降钙素基因相关肽拮抗内皮素生物学效应与内皮素结合位点下调
作者：谭敦勇
单位：谭敦勇(暨南大学医学院病理生理教研室 510632)
关键词：
降钙素基因相关肽拮抗内皮素生物学效应与内皮素结合位点下调 降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是降钙素基因差异性表达的一种神经肽，具有很强的舒血管作用。内皮素(endothelin,ET)则是一种很强的缩血管多肽，由21个氨基酸组成。ET参与了许多心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化及心肌梗塞等的发病过程。Gardiner等报道CGRP能有效拮抗ET1的缩血管作用。CGRP很可能是一种极有效的ET的内源性拮抗物质。本工作我们进一步观察了Hα-CGRP对ET1所致的血压上升、心肌损伤的影响，并分析了内皮素结合位点在Hα-CGRP拮抗ET时的作用。
实验方法
, http://www.100md.com
1. 在体慢性血液动力学实验 体重190±4g的健康雄性Wistar大鼠，禁食(但自由饮水)18～20h，经苯巴比妥钠麻醉(60 mg/kg b.w,ip)后，行腹主动脉及股静脉插管术，然后两导管经皮下自颈后部引出并与一双导管旋转活结(Swival,Instech,Plymouth Meeting,PA)相连。手术后动物恢复一星期开始实验，置于代谢笼并保持室内温度恒定、环境安静，并随机分为4组(n=5)。实验开始后经静脉导管连续输液5天(12ml/day)：3×10-10mol/L ET1(ET1组)、3×10-10mol/LHα-CGRP(CGRP组)、3×10-10mol/L ET1+3×10-10mol/L Hα-CGRP (EC组) 及等体积的生理盐水(对照组)。动脉导管经旋转活结及压力转换器(Cobe,Lakewood,CO)后与生理记录仪(model 7D,Grass Instruments,Quincy,MA)相连，其血液动力学数据经一模/数(A/D)转换装置转换成数字信号后输入计算机处理、储存。血液动力学实验完毕，将CGRP组及对照组大鼠经过量苯巴比妥钠麻醉后迅速取出心脏以备作ET1结合实验之用。
, 百拇医药
2. 离体心脏灌流 雄性Wistar大鼠，体重170～200g，苯巴比妥钠麻醉(60mg/kg bw,ip)，开胸后迅速分离取出心脏并置于冷生理盐水(Physiological saline,PS)中，然后将心脏置于心脏灌流装置(Langendorff apparatus)，以37 ℃KH灌流液(Krebs Henseileit solution,KH sol)经主动脉逆向恒压 (7.85kPa)灌流，灌流液中充以95%O2,5%CO2气体。KH灌流液组成：1.5 mmol/L NaC1、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1.2 mmol/L MgCl2、25.0 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/LK2PO4及10.0 mmol/L dextrose。连续灌流15min后，随机分为3组(n=6)：E组于灌流液中加入10-9mol ETl/L、EC组灌流液中加入10-9mol/L ET1及10-8mol/L CGRP、对照组则仅为KH液。灌流期间，测定记录冠状动脉流量并收集灌流液。灌流30min后测定灌流液丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)以及心肌MDA含量。
, 百拇医药
3.125I ET1结合分析 按Gu等所报道的方法分离心肌细胞膜。125I ET1(0.0142-1.82nmol/L)与心肌细胞膜于4 ℃孵育240min。孵育液为含0.1mMP MSF的50nM Tris反冲液(pH7.4)。孵育240min后以0.45μm过滤器分离去除游离的125ET1。与心肌细胞膜结合的125ETl则留在过滤器滤膜上，滤膜经冲洗后，用γ计数器测定其放射活性。以0.5μM的非标记的ET1测定ET1与心肌膜的非特异性结合率。总结合率减去非特异性结合率为特异性结合率。
结 果
1. Hα-CGRP对ET1的升压作用的影响 3×10-10mol/L ET1连续静脉输注能导致大鼠平均动脉血压(MAP)持续升高。输入3×10-10mol/L ET1后第1天ET-1组大鼠的MAP由对照组的89.7±2.6 mmHg上升到134.1±3.2 mmHg，两者差异显著(P<0.01)。输入3×10-10mol/L ET1后的第5天，MAP进一步上升到152.4±2.5 mmHg。与之相反，ET1的升压作用能被同时输入等剂量的Hα-CGRP所完全逆转。而单独输入相同剂量(3×10-10mol/L)的Hα-CGRP对大鼠MAP基本无影响。
, 百拇医药
2. Hα-CGRP对ET1灌流所致的离体大鼠心脏损伤的影响 10-9mol/L ET1可致冠状动脉流量快速显著下降、MDA生成及LDH漏出明显增加。对照组的冠状动脉流量、灌流液中MDA含量、心肌MDA含量、灌流液中LDH活性分别为2.92±0.09ml/min、6.05±0.37nmol/min、106.24±5.31nmol/g湿组织及0.63±0.07unit/min,而ET组的这些指标分别为0.82±0.08ml/min、9.79±0.60nmol/min、216.93±7.26nmol/min及1.94±0.31unit/min。ET1的这些作用可被同时输入10-8mol/L CGRP所中和或拮抗。
3.Hα-CGRP对ET1结合位点的影响 将输入CGRP的大鼠及对照组大鼠的心肌细胞膜与0.0142-1.82nmol/L的125I-ET1于4 ℃培养4h进行放射配基结合分析。结果表明，在低浓度的125I-ET1与心肌细胞膜的结合呈浓度依赖性，而高浓度时则不然。Scacthard分析表明，输入CGRP的大鼠的心肌细胞膜与125I-ET1的最大结合率(Bmax)明显低于对照组，分别为77.22±8.92fmol/mg protein及143.1±0.053 fmol/mg protein(P<0.01)，但两者的KD值(binding affinity)相似，分别为0.125±0.045及0.141±0.053nM。
, http://www.100md.com
讨 论
ET参与了一系列心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、心肌梗塞等的发病过程。因而寻找ET的内源性生物学效应拮抗剂对防治心血管疾病具有重要意义。CGRP具有强大的扩张血管、降低血压的作用，广泛分布于支配心血管系统的神经末梢，因而我们推测CGRP是ET的理想的内源性拮抗物质。
本研究中慢性血液动力学实验证明，3×10-10mol/L ET1连续(5天)静脉输注能导致大鼠平均动脉血压(MAP)持续升高，5天后其MAP较对照组大鼠高出61.97 mmHg。ET的这一升压效应能被同时输入等剂量的Hα-CGRP所完全消除。这一结果为临床使用小剂量CGRP治疗与ET有关的高血压提供了实验依据。
心肌是CGRP与ET作用的共同的靶器官，心肌细胞膜上富含CGRP、ET及它们各自的相应受体。本研究中大鼠离体心脏灌注实验结果表明，ET1灌流能导致冠脉流量急剧下降、心肌细胞的严重受损，使其脂质过氧化物丙二醛(malondiadehyde,MDA)生成明显增加，并导致乳酸脱氢酶(LDH)的大量漏出。由ET1所致的各项心肌损伤指标能被同时给予10-8mol/L CGRP而明显改善。这一结果提示，外源性ET1对心肌具有有害作用，而外源性给予CGRP则对心肌具有保护作用，保护其免受ET1的损伤。
, http://www.100md.com
为探讨CGRP拮抗ET的机制，本研究提取CGRP作用后的及对照组大鼠的心肌细胞膜(因心肌细胞膜上存在丰富的ET受体)，利用放射标记的ET1观察了ET1与心肌细胞膜的最大结合率(Bmax)。从本研究的125I-ET1放射配基结合实验可知，Hα-CGRP作用后，大鼠心肌细胞膜与125I-ET1的最大结合率下降，但KD值基本不变。这说明CGRP能下调ET1结合位点的密度而不影响125I-ET1与受体的亲和力。这一结果说明ET受体密度的下调参与了或至少部分参与了CGRP拮抗ET的生物学效应。
以上结果及分析，使我们有理由相信，CGRP是一种非常有效的ET1拮抗物质，CGRP对防治一些与ET有关的心血管疾病具有潜在的临床实用价值。下调ET1结合位点密度可能是CGRP赖以拮抗ET生物学效应的机制之一。
收稿日期：1999-02-02
修稿日期：1999-06-09, 百拇医药
单位：谭敦勇(暨南大学医学院病理生理教研室 510632)
关键词：
降钙素基因相关肽拮抗内皮素生物学效应与内皮素结合位点下调 降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是降钙素基因差异性表达的一种神经肽，具有很强的舒血管作用。内皮素(endothelin,ET)则是一种很强的缩血管多肽，由21个氨基酸组成。ET参与了许多心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化及心肌梗塞等的发病过程。Gardiner等报道CGRP能有效拮抗ET1的缩血管作用。CGRP很可能是一种极有效的ET的内源性拮抗物质。本工作我们进一步观察了Hα-CGRP对ET1所致的血压上升、心肌损伤的影响，并分析了内皮素结合位点在Hα-CGRP拮抗ET时的作用。
实验方法
, http://www.100md.com
1. 在体慢性血液动力学实验 体重190±4g的健康雄性Wistar大鼠，禁食(但自由饮水)18～20h，经苯巴比妥钠麻醉(60 mg/kg b.w,ip)后，行腹主动脉及股静脉插管术，然后两导管经皮下自颈后部引出并与一双导管旋转活结(Swival,Instech,Plymouth Meeting,PA)相连。手术后动物恢复一星期开始实验，置于代谢笼并保持室内温度恒定、环境安静，并随机分为4组(n=5)。实验开始后经静脉导管连续输液5天(12ml/day)：3×10-10mol/L ET1(ET1组)、3×10-10mol/LHα-CGRP(CGRP组)、3×10-10mol/L ET1+3×10-10mol/L Hα-CGRP (EC组) 及等体积的生理盐水(对照组)。动脉导管经旋转活结及压力转换器(Cobe,Lakewood,CO)后与生理记录仪(model 7D,Grass Instruments,Quincy,MA)相连，其血液动力学数据经一模/数(A/D)转换装置转换成数字信号后输入计算机处理、储存。血液动力学实验完毕，将CGRP组及对照组大鼠经过量苯巴比妥钠麻醉后迅速取出心脏以备作ET1结合实验之用。
, 百拇医药
2. 离体心脏灌流 雄性Wistar大鼠，体重170～200g，苯巴比妥钠麻醉(60mg/kg bw,ip)，开胸后迅速分离取出心脏并置于冷生理盐水(Physiological saline,PS)中，然后将心脏置于心脏灌流装置(Langendorff apparatus)，以37 ℃KH灌流液(Krebs Henseileit solution,KH sol)经主动脉逆向恒压 (7.85kPa)灌流，灌流液中充以95%O2,5%CO2气体。KH灌流液组成：1.5 mmol/L NaC1、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1.2 mmol/L MgCl2、25.0 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/LK2PO4及10.0 mmol/L dextrose。连续灌流15min后，随机分为3组(n=6)：E组于灌流液中加入10-9mol ETl/L、EC组灌流液中加入10-9mol/L ET1及10-8mol/L CGRP、对照组则仅为KH液。灌流期间，测定记录冠状动脉流量并收集灌流液。灌流30min后测定灌流液丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)以及心肌MDA含量。
, 百拇医药
3.125I ET1结合分析 按Gu等所报道的方法分离心肌细胞膜。125I ET1(0.0142-1.82nmol/L)与心肌细胞膜于4 ℃孵育240min。孵育液为含0.1mMP MSF的50nM Tris反冲液(pH7.4)。孵育240min后以0.45μm过滤器分离去除游离的125ET1。与心肌细胞膜结合的125ETl则留在过滤器滤膜上，滤膜经冲洗后，用γ计数器测定其放射活性。以0.5μM的非标记的ET1测定ET1与心肌膜的非特异性结合率。总结合率减去非特异性结合率为特异性结合率。
结 果
1. Hα-CGRP对ET1的升压作用的影响 3×10-10mol/L ET1连续静脉输注能导致大鼠平均动脉血压(MAP)持续升高。输入3×10-10mol/L ET1后第1天ET-1组大鼠的MAP由对照组的89.7±2.6 mmHg上升到134.1±3.2 mmHg，两者差异显著(P<0.01)。输入3×10-10mol/L ET1后的第5天，MAP进一步上升到152.4±2.5 mmHg。与之相反，ET1的升压作用能被同时输入等剂量的Hα-CGRP所完全逆转。而单独输入相同剂量(3×10-10mol/L)的Hα-CGRP对大鼠MAP基本无影响。
, 百拇医药
2. Hα-CGRP对ET1灌流所致的离体大鼠心脏损伤的影响 10-9mol/L ET1可致冠状动脉流量快速显著下降、MDA生成及LDH漏出明显增加。对照组的冠状动脉流量、灌流液中MDA含量、心肌MDA含量、灌流液中LDH活性分别为2.92±0.09ml/min、6.05±0.37nmol/min、106.24±5.31nmol/g湿组织及0.63±0.07unit/min,而ET组的这些指标分别为0.82±0.08ml/min、9.79±0.60nmol/min、216.93±7.26nmol/min及1.94±0.31unit/min。ET1的这些作用可被同时输入10-8mol/L CGRP所中和或拮抗。
3.Hα-CGRP对ET1结合位点的影响 将输入CGRP的大鼠及对照组大鼠的心肌细胞膜与0.0142-1.82nmol/L的125I-ET1于4 ℃培养4h进行放射配基结合分析。结果表明，在低浓度的125I-ET1与心肌细胞膜的结合呈浓度依赖性，而高浓度时则不然。Scacthard分析表明，输入CGRP的大鼠的心肌细胞膜与125I-ET1的最大结合率(Bmax)明显低于对照组，分别为77.22±8.92fmol/mg protein及143.1±0.053 fmol/mg protein(P<0.01)，但两者的KD值(binding affinity)相似，分别为0.125±0.045及0.141±0.053nM。
, http://www.100md.com
讨 论
ET参与了一系列心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、心肌梗塞等的发病过程。因而寻找ET的内源性生物学效应拮抗剂对防治心血管疾病具有重要意义。CGRP具有强大的扩张血管、降低血压的作用，广泛分布于支配心血管系统的神经末梢，因而我们推测CGRP是ET的理想的内源性拮抗物质。
本研究中慢性血液动力学实验证明，3×10-10mol/L ET1连续(5天)静脉输注能导致大鼠平均动脉血压(MAP)持续升高，5天后其MAP较对照组大鼠高出61.97 mmHg。ET的这一升压效应能被同时输入等剂量的Hα-CGRP所完全消除。这一结果为临床使用小剂量CGRP治疗与ET有关的高血压提供了实验依据。
心肌是CGRP与ET作用的共同的靶器官，心肌细胞膜上富含CGRP、ET及它们各自的相应受体。本研究中大鼠离体心脏灌注实验结果表明，ET1灌流能导致冠脉流量急剧下降、心肌细胞的严重受损，使其脂质过氧化物丙二醛(malondiadehyde,MDA)生成明显增加，并导致乳酸脱氢酶(LDH)的大量漏出。由ET1所致的各项心肌损伤指标能被同时给予10-8mol/L CGRP而明显改善。这一结果提示，外源性ET1对心肌具有有害作用，而外源性给予CGRP则对心肌具有保护作用，保护其免受ET1的损伤。
, http://www.100md.com
为探讨CGRP拮抗ET的机制，本研究提取CGRP作用后的及对照组大鼠的心肌细胞膜(因心肌细胞膜上存在丰富的ET受体)，利用放射标记的ET1观察了ET1与心肌细胞膜的最大结合率(Bmax)。从本研究的125I-ET1放射配基结合实验可知，Hα-CGRP作用后，大鼠心肌细胞膜与125I-ET1的最大结合率下降，但KD值基本不变。这说明CGRP能下调ET1结合位点的密度而不影响125I-ET1与受体的亲和力。这一结果说明ET受体密度的下调参与了或至少部分参与了CGRP拮抗ET的生物学效应。
以上结果及分析，使我们有理由相信，CGRP是一种非常有效的ET1拮抗物质，CGRP对防治一些与ET有关的心血管疾病具有潜在的临床实用价值。下调ET1结合位点密度可能是CGRP赖以拮抗ET生物学效应的机制之一。
收稿日期：1999-02-02
修稿日期：1999-06-09, 百拇医药