状态。结果表明，在本实验检测的最早时间点上即再灌注0.5 h，小胶质细胞的染色明显增加，但6 h之内变化不大，说明该过程中在大脑中动脉供血的基底区有小胶质细胞反应性的增加，但反应尚未达到最强。此外，本实验表明，小胶质细胞的活化与神经元的坏死无明显相关性，可能的原因为小胶质细胞的双相作用，即一方面通过分泌克隆刺激因子、纤维母细胞生长因子、转化生长因子等发挥促神经元存活作用；另一方面，分泌氧自由基、淋巴毒素、肿瘤坏死因子等，发挥损伤神经元的作用[6]。至于脑缺血再灌注后早期小胶质细胞活化的原因可能与缺血后引起的代谢变化、离子失衡及活化的小胶质细胞本身分泌的产物有关。
, 百拇医药
通过微透析方法测定脑内H2O2、NO是监测反应性氧产物、氮产物的快速直接的方法。小胶质细胞产生的重要介质是氧自由基，其中H2O2是脑缺血再灌注损伤中产生的主要反应性氧产物。它通过引起脂质过氧化、兴奋性氨基酸释放、诱导凋亡等破坏神经元。本实验表明，H2O2的含量在再灌注0.5 h时最高，随后其水平下降，再灌注2 h已降为正常水平。其变化与小胶质细胞的变化不呈明显相关，说明还有其他的细胞产生H2O2。H2O2持续时间的长短主要取决于缺血的严重程度[7]。缺血组织中的超氧阴离子在超氧化物歧化酶的作用下被转化为H2O2，它可与超氧阴离子形成更具毒性的羟自由基，导致组织坏死。测定透析液中NO的变化表明，再灌注0.5 h，NO的浓度最高，然后开始下降，再灌注1 h已达正常水平，NO减少的原因可能是由于在严重的缺血性损伤下，产生NO所必须的氧NADPH-L-精氨酸的减少。NO在缺血再灌注损伤中的作用是双相的[8]，局灶性脑缺血后最初数小时eNOS、nNOS表达增加，有利于保护神经元，12～48 h后iNOS才增加，发挥神经元损伤作用。可以认为本实验中的NO增高具有保护作用。
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本实验观察到的缺血再灌注神经元损伤中，小胶质细胞、H2O2、NO动态变化，为探讨神经元保护方案提供了新的视角。
参考文献
[1].Morioka T, et al. The microglial reaction in the rat dorsal hippocampus following transient forebrain ischemia.J Cereb Blood Flow Metabolish,1991,11:966.
[2].Hyslop PA, et al. Measurement of striatal H2O2 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rate with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro.Brain Res,1995,671:181.
, 百拇医药
[3].Striet WJ, et al. An improved staining method for rat macroglial cells.J Histochem Cytochem,1990,38(11):1683.
[4].Fahmi H, et al. Endotoxin induced desensitization of mouse microphages is mediated in part by nitric oxide production. Infection Immunity,1995(5):1863.
[5].杨抗抗等.EHFV触发中性粒细胞呼吸爆发的探讨.中国免疫学杂志，1994，10(4)：233.
[6].Lees GJ, et al. The possible contribution of microglial and macrophages to delayed neuronal death after ischemia.J Neruol Sci,1993,114:119.
, 百拇医药
[7].Zhang J ,et al. Prolonged production of hydroxyl radical in rat hippocampus after brain ischemia-reperfusion is decreased by 21-aminosteroids.Neurosci Lett,1994,177:127.
[8].Iadecola C, et al. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends Neurosci,1997,20:132.
(1998年6月25日收稿 1999年1月15日修回), 百拇医药