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药物生物技术990416人白细胞介素-3突变体的构建及
在大肠杆菌中表达的研究
为了在大肠杆菌中高效表达hIL-3cDNA，获得hIL-3蛋白，拟对天然型hIL-3进行构建以获得新的突变体，同时进行了活性测定，以便深入了解hIL-3的结构与功能之间的关系。利用PCR技术对天然型hIL-3N末端第3位蛋氨酸(Met3)和C末端第17位蛋氨酸(Lys116)进行定点突变，获得突变体MhIL-3和MVhIL-3。结果经Suger双脱氧法测序证实突变体MhIL-3cDNA，MVhIL-3cDNA的活性为6.9×104U/ml，而天然型的是1.5×104U/ml。天然型pSM53hNIL-3表达量占菌体总蛋白的7%，突变型pSM53MVhIL-3表达量占菌体总蛋白的16%。证明人IL-3cDNA可通过PCR技术进行定点突变，所获得的突变型pSM53MVhIL-3活性比天然型pSM53hIL-3高3～4倍。
, http://www.100md.com
王 燕，朱锡华，万 瑛等(中国免疫学杂志，1999，15(1)：16)
人可溶性IL-6R及其突变体基因在
COS7细胞中的表达及活性分析
研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。首先利用PCR技术扩增天然人sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile。天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Westernblot检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用BindingassayELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结构能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力，但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。说明第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。
, 百拇医药
宋 伦 任蕴芳 王建安 沈倍奋(中国免疫学杂志，1999，15(5)：1)
人IL-16C端cDNA的克隆表达及初步鉴定
人IL-16是近年报道的一个新的细胞因子，其C端130个氨基酸的分泌型IL-16广泛地参与了体内的免疫调节及炎症反应，并具有抑制HIV复制等多种功能，经从ConA刺激人外周血单核细胞中分离总RNA，采用RT-PCR、分子克隆及序列测定的方法获得了IL-16C端130个氨基酸编码区的cDNA，并在生物素化融合蛋白表达系统中表达和纯化了该蛋白，结果表明：所得到的中国人IL-16C端的编码序列与国外报道的序列完全一致；已获得的33kD融合蛋白易于纯化，这一工作为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。
甘立霞 曹廷兵 钟小林(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：532)
赤子爱胜蚓五种纤溶酶组分的分离纯化及
, 百拇医药
对纤维蛋白原酶解的初步研究
经硫酸铵盐析沉淀和PAGE制备电泳，从赤子爱胜蚓(Eiseniafoelide)粗品中分离纯化出五种纤溶酶组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，在PAGE中均呈现单一带。组份Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ能将纤维蛋白原中α、β、γ链依次降解，对α链亲和力最大。组份X不能降解43.5KD、40KD、24.5KD片段。组份Ⅰ对α链有较高亲和力而对γ链无降解作用。
彭先凤 杨继虞 陶建宁等(华西药学杂志，1999，14(1)：16)
人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定
克隆中国人IL-12p40基因，构建IL-12的真核基因表达载体。采用RT-PCR从北京地区人脐血树突状细胞(DC)中克隆IL-12p40cDNA基因，并进行序列分析。利用pcDNA3.1和pLXPXSN构建IL-12表达载体，转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果北京地区人DC中IL-12p40cDNA基因210位密码子有独特的结构，为GCC(Ala)。并且239和291位密码子与已报道的NKSF和CLMFp40序列各有异同，在与国外提供的p35基因共同转染细胞后能产生功能性的IL-12。用其构建的IL-12双亚基共表达逆转录病毒载体在转染肝癌细胞株并经选择后，上清液中有较高的具有刺激淋巴母细胞增殖活性的IL-12。Westernblot分析结果显示，在70kD处有特异性的蛋白条带出现。结果支持人IL-12p40基因可能存在着多态性的假设；IL-12的产生需要p35和p40基因的共同表达。
, 百拇医药
曲春枫 孙宗棠(中国免疫学杂志，1999，5(1)：13)
凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂
的构建、表达、纯化和性质研究
用Kunkel突变法，将单链尿激酶型纤溶酶激活剂(scu-PA)cDNA基因中编码Pro155-Lys158的片段定点突变，并将此突变的suc-PA(tscu-PA)的cDNA克隆到表达载体pCM-β-neo中，与pCM-dhfr共转染CHO/DHFR细胞，获得的稳定表达株在无血清培养基中24h的表达量为620IU/106细胞，经锌离子螯合Sepharose亲和层析得到tscu-PA纯品。SDS-PAGE显示tscu-PA分子量为53kD左右，与预期的结果相符。tscu-PA是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活，但激活也能转变为双键分子(ttcu-PA)。tscu-PA仍保持了scu-PA的血纤维蛋白亲和性。酶动力学研究表明，激活后的tscu-PA水解S2444的Km和Kcat值与高分子量尿激酶(HUK)相似。体外溶栓实验结果表明，tscu-PA可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块，对贫凝血酶的血凝块作用不大。
, 百拇医药
张彦斌 徐长法(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(3)：403)
人白细胞介素-17基因的克隆、表达
及其表达产物的分离纯化
利用RT-PCR方法成功地从PI(PMA，Ionomycin)、PHA活化的人T细胞中扩增出hIL-17编码区cDNA(468bp)，克隆测定证实得到该基因，用特殊设计的引物扩增hIL-17成熟肽编码区(414bp)，接入表达载体pET30a质粒中。pET30a-mhIL-17在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，目的蛋白占总菌体蛋白50%左右。经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性，得到单体型rmhIL-17，纯度达98%以上，N端16个氨基酸序列分析，结果与文献报道一致。SDS-PAGE法测定分子量的16kD，薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为pH8.8～8.9，3HTdR参入法测定rmhIL-17单体的体外活性，实验结果表明rmhIL-17对PHA活化人的PBMC细胞具有抑制作用，结果同可溶型IL-17R性质相似。
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王建勋 陈松森 狄 旭等(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(3)：398)
组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原
B链嵌合分子的构建与表达
利用DNA重组技术和定位删除技术，将组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的A链(Serl-Thr263)基因与尿激酶原(pro-UK)的B链(Ser138-Leu411)基因相连，得到嵌合分子基因tu-pa，并在昆虫杆状病毒系统中进行表达，表达量可达500IU/ml.经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液，得到tu-PA嵌合分子，其比活为200000IU/mg蛋白。SDS-PAGE及Westernblot鉴定证明此表达产物分子量约为60kD，与预期值相符，纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明，此嵌合分子的溶纤活性与pro-UK相近，而纤维蛋白亲和性高于pro-UK。
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赵春梅 张洪涛 胡美浩(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：528)
华广虻(Tabanus amaenus Walker)
溶纤活性蛋白的纯化及生物活性分析
经过75%饱和度硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶过滤层板、Lys-Sepharose4B亲和层析和电泳制备洗脱，从华广虻(TabanusamaenusWalker)腹部组织匀浆液中分离纯化出分子量约为67kD的溶纤活性蛋白TAFP。经纤维蛋白平板测定表明，TAFP只具有纤溶酶作用，不具有激活纤溶酶原的作用；但TAFP能分解纤溶酶原激活剂的生色底物——ChromozymUK及S-2288。还能水解胰蛋白酶专一底物Bz-Phe-Val-Arg-NA及CBZ-Gly-Pro-Arg-NA，表明TAFP具有类胰蛋白酶活性，专一水解精氨酸形成的酰胺键(或肽键)。TAFP无胰凝乳蛋白酶活性。
, 百拇医药
杨星勇 程惊秋 裴 炎等(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：580)
赤子爱胜蚓五种纯化纤溶酶的理化性质研究
从赤子爱胜蚓(Eiseniafoeliad)粗制品中纯化出五种纤溶酶组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，在PAGE中均呈现单一带，并富含酸性氨基酸，酪氨酸含量也较高；SDS-PAGE测得分子量分别为34000、30500、27000、24500和21500；pI为pH3.80～4.25不等；最大吸收峰均在276nm；在pH6.0～10.0及50℃以下有较高的稳定性；最适pH在8.5左右；最适温度为(60±2)℃。组分Ⅰ在70℃(10min)时活性不变，对某些变性剂表现出一定耐受性，其活性不被贵州小慈菇蛋白酶抑制。
彭先凤 陶建宁 杨继虞等(华西药学杂志，1999，14(2)：98)
组织纤溶酶原激活剂突变体
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乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究
通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子，以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5'区5kb为调控序列，构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射，经PCR和Southernblot检测获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠，整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northernblot分析表明，在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL，这为利用转基因动物生产La-tPA提供依据。
卢一凡 邓继先 程 萱等(生物工程学报，1999，15(2)： )
缺失突变法研究尿激酶——单链抗体融合基因在
大肠杆菌中的高表达
对抗人纤维蛋白二聚体单链抗体与scu-PA-32K融合基因的表达质粒进行内切酶切割、拼接和外切酶Bal31消化，得到了该融合基因的一系列缺失突变体，通过对这些突变体表达情况的研究，将影响表达的关键因素定位于基因的841～851位，可能对应于两个连排的大肠杆菌稀有密码子AGG(精氨酸)，用PCR定位诱变法把这两个AGG均改造成CGT后，融合蛋白的表达量从改造前的2%～3%提高到约30%。
王 翔 俞炜源(生物工程学报，1999，15(1)：23), 百拇医药
单位：
关键词：
药物生物技术990416人白细胞介素-3突变体的构建及
在大肠杆菌中表达的研究
为了在大肠杆菌中高效表达hIL-3cDNA，获得hIL-3蛋白，拟对天然型hIL-3进行构建以获得新的突变体，同时进行了活性测定，以便深入了解hIL-3的结构与功能之间的关系。利用PCR技术对天然型hIL-3N末端第3位蛋氨酸(Met3)和C末端第17位蛋氨酸(Lys116)进行定点突变，获得突变体MhIL-3和MVhIL-3。结果经Suger双脱氧法测序证实突变体MhIL-3cDNA，MVhIL-3cDNA的活性为6.9×104U/ml，而天然型的是1.5×104U/ml。天然型pSM53hNIL-3表达量占菌体总蛋白的7%，突变型pSM53MVhIL-3表达量占菌体总蛋白的16%。证明人IL-3cDNA可通过PCR技术进行定点突变，所获得的突变型pSM53MVhIL-3活性比天然型pSM53hIL-3高3～4倍。
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王 燕，朱锡华，万 瑛等(中国免疫学杂志，1999，15(1)：16)
人可溶性IL-6R及其突变体基因在
COS7细胞中的表达及活性分析
研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。首先利用PCR技术扩增天然人sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile。天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Westernblot检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用BindingassayELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结构能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力，但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。说明第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。
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宋 伦 任蕴芳 王建安 沈倍奋(中国免疫学杂志，1999，15(5)：1)
人IL-16C端cDNA的克隆表达及初步鉴定
人IL-16是近年报道的一个新的细胞因子，其C端130个氨基酸的分泌型IL-16广泛地参与了体内的免疫调节及炎症反应，并具有抑制HIV复制等多种功能，经从ConA刺激人外周血单核细胞中分离总RNA，采用RT-PCR、分子克隆及序列测定的方法获得了IL-16C端130个氨基酸编码区的cDNA，并在生物素化融合蛋白表达系统中表达和纯化了该蛋白，结果表明：所得到的中国人IL-16C端的编码序列与国外报道的序列完全一致；已获得的33kD融合蛋白易于纯化，这一工作为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。
甘立霞 曹廷兵 钟小林(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：532)
赤子爱胜蚓五种纤溶酶组分的分离纯化及
, 百拇医药
对纤维蛋白原酶解的初步研究
经硫酸铵盐析沉淀和PAGE制备电泳，从赤子爱胜蚓(Eiseniafoelide)粗品中分离纯化出五种纤溶酶组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，在PAGE中均呈现单一带。组份Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ能将纤维蛋白原中α、β、γ链依次降解，对α链亲和力最大。组份X不能降解43.5KD、40KD、24.5KD片段。组份Ⅰ对α链有较高亲和力而对γ链无降解作用。
彭先凤 杨继虞 陶建宁等(华西药学杂志，1999，14(1)：16)
人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定
克隆中国人IL-12p40基因，构建IL-12的真核基因表达载体。采用RT-PCR从北京地区人脐血树突状细胞(DC)中克隆IL-12p40cDNA基因，并进行序列分析。利用pcDNA3.1和pLXPXSN构建IL-12表达载体，转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果北京地区人DC中IL-12p40cDNA基因210位密码子有独特的结构，为GCC(Ala)。并且239和291位密码子与已报道的NKSF和CLMFp40序列各有异同，在与国外提供的p35基因共同转染细胞后能产生功能性的IL-12。用其构建的IL-12双亚基共表达逆转录病毒载体在转染肝癌细胞株并经选择后，上清液中有较高的具有刺激淋巴母细胞增殖活性的IL-12。Westernblot分析结果显示，在70kD处有特异性的蛋白条带出现。结果支持人IL-12p40基因可能存在着多态性的假设；IL-12的产生需要p35和p40基因的共同表达。
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曲春枫 孙宗棠(中国免疫学杂志，1999，5(1)：13)
凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂
的构建、表达、纯化和性质研究
用Kunkel突变法，将单链尿激酶型纤溶酶激活剂(scu-PA)cDNA基因中编码Pro155-Lys158的片段定点突变，并将此突变的suc-PA(tscu-PA)的cDNA克隆到表达载体pCM-β-neo中，与pCM-dhfr共转染CHO/DHFR细胞，获得的稳定表达株在无血清培养基中24h的表达量为620IU/106细胞，经锌离子螯合Sepharose亲和层析得到tscu-PA纯品。SDS-PAGE显示tscu-PA分子量为53kD左右，与预期的结果相符。tscu-PA是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活，但激活也能转变为双键分子(ttcu-PA)。tscu-PA仍保持了scu-PA的血纤维蛋白亲和性。酶动力学研究表明，激活后的tscu-PA水解S2444的Km和Kcat值与高分子量尿激酶(HUK)相似。体外溶栓实验结果表明，tscu-PA可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块，对贫凝血酶的血凝块作用不大。
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张彦斌 徐长法(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(3)：403)
人白细胞介素-17基因的克隆、表达
及其表达产物的分离纯化
利用RT-PCR方法成功地从PI(PMA，Ionomycin)、PHA活化的人T细胞中扩增出hIL-17编码区cDNA(468bp)，克隆测定证实得到该基因，用特殊设计的引物扩增hIL-17成熟肽编码区(414bp)，接入表达载体pET30a质粒中。pET30a-mhIL-17在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，目的蛋白占总菌体蛋白50%左右。经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性，得到单体型rmhIL-17，纯度达98%以上，N端16个氨基酸序列分析，结果与文献报道一致。SDS-PAGE法测定分子量的16kD，薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为pH8.8～8.9，3HTdR参入法测定rmhIL-17单体的体外活性，实验结果表明rmhIL-17对PHA活化人的PBMC细胞具有抑制作用，结果同可溶型IL-17R性质相似。
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王建勋 陈松森 狄 旭等(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(3)：398)
组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原
B链嵌合分子的构建与表达
利用DNA重组技术和定位删除技术，将组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的A链(Serl-Thr263)基因与尿激酶原(pro-UK)的B链(Ser138-Leu411)基因相连，得到嵌合分子基因tu-pa，并在昆虫杆状病毒系统中进行表达，表达量可达500IU/ml.经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液，得到tu-PA嵌合分子，其比活为200000IU/mg蛋白。SDS-PAGE及Westernblot鉴定证明此表达产物分子量约为60kD，与预期值相符，纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明，此嵌合分子的溶纤活性与pro-UK相近，而纤维蛋白亲和性高于pro-UK。
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赵春梅 张洪涛 胡美浩(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：528)
华广虻(Tabanus amaenus Walker)
溶纤活性蛋白的纯化及生物活性分析
经过75%饱和度硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶过滤层板、Lys-Sepharose4B亲和层析和电泳制备洗脱，从华广虻(TabanusamaenusWalker)腹部组织匀浆液中分离纯化出分子量约为67kD的溶纤活性蛋白TAFP。经纤维蛋白平板测定表明，TAFP只具有纤溶酶作用，不具有激活纤溶酶原的作用；但TAFP能分解纤溶酶原激活剂的生色底物——ChromozymUK及S-2288。还能水解胰蛋白酶专一底物Bz-Phe-Val-Arg-NA及CBZ-Gly-Pro-Arg-NA，表明TAFP具有类胰蛋白酶活性，专一水解精氨酸形成的酰胺键(或肽键)。TAFP无胰凝乳蛋白酶活性。
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杨星勇 程惊秋 裴 炎等(中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：580)
赤子爱胜蚓五种纯化纤溶酶的理化性质研究
从赤子爱胜蚓(Eiseniafoeliad)粗制品中纯化出五种纤溶酶组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，在PAGE中均呈现单一带，并富含酸性氨基酸，酪氨酸含量也较高；SDS-PAGE测得分子量分别为34000、30500、27000、24500和21500；pI为pH3.80～4.25不等；最大吸收峰均在276nm；在pH6.0～10.0及50℃以下有较高的稳定性；最适pH在8.5左右；最适温度为(60±2)℃。组分Ⅰ在70℃(10min)时活性不变，对某些变性剂表现出一定耐受性，其活性不被贵州小慈菇蛋白酶抑制。
彭先凤 陶建宁 杨继虞等(华西药学杂志，1999，14(2)：98)
组织纤溶酶原激活剂突变体
, http://www.100md.com
乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究
通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子，以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5'区5kb为调控序列，构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射，经PCR和Southernblot检测获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠，整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northernblot分析表明，在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL，这为利用转基因动物生产La-tPA提供依据。
卢一凡 邓继先 程 萱等(生物工程学报，1999，15(2)： )
缺失突变法研究尿激酶——单链抗体融合基因在
大肠杆菌中的高表达
对抗人纤维蛋白二聚体单链抗体与scu-PA-32K融合基因的表达质粒进行内切酶切割、拼接和外切酶Bal31消化，得到了该融合基因的一系列缺失突变体，通过对这些突变体表达情况的研究，将影响表达的关键因素定位于基因的841～851位，可能对应于两个连排的大肠杆菌稀有密码子AGG(精氨酸)，用PCR定位诱变法把这两个AGG均改造成CGT后，融合蛋白的表达量从改造前的2%～3%提高到约30%。
王 翔 俞炜源(生物工程学报，1999，15(1)：23), 百拇医药