EBER1原位杂交技术在淋巴瘤诊断中的应用
作者：刘育艳 周慧芳
单位：刘育艳(山西医科大学 030001)；周慧芳(山西医科大学 030001)
关键词：
山西医药杂志000236 应用原 位核酸杂交检测某些特异病毒，可分析病毒与组织损伤的关系及病毒和某些肿瘤的发生发展 的关系。我室用EB病毒编码的RNA(EBER1)原位杂交方法，检测EB病毒在淋巴瘤中的基因表达 ，获得了较好的效果[1-2]。
1 EBER1杂交方法
1.1 溶液、器材的准备
原位杂交试剂为GBI公司提供。探针：生物素标记300 mer寡核苷酸。缓冲液包括：50%(V/V) 甲酰氨、10%(W/V)硫酸葡萄糖、3×SSC(0.45 mol NaCl、0.04 mol枸椽酸钠)、1×Denhar d′s液、100 μg/mL变性鱼精蛋白、125 μg/mL酵母菌tRNA、20 mL PBS(pH7.4)。原位杂交 所用缓冲液均用DEPC水配制。所用器械、容器、缓冲液全部高压灭菌(120 ℃、15磅)30 min ，以防RNA酶污染。所用盖玻片最好进行硅化处理。
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1.2 EBER1杂交步骤
1.2.1 石蜡切片4 μm厚，贴附于经APES防脱片剂处理过的载玻片上，60 ℃温箱烘烤2 h ，室温下，干净处贮存备用。
1.2.2 石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精脱水。
1.2.3 0.1 mol/L PBS洗二次，每次3 min。
1.2.4 0.1 mol/L HCl室温处理10 min，增强组织的渗透力。
1.2.5 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
1.2.6 3 mg/mL蛋白酶消化10 min，37 ℃恒温箱内。
1.2.7 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
, 百拇医药
1.2.8 4%多聚甲醛作后固定10 min，室温下。
1.2.9 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
1.2.10 杂交：滴加0.25 mg/mL探针(每张切片均需20 μL)后，迅速加盖硅化好的盖玻 片，用塑料薄膜围封盖片四周，置切片于60 ℃温箱10 min后立即转入37 ℃恒温箱过夜(湿 盒内)。
1.2.11 取出切片小心取下盖玻片，充分洗涤切片：①3×SSC洗2次，每次10 min；②1 ×SSC洗2次，每次10 min；③PBS洗2次，每次5 min。
1.2.12 3%H2O2-PBS液10 min，室温下封闭内源性过氧化物酶。
1.2.13 PBS洗2次，每次3 min。
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1.2.14 加链亲和素/过氧化物酶，37 ℃温箱内孵育30 min。
1.2.15 PBS洗2次，每次3 min。
1.2.16 1 mg/μL DAB显色8～10 min。
1.2.17 自来水洗后蒸馏水洗5 min。
1.2.18 0.2%甲基绿复染细胞核。
1.2.19 常规脱水、透明、封片。
2 EBER1原位杂交结果
原位杂交阳性信号呈蓝紫色，定位于细胞核内(核膜下、核仁、核浆区)阴性细胞核呈浅绿色 。
3 注意事项
, 百拇医药
3.1 在EBER1原位杂交操作过程中，必须带一次性乳胶(塑料也可)手套，避免手汗造成的R NA酶的污染。
3.2 设制对照切片，确保原位杂交结果的准确性。用经PCR技术证实的EB病毒阳性淋巴病 作阳性对照；用与EB病毒无关的淋巴组织炎性病变作阴性对照；用不加探针的缓冲液作空白 对照。
4 讨 论
EBER1原位杂交与打点杂交、Southern-Hot杂交及PCR比较，具有如下优点：①定位明确：原 位杂交检测的是细胞内的核酸片段，所以它保存了细胞的形态结构和组织的立体构型。这种 高度的空间分辨力可检定出含病毒的具体细胞，直接显示阳性细胞的数目、定位及类型，更 便于了解病毒与疾病的关系。②高度敏感性：EBER1原位杂交法通过标记探针与EBER1的碱基 互补结合，来检测EBER1。EBER1为EB病毒在潜伏性感染状态编码的一种RNA，在感染细胞中 ，其数量可达106个/细胞，大大超过了EB病毒DNA的数量，以EBER1为探测目标，阳性基因 极易表达，大幅度提高了原位杂交法的敏感性。③对常规石蜡包埋组织块可进行回顾性的研 究。
, 百拇医药
本实验用的寡核苷酸探针和长链核苷酸探针相比，长链探针不易穿透组织，未结合的探针不 易洗脱，必须长时间的、严格的洗脱条件，易造成背景着色深、实验周期长等不良后果；而 寡核苷酸探针组织渗透性强，背景着色淡，48 h即可完成，为临床推广EB病毒的原位检测提 供了条件。
生物素标记与同位素标记比较，前者可避免放射性感染，只需用充足的时间和相当浓度的H 2O2封闭过氧化物酶，即可大幅度降低背景染色，而且背景着色多在胞浆，阳性信号却 位于胞核内，二者极易鉴别。
作者简介：刘育艳，女，1956年10月生，主管技师，山西医科大学，030001
参考文献：
1，周小鸽，严庆汉，张小平.EB病毒编码的RNA及EB病毒潜在膜蛋白在中线T淋巴瘤 中的表达.中华病理学杂志，1995，24(2)：69-71
2，李佩娟，周小鸽，刘淑荣.82例小儿何杰金淋巴瘤与EB病毒相关的研究.中华病 理学杂志，1994，23(4)：224-226
收稿日期：1999-10-28, 百拇医药
单位：刘育艳(山西医科大学 030001)；周慧芳(山西医科大学 030001)
关键词：
山西医药杂志000236 应用原 位核酸杂交检测某些特异病毒，可分析病毒与组织损伤的关系及病毒和某些肿瘤的发生发展 的关系。我室用EB病毒编码的RNA(EBER1)原位杂交方法，检测EB病毒在淋巴瘤中的基因表达 ，获得了较好的效果[1-2]。
1 EBER1杂交方法
1.1 溶液、器材的准备
原位杂交试剂为GBI公司提供。探针：生物素标记300 mer寡核苷酸。缓冲液包括：50%(V/V) 甲酰氨、10%(W/V)硫酸葡萄糖、3×SSC(0.45 mol NaCl、0.04 mol枸椽酸钠)、1×Denhar d′s液、100 μg/mL变性鱼精蛋白、125 μg/mL酵母菌tRNA、20 mL PBS(pH7.4)。原位杂交 所用缓冲液均用DEPC水配制。所用器械、容器、缓冲液全部高压灭菌(120 ℃、15磅)30 min ，以防RNA酶污染。所用盖玻片最好进行硅化处理。
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1.2 EBER1杂交步骤
1.2.1 石蜡切片4 μm厚，贴附于经APES防脱片剂处理过的载玻片上，60 ℃温箱烘烤2 h ，室温下，干净处贮存备用。
1.2.2 石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精脱水。
1.2.3 0.1 mol/L PBS洗二次，每次3 min。
1.2.4 0.1 mol/L HCl室温处理10 min，增强组织的渗透力。
1.2.5 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
1.2.6 3 mg/mL蛋白酶消化10 min，37 ℃恒温箱内。
1.2.7 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
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1.2.8 4%多聚甲醛作后固定10 min，室温下。
1.2.9 0.1 mol/L PBS洗2次，每次3 min。
1.2.10 杂交：滴加0.25 mg/mL探针(每张切片均需20 μL)后，迅速加盖硅化好的盖玻 片，用塑料薄膜围封盖片四周，置切片于60 ℃温箱10 min后立即转入37 ℃恒温箱过夜(湿 盒内)。
1.2.11 取出切片小心取下盖玻片，充分洗涤切片：①3×SSC洗2次，每次10 min；②1 ×SSC洗2次，每次10 min；③PBS洗2次，每次5 min。
1.2.12 3%H2O2-PBS液10 min，室温下封闭内源性过氧化物酶。
1.2.13 PBS洗2次，每次3 min。
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1.2.14 加链亲和素/过氧化物酶，37 ℃温箱内孵育30 min。
1.2.15 PBS洗2次，每次3 min。
1.2.16 1 mg/μL DAB显色8～10 min。
1.2.17 自来水洗后蒸馏水洗5 min。
1.2.18 0.2%甲基绿复染细胞核。
1.2.19 常规脱水、透明、封片。
2 EBER1原位杂交结果
原位杂交阳性信号呈蓝紫色，定位于细胞核内(核膜下、核仁、核浆区)阴性细胞核呈浅绿色 。
3 注意事项
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3.1 在EBER1原位杂交操作过程中，必须带一次性乳胶(塑料也可)手套，避免手汗造成的R NA酶的污染。
3.2 设制对照切片，确保原位杂交结果的准确性。用经PCR技术证实的EB病毒阳性淋巴病 作阳性对照；用与EB病毒无关的淋巴组织炎性病变作阴性对照；用不加探针的缓冲液作空白 对照。
4 讨 论
EBER1原位杂交与打点杂交、Southern-Hot杂交及PCR比较，具有如下优点：①定位明确：原 位杂交检测的是细胞内的核酸片段，所以它保存了细胞的形态结构和组织的立体构型。这种 高度的空间分辨力可检定出含病毒的具体细胞，直接显示阳性细胞的数目、定位及类型，更 便于了解病毒与疾病的关系。②高度敏感性：EBER1原位杂交法通过标记探针与EBER1的碱基 互补结合，来检测EBER1。EBER1为EB病毒在潜伏性感染状态编码的一种RNA，在感染细胞中 ，其数量可达106个/细胞，大大超过了EB病毒DNA的数量，以EBER1为探测目标，阳性基因 极易表达，大幅度提高了原位杂交法的敏感性。③对常规石蜡包埋组织块可进行回顾性的研 究。
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本实验用的寡核苷酸探针和长链核苷酸探针相比，长链探针不易穿透组织，未结合的探针不 易洗脱，必须长时间的、严格的洗脱条件，易造成背景着色深、实验周期长等不良后果；而 寡核苷酸探针组织渗透性强，背景着色淡，48 h即可完成，为临床推广EB病毒的原位检测提 供了条件。
生物素标记与同位素标记比较，前者可避免放射性感染，只需用充足的时间和相当浓度的H 2O2封闭过氧化物酶，即可大幅度降低背景染色，而且背景着色多在胞浆，阳性信号却 位于胞核内，二者极易鉴别。
作者简介：刘育艳，女，1956年10月生，主管技师，山西医科大学，030001
参考文献：
1，周小鸽，严庆汉，张小平.EB病毒编码的RNA及EB病毒潜在膜蛋白在中线T淋巴瘤 中的表达.中华病理学杂志，1995，24(2)：69-71
2，李佩娟，周小鸽，刘淑荣.82例小儿何杰金淋巴瘤与EB病毒相关的研究.中华病 理学杂志，1994，23(4)：224-226
收稿日期：1999-10-28, 百拇医药