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编号:10278626
电子顺磁共振检测心肌缺血再灌产生的氧自由基及其保护的实验研究
http://www.100md.com 《心肺血管病杂志》 2000年第1期
     作者:郭来敬 张志仁 陈东辉 王璞

    单位:张志仁(哈尔滨医科大学附属第二医院心内科 150086);陈东辉(哈尔滨医科大学附属第二医院心内科 150086);王璞(哈尔滨医科大学附属第二医院心内科 150086);郭来敬(北京首钢总医院心内科 100041)

    关键词:电子顺磁共振;氧自由基;脂质过氧化物;超氧化物歧化酶;丹参注射液

    心肺血管病杂志000119 摘 要:为了更直接地证明心肌缺血再灌过程中活性氧自由基的产生,并找出较好的心肌保护药物。本实验采用电子顺磁共振(ESR)波谱仪直接检测家兔在体心肌缺血再灌时产生的活性氧自由基,同时观察丹参注射液在心肌缺血再灌中的作用。结果再灌组氧自由基的含量显著高于缺血及保护组。缺血区心肌中的LPO的含量明显增加,内源性抗氧化系统SOD、GSH-Px及CAT的活性呈普遍下降趋势。SOD和丹参对缺血心肌组织中氧自由基的产生、LPO生成呈抑制作用,而对SOD、CAT及GSH-Px的活性却有提高作用。缺血心肌再灌可产生大量的氧自由基,加重心肌缺血的损伤,丹参对心肌再灌产生的氧自由基有清除作用,使缺血心肌得到保护,其作用与SOD相似。
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    Detection and Protection of Oxygen Free Radical Following Myocardium Ischemia Reperfusion Tested with Electron Spin Resonance Spectroscopy

    Guo Laijing,Zhang Zhiren,Chen Donghui,et al.

    (Department of Cardiovascular Diseases Shougang Center Hospital of Beijing.Beijing,100041)

    Abstract:In order to detect free radical generation directly during myocardial ischemia/reperfusion and to find effective drugs to protect myocardium,the oxygen free radical was assayed with Electron Spin Resonance Spectroscopy(ESR)technique and the protective effect during myocardial ischemia/reperfusion of Salvia miltiorrhiza was observed.It was showed in the results that the level of free radical in the ischemia/reperfusion group was higher than that in the ischemia group or protection group.The concentration of lipid peroxide(LPO) in the reperfusion group increased apparently . The activities of three free radical scavenging enzymes decreased at the same time.In all animals given SOD and Salvia miltiorrhiza,the generation of free radical and LPO was inhibited and the activities of SOD,GSH-Px,CAT increased.The result showed that the oxygen free radical can be produced during myocardial ischemial/reperfusion.Salvia miltiorrhiza may play an important role in the procecess of myocardial ischemia/reperfusion and the protection of free radical scavenging enzymes.
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    Key words:Electron Spin Resonance; Superoxide dismutase;Lipid peroxide; Salvia miltiorrhiza; Oxygen-free radical▲

    大量资料证明,在心肌缺血及再灌注中,氧自由基的产生、代谢和清除是决定心肌损伤严重程度的主要因素。减少氧自由基的生成和加速氧自由基的消除,不仅可减轻心肌缺血的严重程度,而且关系到再灌注的成功与否。近年来,随着溶栓、球囊扩张及心脏直视手术下的各种疗法的日益进展,再灌注引起的心肌损伤问题越来越受到重视。因此寻求新的抗缺血再灌损伤的药物,越来越广泛起来[1~5]

    材料与方法

    一、 实验材料 1.动物:本实验选用大耳白兔40只,体重1.9~2.0kg/只,雌雄不限。2.自由基清除剂:SOD,2万u/支,湖南长沙生化药物制剂厂产品(猪红细胞);丹参注射液,上海第一制药厂产品。3.试剂:TBA(硫代巴比妥酸)西德产品;TMP(1.1.3.3甲氧基丙烷)日本东京化学工业株式会社产品;SOD试剂盒:中国海军抗衰老研究中心产品;CAT试剂盒:长春酶联试剂厂产品;GSH-Px试剂盒:长春酶联试剂厂产品。4.实验仪器 电子顺磁共振(ESR)波谱仪(日本);721型分光光度计(北京);分析天平DT-100(北京);心电记录仪:C-GEM6151型(日本)。
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    二、 实验模型的建立及分组 将选用的动物称重后用2%的戊巴比妥钠(2ml/kg)耳缘静脉注射麻醉,平稳后固定于实验台上,四肢接心电导联电极后描记术前心电图。在胸骨左缘约1~2 mm处切开胸前壁,注意勿损伤胸膜。剪开心包,显露心脏,探查冠状血管的走行和分布。确定左室支后,于距其起始部约0.5cm处穿线。对照组不予结扎,观察40min后取材,单纯缺血组结扎40min后立即取材,再灌组结扎40min再灌20min取材,SOD保护组结扎20 min时,耳缘静脉注入SOD(2万u/kg),20 min后复灌20min后立即取材。丹参组用药方式同上2g/kg,每组8只。

    三、 标本处理 1.氧自由基标本取200mg左右,立即制成匀桨装入内径3 mm的石英样品管,充填1.5cm以上,迅速置于液氮中快速冷冻,于1h内进行氧自由基检测。2.测LPO、CAT、SOD和GSH-Px的标本,取200mg左右称重立即制成10%匀桨待测。

    四、 测定方法 1.氧自由基测定 将ESR波谱仪谐振腔内的温度调至100k,将液氮速冻的样品放入谐振腔内,待温度平衡后检测和记录ESR波谱。检测时,周围的强磁场使样品中自由基的未成对电子产生分裂。用微波激发处于低能级的电子使其跃迁到高能级上,同时吸收能量。在跃迁过程中,电子遵循以上规律,hv=gβH,利用该公式和ESR波谱中信号峰,通过零点的磁场可计算出样品中自由基的g值。低温下心肌氧自由基的波谱,具有各向异性,且具有轴对称性质,因而可测出g和g两个g因子。2.LPO测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法比色测定心肌匀桨LPO的含量,结果以nmol/L表示。3.SOD活性测定 采用邻苯三酚自氧化抑制法测定心肌匀桨SOD活性,结果以u/L来表示。4.GSH-Px测定 采用长春酶联试剂厂GSH-Px试剂盒测定心肌匀桨GSH-Px的活性,以u/L为单位。5.CAT测定 采用长春酶联试剂厂CAT试剂盒测定心肌匀桨CAT的活性,以u/L为单位。
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    结 果

    一、 ESR波谱的改变 在体家兔心肌缺血再灌注模型的ESR波谱中,低场g=2.039的信号峰和中场g=2.0047的信号峰,是由氧自由基产生的各组心肌组织中氧自由基的含量按峰高的相对比计算及显著性检验见表1。

    表1 心肌组织中氧自由基、LPO、SOD、GSH-Px、CAT含量变化及显著性检验(D) 组 别

    例数

    (n)

    氧自由基

    (O峰高度/O峰+S峰)

, 百拇医药     LPO(nmol/L)

    (×104)

    SOD(u/L)

    (×105)

    GSH-Px(u/L)

    (×106)

    CAT(u/L)

    (×102)

    正常对照组(A)

    8

    0.06±0.01
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    4.41±0.20

    2.47±0.52

    2.37±0.48

    4.35±0.26

    单纯缺血组(B)

    8

    缺血区(I)

    0.10±0.01**

    4.75±0.21*

    1.55±0.37**

    1.48±0.63*
, 百拇医药
    3.58±0.36**

    非缺血区(3)

    0.06±0.01

    4.41±0.39

    2.44±0.40

    1.91±0.69

    4.26±0.22

    单纯再灌组(C)

    8

    缺血区(1)

    0.14±0.04**
, 百拇医药
    5.99±0.32**

    0.74±0.19**

    0.96±0.34**

    2.20±0.39**

    非缺血区(3)

    0.07±0.00

    4.21±0.60

    2.40±0.49

    1.93±0.39

    4.04±0.50

, http://www.100md.com     SOD组(D)

    8

    缺血区(1)

    0.09±0.02**

    4.83±0.24*

    1.59±0.38**

    1.46±0.56**

    3.29±0.54**

    非缺血区(3)

    0.06±0.00

    4.45±0.24
, 百拇医药
    2.53±0.46

    2.18±0.54

    4.33±0.29

    丹参组(E)

    8

    缺血区(1)

    0.09±0.01**

    4.89±0.30*

    1.64±0.34**

    1.44±0.41*

    3.33±0.47**
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    非缺血区(3)

    0.06±0.01

    4.30±0.29

    2.49±0.39

    2.03±0.43

    4.26±0.23

    A与1

    <0.01

    <0.01

    <0.01

    <0.01

    <0.01
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    P A与3

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    值 B1与D1,E1

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    C1与B1,D1,E1
, 百拇医药
    <0.01

    <0.01

    <0.01

    <0.05

    <0.01

    D1与E1

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    >0.05

    注:缺血区与非缺血区比较 **P<0.01 *P<0.05 P>0.05NS
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    实验中用四种方法证明上述两个峰代表氧自由基。第一,其g和g的值与文献报告的氧自由基g值相符;第二,将温度升到223k后,峰高明显下降,符合氧自由基随温度升高而衰减的特性;第三,将微波功率由1mw提高到10mw仍未饱和与氧自由基不易饱和性质一致;第四,加用对氧自由基具有绝对专一清除作用的SOD后,这两个峰几乎完全消失,因而可以确定其代表氧自由基。中场g=2.0047的另一信号,可能是半醌自由基。

    从表1及图1可以看出,正常家兔心肌组织亦可产生自由基,但量较少。各实验组非缺血区与正常心肌组织的氧自由基含量无差异,各缺血区与非缺血区氧自由基含量均有极显著的差异,单纯再灌组的氧自由基的含量明显高于其它各组,其比较为再灌组>缺血组>丹参组>SOD组>正常对照组。

    图1 A:正常家兔心肌组织氧自由基的ESR波谱
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    B:缺血心肌组织氧自由基的ESR波谱

    C:再灌组心肌组织氧自由基的ESR波谱

    D:SOD组心肌组织氧自由基的ESR波谱

    E:丹参组心肌组织氧自由基的ESR波谱

    二、 心肌组织LPO、SOD、CAT、GSH-Px的含量变化 各自心肌组织LPO、SOD、CAT、GSH-Px含量测定结果及方差分析结果见表1。从表1可以看出1.正常对照组和各实验组的非缺血区心肌中LPO、SOD、CAT、GSH-Px的含量无差异,但缺血区LPO的含量高于正常对照组,而抗氧化酶系SOD、GSH-Px、CAT含量远远低于正常对照组。其中,再灌组与缺血及保护组之间均有极显著差异(P<0.01)。2.缺血区与非缺血区心肌组织中LPO、SOD、GSH-Px、CAT的含量均有显著差异。3.SOD组与丹参组之间无差异。4.各实验组缺血区脂质过氧化物及清除酶系的含量比较为LPO:再灌组>丹参组>SOD组>缺血组;SOD:再灌组<缺血组, 百拇医药
    讨 论

    本实验结果表明:正常心肌组织亦可检测到少量的自由基,单纯缺血可产生自由基与正常心肌组织之间有差异(P<0.05),而再灌时,氧自由基含量突然明显增加,与缺血组之间有极显著差异(P<0.01),同时亦观察到半醌自由基相应减少。使用SOD和丹参组再灌时,氧自由基含量明显减少,与再灌组之间有极显著差异(P<0.01),半醌自由基又相应提高,表现为负相关。与此同时测定的LPO含量变化规律与氧自由基相一致。而内源性抗氧化酶系列活性,呈不同程度的减低趋势,其中以SOD降低最为显著。缺血区SOD活性的降低表现心肌缺血后氧浓度急速增大,同时与LPO呈负相关,说明引起LPO激活的最初氧自由基是。心肌缺血导致的氧自由基和LPO的升高及内源性抗氧化酶系活性的降低,使内源性抗氧化酶系不能有效地抵抗氧自由基对肌体的损害。因此研究天然或合成的抗氧化制剂在心肌缺血方面的作用是很有意义的[2-5]
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    本实验发现,丹参制剂是一种良好的氧自由基清除剂,表现为氧自由基、LPO含量的明显降低与再灌组比较差异显著(P<0.01),清除酶系SOD、GSH-Px、CAT的活性不同程度的增加,与再灌组比较亦有显著差异(P<0.01)。因此,提示丹参对缺血心肌的脂质过氧化反应呈现抑制作用,对清除酶系有提高作用,使心肌得到保护,其作用与SOD相似。

    参考文献:

    [1]刘乃丰,陈日新,张丽容,等.ESR自旋捕集技术研究LDL氧化过程中的羟自由基.中国病理生理杂志,1994,10:631.

    [2]Herskowitz A,Chois,Ansari AA,et al.Cytokine mRNA expression in postischemic/reperfused myocardium.Am J Pathol,1995,146:419.
, 百拇医药
    [3]何敏,刘忠铭,姜秀珍,等.卡托普利对高血压者血液自由基系统的影响.中国高血压杂志,1995,26:50.

    [4]Kuklelka G,Hawkins HK,Michael L,et al.Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (I CΛM-1) in ischemic and reperfused canine myocardium.J Clin invest,1993,92:1504.

    [5]Lefer AM,Tohnson G,Ma XL, et al. Cardioprotective and endothelial protective effects of [Ala-lL8]77 in a rabbit model of myocardial ischemia and reperfusion.Br J Pharmacol,1991,103:1153.

    收稿日期:1999-01-20

    修稿日期:1999-05-13, 百拇医药