免疫荧光法检测L-NNA对脑缺血再灌流后海马区cGMP合成的影响*
作者：张敬军 陈 青 夏作理 房玉珍
单位：张敬军 夏作理 房玉珍(泰山医学院附属医院微循环研究所, 泰安 271000)；陈 青 山东泰安卫生学校, 泰安 271000
关键词：L-NNA；脑缺血；海马；环磷酸鸟苷
中国药理学通报990419
摘要 目的 探讨 目的 探讨NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)对沙土鼠海马区cGMP合成的影响。方法 钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用免疫荧光法染色。结果 L-NNA能抑制海马区cGMP的合成。结论 L-NNA是一氧化氮合酶强有力的抑制剂，从而抑制了NO的产生及其介导的cGMP的合成。
中国图书分类号 R 392.33； R 341.7； R 743.31；R 971
, http://www.100md.com
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0349-02
Intraventricular administration of L-NNA inhibits cGMP
production in gerbil hippocampus
ZHANG Jing-Jun, CHEN Qing, XIA Zuo-Li, FANG Yu-Zhen
(Institute of Microcirculation, Affliated Hospital of Taishan Medical College,Taian 271000)
ABSTRACT AIM To observe the influence of L-NNA on hippocampal cGMP production after recirculation following ischemia. METHODS Both vessels occlusion and immunofluorescent methods in gerbil hippocampal tissue slices incubated in vitro were used. RESULTS Recirculation following ischemia leads to a rise in hippocampal cGMP concentration. cGMP positive cells mainly distributed in rediatum layer and molecullar in the CA1 subfield, L-NNA decreased cGMP synthesis. L-NNA was a strong NOS inhibitor. CONCLUSION The role of endogenous NO mediating cGMP synthesis is inhibited by L-NNA.
, 百拇医药
KEY WORDS NG-nitro-L-arginine; cerebral ischemia; hippocampus; cGMP
随着对脑缺血发病机制的深入研究，人们对一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂的研究也渐展开。放免测定法不能对脑缺血影响变化的cGMP细胞定位、定性，用免疫荧光法能对脑缺血影响变化的cGMP细胞定位、定性，国内外未见报道。本实验用免疫荧光组织化学法研究L-NNA与NO介导的cGMP的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 ♂沙土鼠70～80 g(约12 wk龄)20只，随机分为两组，实验组及对照组各10只。
1.2 试剂与仪器 NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine,L-NNA， Sigma公司生产)；抗cGMP抗血清及DAF标记的抗羊IgG(chemicon international INC公司)。温差电偶仪(日本 Unique)；脑组织切片机(日本DSK); 低温恒冷切片机(美国AO)。
, http://www.100md.com
1.3 孵化液的配制(mmol.L-1) NaCl 121.1,KCl 1.87,KH2PO4 1.17, MgSO4 1.15,NaHCO3 24.9, CaCl2 1.2, 葡萄糖11.0, pH 7.4[1]。在冰冷的条件下向上述配好的溶液通CO2∶O2(5∶95)进行饱和，20 min后方可使用。
1.4 脑室用药及脑缺血的制作 实验组：立体定向，用汉密尔顿微量调节注射器向右侧侧脑室注射人造脑脊液溶解的L-NNA 5 μl(5 g.L-1)；对照组：用上述方法每只注射人造脑脊液5μl。脑室用药30min后，用15 ml.L-1三氟溴氯乙烷吸入麻醉，选择一侧脑区，在前囟前及前囟一侧各2mm的交叉点，用温差电偶探针垂直进针2mm，监测脑温并维持在(37±0.2)℃。暴露两侧颈总动脉,停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉，5min后，撤夹恢复血流15min。模型成功的标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10s～1 min内昏迷。血流复通后，动物分别在5～10min内苏醒，不合上述标准者弃去不用。
, 百拇医药
1.5 海马脑片的制备与处理 断头、取脑、剥离海马并固定于切片机上，切成300μm 的脑片。将每个样本的脑片分别置于含2mmol.L-1伊菠丁基甲基黄嘌呤的孵化液中，在CO2∶O2(5∶95) 及37℃的孵化箱中孵化40 min；加多聚甲醛(最终浓度40g.L-1)孵化10 min；40g.L-1的多聚甲醛固定2 h；用含50g.L-1蔗糖的TBS洗30 min；再恒冷切片，取出连续6张冠状背侧海马切片，片厚10 μm。
1.6 海马脑片免疫荧光组织化学染色 用100ml.L-1羊血清孵化30 min(37℃)，用抗cGMP抗体(1∶5000)孵化16 h(4℃)。TBS冲洗，用DAF标记抗羊的IgG(1∶200)孵化90 min(37℃)，冲洗、封片、荧光显微镜观片。
, 百拇医药
2 结果
根据染色强度 根据染色强度cGMP阳性细胞可分为强阳性、中等、弱阳性3种类型，强阳性cGMP着色很深，弱阳性cGMP着色很弱，中等强度介于两者之间。对照组：海马本部分布着许多cGMP阳性细胞，cGMP阳性细胞主要分布于CA1区的放射层及分子层，阳性细胞多呈强阳性，形态以圆形或椭圆形的中小型细胞为主，部分细胞突起明显，cGMP阳性纤维是弱的，CA1区锥体细胞未见cGMP阳性细胞。L-NNA组：海马本部分布着少量的cGMP阳性细胞，cGMP阳性细胞多呈弱阳性, cGMP阳性细胞的分布及形态同对照组。实验组较对照组海马本部cGMP阳性细胞明显减少且着色弱。每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，在荧光显微镜下单侧计数海马本部CA1区1 mm长度范围的cGMP阳性细胞数。实验组较对照组cGMP阳性细胞数定量分析结果见表1。每组鼠结果一致，空白对照实验结果为阴性。
Tab 1 cGMP positive cells in the CA1 subfield of the
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control group and experimental group Group
n
±s
Control
10
179±5.7
L-NNA
10
54±3.4**
**P<0.01，compared with control group
, 百拇医药
3 讨论
本研究用免疫荧光组织化学方法观察了NOS抑制剂L-NNA对cGMP合成的影响，探讨了此方法的可行性。此方法为信号传导途径的研究开辟了新的思路，有一定的使用价值。本实验结果表明L-NNA抑制了海马本部cGMP的合成，其机制可能是：脑缺血时，兴奋性递质谷氨酸从突触前膜释放作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度，降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过钙调蛋白进入细胞内，当钙离子达一定浓度时，便激活了神经原生型NOS，引起NO合成增加。NO是浆型鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase, sGC)[2,3]的主要激活剂[4]。暴发性生成的NO除作用合成自已细胞的sGC外，还从突触后膜释放，作用相邻细胞的sGC，NO与sGC上的血红素基因结合，激活sGC，使cGMP合成增加。L-NNA抑制了NOS的活性，也就抑制了NO的产生及cGMP的合成。
海马区细胞内存在着NOS及GC是生成NO以及介导cGMP合成的前提。CA1区锥体细胞未见cGMP阳性细胞，说明脑缺血没有激活CA1区锥体细胞的NOS或者是GC，也有可能CA1区锥体细胞的NOS或GC量少、缺乏或者是特殊亚型。关于这方面理论有待进一步探讨。cGMP阳性细胞主要分布在CA1区的放射层及分子层，说明脑缺血激活的NOS或者GC主要定位于这些细胞。
, http://www.100md.com
*山东省自然科学基金资助课题,No Y98C19048
作者简介:张敬军,男,34岁,副教授,曾赴日本做访问学者1年;
夏作理, 男, 54岁, 教授
参考文献
1 Vente DJ, Bol JGJM, Hudson L et al. Atrial natriuretic factor-responding and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) producing cells in the rat hippocampus: a combined micropharmacological and immunocytochemical approach. Brain Research, 1988;446(2)：387～95
, 百拇医药
2 Garbers DI,Lowe DG. Guanylyl cyclase receptors. J Biol Chem, 1994;269(49):30741～4
3 Murad F.Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide:the NO-cyclic GMP signal transduction system. Adv Pharmacol, 1994;26(1):19～33
4 Garthwaite J, Boulton CL. Nitric oxide signalling in the central nervous system. Annu Rev Physiol, 1995;57:683～706
1998-04-22收稿,1998-12-23修回, 百拇医药
单位：张敬军 夏作理 房玉珍(泰山医学院附属医院微循环研究所, 泰安 271000)；陈 青 山东泰安卫生学校, 泰安 271000
关键词：L-NNA；脑缺血；海马；环磷酸鸟苷
中国药理学通报990419
摘要 目的 探讨 目的 探讨NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)对沙土鼠海马区cGMP合成的影响。方法 钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用免疫荧光法染色。结果 L-NNA能抑制海马区cGMP的合成。结论 L-NNA是一氧化氮合酶强有力的抑制剂，从而抑制了NO的产生及其介导的cGMP的合成。
中国图书分类号 R 392.33； R 341.7； R 743.31；R 971
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文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0349-02
Intraventricular administration of L-NNA inhibits cGMP
production in gerbil hippocampus
ZHANG Jing-Jun, CHEN Qing, XIA Zuo-Li, FANG Yu-Zhen
(Institute of Microcirculation, Affliated Hospital of Taishan Medical College,Taian 271000)
ABSTRACT AIM To observe the influence of L-NNA on hippocampal cGMP production after recirculation following ischemia. METHODS Both vessels occlusion and immunofluorescent methods in gerbil hippocampal tissue slices incubated in vitro were used. RESULTS Recirculation following ischemia leads to a rise in hippocampal cGMP concentration. cGMP positive cells mainly distributed in rediatum layer and molecullar in the CA1 subfield, L-NNA decreased cGMP synthesis. L-NNA was a strong NOS inhibitor. CONCLUSION The role of endogenous NO mediating cGMP synthesis is inhibited by L-NNA.
, 百拇医药
KEY WORDS NG-nitro-L-arginine; cerebral ischemia; hippocampus; cGMP
随着对脑缺血发病机制的深入研究，人们对一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂的研究也渐展开。放免测定法不能对脑缺血影响变化的cGMP细胞定位、定性，用免疫荧光法能对脑缺血影响变化的cGMP细胞定位、定性，国内外未见报道。本实验用免疫荧光组织化学法研究L-NNA与NO介导的cGMP的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 ♂沙土鼠70～80 g(约12 wk龄)20只，随机分为两组，实验组及对照组各10只。
1.2 试剂与仪器 NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine,L-NNA， Sigma公司生产)；抗cGMP抗血清及DAF标记的抗羊IgG(chemicon international INC公司)。温差电偶仪(日本 Unique)；脑组织切片机(日本DSK); 低温恒冷切片机(美国AO)。
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1.3 孵化液的配制(mmol.L-1) NaCl 121.1,KCl 1.87,KH2PO4 1.17, MgSO4 1.15,NaHCO3 24.9, CaCl2 1.2, 葡萄糖11.0, pH 7.4[1]。在冰冷的条件下向上述配好的溶液通CO2∶O2(5∶95)进行饱和，20 min后方可使用。
1.4 脑室用药及脑缺血的制作 实验组：立体定向，用汉密尔顿微量调节注射器向右侧侧脑室注射人造脑脊液溶解的L-NNA 5 μl(5 g.L-1)；对照组：用上述方法每只注射人造脑脊液5μl。脑室用药30min后，用15 ml.L-1三氟溴氯乙烷吸入麻醉，选择一侧脑区，在前囟前及前囟一侧各2mm的交叉点，用温差电偶探针垂直进针2mm，监测脑温并维持在(37±0.2)℃。暴露两侧颈总动脉,停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉，5min后，撤夹恢复血流15min。模型成功的标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10s～1 min内昏迷。血流复通后，动物分别在5～10min内苏醒，不合上述标准者弃去不用。
, 百拇医药
1.5 海马脑片的制备与处理 断头、取脑、剥离海马并固定于切片机上，切成300μm 的脑片。将每个样本的脑片分别置于含2mmol.L-1伊菠丁基甲基黄嘌呤的孵化液中，在CO2∶O2(5∶95) 及37℃的孵化箱中孵化40 min；加多聚甲醛(最终浓度40g.L-1)孵化10 min；40g.L-1的多聚甲醛固定2 h；用含50g.L-1蔗糖的TBS洗30 min；再恒冷切片，取出连续6张冠状背侧海马切片，片厚10 μm。
1.6 海马脑片免疫荧光组织化学染色 用100ml.L-1羊血清孵化30 min(37℃)，用抗cGMP抗体(1∶5000)孵化16 h(4℃)。TBS冲洗，用DAF标记抗羊的IgG(1∶200)孵化90 min(37℃)，冲洗、封片、荧光显微镜观片。
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2 结果
根据染色强度 根据染色强度cGMP阳性细胞可分为强阳性、中等、弱阳性3种类型，强阳性cGMP着色很深，弱阳性cGMP着色很弱，中等强度介于两者之间。对照组：海马本部分布着许多cGMP阳性细胞，cGMP阳性细胞主要分布于CA1区的放射层及分子层，阳性细胞多呈强阳性，形态以圆形或椭圆形的中小型细胞为主，部分细胞突起明显，cGMP阳性纤维是弱的，CA1区锥体细胞未见cGMP阳性细胞。L-NNA组：海马本部分布着少量的cGMP阳性细胞，cGMP阳性细胞多呈弱阳性, cGMP阳性细胞的分布及形态同对照组。实验组较对照组海马本部cGMP阳性细胞明显减少且着色弱。每只动物取出连续6张冠状背侧海马切片，在荧光显微镜下单侧计数海马本部CA1区1 mm长度范围的cGMP阳性细胞数。实验组较对照组cGMP阳性细胞数定量分析结果见表1。每组鼠结果一致，空白对照实验结果为阴性。
Tab 1 cGMP positive cells in the CA1 subfield of the
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control group and experimental group Group
n
±sControl
10
179±5.7
L-NNA
10
54±3.4**
**P<0.01，compared with control group
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3 讨论
本研究用免疫荧光组织化学方法观察了NOS抑制剂L-NNA对cGMP合成的影响，探讨了此方法的可行性。此方法为信号传导途径的研究开辟了新的思路，有一定的使用价值。本实验结果表明L-NNA抑制了海马本部cGMP的合成，其机制可能是：脑缺血时，兴奋性递质谷氨酸从突触前膜释放作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度，降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过钙调蛋白进入细胞内，当钙离子达一定浓度时，便激活了神经原生型NOS，引起NO合成增加。NO是浆型鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase, sGC)[2,3]的主要激活剂[4]。暴发性生成的NO除作用合成自已细胞的sGC外，还从突触后膜释放，作用相邻细胞的sGC，NO与sGC上的血红素基因结合，激活sGC，使cGMP合成增加。L-NNA抑制了NOS的活性，也就抑制了NO的产生及cGMP的合成。
海马区细胞内存在着NOS及GC是生成NO以及介导cGMP合成的前提。CA1区锥体细胞未见cGMP阳性细胞，说明脑缺血没有激活CA1区锥体细胞的NOS或者是GC，也有可能CA1区锥体细胞的NOS或GC量少、缺乏或者是特殊亚型。关于这方面理论有待进一步探讨。cGMP阳性细胞主要分布在CA1区的放射层及分子层，说明脑缺血激活的NOS或者GC主要定位于这些细胞。
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*山东省自然科学基金资助课题,No Y98C19048
作者简介:张敬军,男,34岁,副教授,曾赴日本做访问学者1年;
夏作理, 男, 54岁, 教授
参考文献
1 Vente DJ, Bol JGJM, Hudson L et al. Atrial natriuretic factor-responding and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) producing cells in the rat hippocampus: a combined micropharmacological and immunocytochemical approach. Brain Research, 1988;446(2)：387～95
, 百拇医药
2 Garbers DI,Lowe DG. Guanylyl cyclase receptors. J Biol Chem, 1994;269(49):30741～4
3 Murad F.Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide:the NO-cyclic GMP signal transduction system. Adv Pharmacol, 1994;26(1):19～33
4 Garthwaite J, Boulton CL. Nitric oxide signalling in the central nervous system. Annu Rev Physiol, 1995;57:683～706
1998-04-22收稿,1998-12-23修回, 百拇医药