野菊花抑菌和抗病毒作用实验研究
作者：任爱农 王志刚 卢振初 王礼文 吴亦伦
单位：任爱农 王志刚 卢振初 王礼文(江苏省中医药研究院，南京210028)；吴亦伦(安徽省医学科学研究所，合肥230061)
关键词：野菊花；抑菌；抗病毒
药物生物技术990412
摘 要 对野菊花水提物与挥发油的抑菌和抗病毒活性实验研究结果表明,二者均具抑菌和抗病毒活性。对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、福氏志贺菌的抑制作用及抗病毒活性,水提物强于挥发油,而对肺炎链球菌,则相反。
Study on Bacteriostasis and Antivirotic
Activity of Flos Chrysanthemum Indici
, http://www.100md.com
Ren Ainong, Wang Zhigang, Lu Zhengchu, Wang Liwen,1Wu Yilun
(Jiangsu province Research fellow of Traditional Chinese Medicament,Nanjing 210028；1Anhui province Research Institute of Medical Scitasis,Antivirotic ences, Hefei 230061)
Abstract Study of bacteriostasis and antivirotic activity by a q ueous extract and volutile oils of Flos Chrysanthumum Indici. It is conclude d th at the aqueous extract is stronger than the volutile oils for Staphylococcus aur eus, Escherichia coli, Pseudomonas pyocyanea, Shigella dysenteriae and antivirot ic activity. But it is inverse for Streptococcus pneumoniae.
, 百拇医药
Key Words Flos Chrysanthemum Indici, Bacteriostasis, Antivi rotic activity
中药材野菊花临床上功用主治为:清热解毒,主治痈肿、疔疮、目赤、痢疾、湿疹、温热头痛等[1]，其水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有抑制作用[2]，但挥发油的抑菌试验及抗病毒试验未见报道。我们分别对野菊花的挥发性成分和水提物同时进行了抑菌和抗病毒实验研究,为临床用药提供依据。
1 材 料
1.1 原药材鉴定
野菊花采集于南京老山,经南京中医药大学刘训红副教授鉴定为野菊Chysanthemum indicum L.的头状花序。
1.2 细菌
, http://www.100md.com
肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌及福氏志贺菌由江苏省中医院检验科提供。
1.3 病毒、细胞
流行性感冒病毒A3/汉防/359/95(H3N2),狗肾传代细胞(MDCK)引自国家流感中心。
1.4 药 品
病毒唑注射液,由上海禾丰制药有限公司(0.1g/ml)生产。
2 方 法
2.1 野菊花水提物和挥发油的制备
取阴干的头状花序,用水蒸气馏法提取挥发油,经硫酸钠脱水,得蓝绿色挥发油(每ml挥发油含生药材300g)。再取其去油后的野菊花加水煎煮,滤取煎煮液,浓缩至适当浓度，真空干燥，得水提物干膏(每克干膏含生药5g)。临用前挥发油和干膏加水配制成所需浓度。
, 百拇医药
2.2 抑菌试验
2.2.1 琼脂打洞扩散法 将肺炎链球菌(1010个/ml),大肠埃希菌(105个/ml),福氏志贺菌(105个/ml),绿脓假单胞菌(105个/ml)和金黄色葡萄球菌(105个/ml),分别涂布于厚约6mm的药皿平板上,然后在其中打成直径约6mm的孔若干,加满野菊花水提物(1.16g干膏/ml)和野菊花挥发油,37℃培养24h,观察抑菌圈大小。
2.2.2 琼脂扩散法 在血平板上加入野菊花水提物及挥发油,取水提物干膏加水溶解,使水提物(以干膏重量克计)浓度分别为0.2g/ml,0.1g/ml,0.05g/ml,0.025g/ml,0.0125g/ml。再取挥发油加水稀释，加适量乳化剂，用剪切乳化机高速搅拌得到均匀的乳化液，其浓度(以含油量ml计)分别为5%,2.5%,1.25%,0.625%,0.325%,0.156%。然后在血平板上点种肺炎链球菌(1010/ml),大肠埃希菌(105个/ml),福氏志贺菌(105个/ml),绿脓假单胞菌(105个/ml)和金黄色葡萄球菌(105个/ml)。37℃培养24h分别观察野菊花水提物和挥发油的抑制生长的最低药物浓度MIC。
, http://www.100md.com
2.3 抗病毒试验
2.3.1 病毒毒力测定 MDCK细胞96孔板,用无血清培养液洗两次,加入病毒10倍系例稀释液,每稀释度接种4孔、35℃、5%CO2中吸附2h后弃去病毒液,换入维持液(不含牛血清、含2μg/ml胰酶)继续培养3d,观察细胞病变情况(CPE),测定该病毒半数感染量(TCID50)。
2.3.2 药物对细胞毒性测定 MDCK细胞96孔板,加入2倍系列稀释药液(水提物0.4g/ml,挥发油)各7个浓度,每稀释度4孔,35℃,5%CO2培养3d,观察CPE,找出药物最大无毒浓度(TCD0)。
2.3.3 抗病毒实验 MDCK细胞96孔培养板,加入10TCID50病毒液(病毒液作10-3稀释),35℃,5%CO2吸附2h,弃去病毒液,加入最大无毒浓度药液2倍系列稀释液各6个浓度,每一稀释度3孔,培养3d,观察CPE,测定药物对CPE的抑制。同时设病毒对照(不加药液),细胞对照(不加病毒),药物对照(细胞不加病毒,加以不同浓度药液)。
, http://www.100md.com
3 结 果
3.1 抑菌试验
3.1.1 琼脂打洞扩散法 琼脂打洞扩散法抑菌试验结果见表1。
Tab 1 Bacteriostatic result by agar punch diffusion Bacteria
Diameter of bacteriostatic circle
Aqueous extract(mm)
VolutiLe oil(mm)
Streptococcus pneumoniae(1010cells/ml)
, 百拇医药
8
14
Staphylococcus aureus (105cells/ml)
12
15
Escherichia coli (105cells/ml)
8
13
Pseudomonas pyocyanea (105cells/ml)
9
, 百拇医药 10
Shigella dysenteriae (105cells/ml)
10
13
由表1可知，野菊花水提物及挥发油均形成一定直径的抑菌圈 ，显示有较强的抑菌作用。
3.1.2 琼脂扩散法 琼脂扩散法抑菌试验结果见表2。Tab 2 Bacteriostatic result by agar diffusion Bacteria
Minimum inhibitory concentration
Aqueous extract(%)
, 百拇医药
VolutiLe oil(%)
Streptococcus pneumoniae(1010cells/ml)
0.1
0.156
Staphylococcus aureus (105cells/ml)
0.025
0.3125
Escherichia coli (105cells/ml)
0.1
0.625
, 百拇医药
Pseudomonas pyocyanea (105cells/ml)
0.05
2.5
Shigella dysenteriae (105cells/ml)
0.025
0.625
由表2进一步可知，野菊花水提物及挥发油的最低抑菌浓度。其中对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、福氏志贺菌的抑制作用水提物强于挥发油，而对肺炎链球菌，则挥发油强于水提物。
3.2 抗病毒试验
3.2.1 病毒毒力 病毒毒力实验结果见表3。Tab 3 Determination of virus virulence Virus concentration
, 百拇医药
Ratio of infectional foramen
10-1
4/4
10-2
4/4
10-3
4/4
10-4
2/4
10-5
0/4
, 百拇医药
10-6
0/4
由表3可知，该病毒的TCID50为10-4。
3.2.2 药物对细胞毒性测定 药物对细胞毒性测定结果见表4。Tab 4 Determination of cytotoxicity by drug Drug
concentration
Ratio on foramen of cytotoxicity
Aqueous
extra
Volutile
, http://www.100md.com
oil
Virazole
1∶64
4/4
4/4
4/4
1∶128
4/4
4/4
0/4
1∶256
4/4
4/4
, 百拇医药
1∶512
4/4
4/4
1∶1024
0/4
4/4
1∶2048
4/4
1∶4096
4/4
1∶8192
0/4
由表4可知，野菊花水提物TCD0=1∶1024, 挥发油TCD0=1∶8192, 病毒唑TCD0=1∶128。
, 百拇医药
3.2.3 药物的抗病毒试验 药物的抗病毒试验结果见表5。Tab 5 Determination of CPE inhibition by drug Drug
Concentration
Ratio of CPE inhibition foramen
Virus
control
Drug
control
Cell
control
Aqueous
, 百拇医药
extract
Volutile
oil
Virazole
1
3/3
3/3
3/3
+
-
-
1∶2
3/3
, http://www.100md.com
3/3
3/3
+
-
-
1∶4
3/3
0/3
3/3
+
-
-
1∶8
0/3
, 百拇医药
0/3
3/3
+
-
-
1∶16
0/3
0/3
3/3
+
-
-
1∶32
0/3
, 百拇医药
0/3
0/3
+
-
-
由表5可知，抑制10TCID50病毒引起的CPE的各组药物浓度为，野菊花水提物1∶4096，挥发油1∶6384，病毒唑1∶2048。4 讨 论
4.1 抑菌作用
由琼脂打洞扩散法和琼脂扩散法抑菌试验结果表明,野菊花水提物与挥发油均具有较强的抗菌作用,但对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌和福氏志贺菌的作用,水提物明显强于挥发油,而对肺炎链球菌的作用则相反。
4.2 抗病毒作用
, http://www.100md.com
由病毒毒力和药物对细胞毒性测定试验结果表明，病毒的TCID50为10-4；药物对细胞的TCD0：野菊花水提物1∶1024，挥发油1∶8192，病毒唑1∶128。在此基础上，药物对CPE抑制测定试验结果又表明,可以抑制10TCID50病毒引起CPE的各药物组的浓度分别为，野菊花水提物1:4096,挥发油1:6384,病毒唑1:2048。由此可见野菊花水提物具较强抗病毒活性。
参考文献
1 江苏新医学院编.中药大辞典.上海:上海人民出版社,1977.2128
2 刘应国.野菊花的药理研究及临床应用概况.时珍国药,1991;2(3)：103
收稿日期：1999-10-06, 百拇医药
单位：任爱农 王志刚 卢振初 王礼文(江苏省中医药研究院，南京210028)；吴亦伦(安徽省医学科学研究所，合肥230061)
关键词：野菊花；抑菌；抗病毒
药物生物技术990412
摘 要 对野菊花水提物与挥发油的抑菌和抗病毒活性实验研究结果表明,二者均具抑菌和抗病毒活性。对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、福氏志贺菌的抑制作用及抗病毒活性,水提物强于挥发油,而对肺炎链球菌,则相反。
Study on Bacteriostasis and Antivirotic
Activity of Flos Chrysanthemum Indici
, http://www.100md.com
Ren Ainong, Wang Zhigang, Lu Zhengchu, Wang Liwen,1Wu Yilun
(Jiangsu province Research fellow of Traditional Chinese Medicament,Nanjing 210028；1Anhui province Research Institute of Medical Scitasis,Antivirotic ences, Hefei 230061)
Abstract Study of bacteriostasis and antivirotic activity by a q ueous extract and volutile oils of Flos Chrysanthumum Indici. It is conclude d th at the aqueous extract is stronger than the volutile oils for Staphylococcus aur eus, Escherichia coli, Pseudomonas pyocyanea, Shigella dysenteriae and antivirot ic activity. But it is inverse for Streptococcus pneumoniae.
, 百拇医药
Key Words Flos Chrysanthemum Indici, Bacteriostasis, Antivi rotic activity
中药材野菊花临床上功用主治为:清热解毒,主治痈肿、疔疮、目赤、痢疾、湿疹、温热头痛等[1]，其水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有抑制作用[2]，但挥发油的抑菌试验及抗病毒试验未见报道。我们分别对野菊花的挥发性成分和水提物同时进行了抑菌和抗病毒实验研究,为临床用药提供依据。
1 材 料
1.1 原药材鉴定
野菊花采集于南京老山,经南京中医药大学刘训红副教授鉴定为野菊Chysanthemum indicum L.的头状花序。
1.2 细菌
, http://www.100md.com
肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌及福氏志贺菌由江苏省中医院检验科提供。
1.3 病毒、细胞
流行性感冒病毒A3/汉防/359/95(H3N2),狗肾传代细胞(MDCK)引自国家流感中心。
1.4 药 品
病毒唑注射液,由上海禾丰制药有限公司(0.1g/ml)生产。
2 方 法
2.1 野菊花水提物和挥发油的制备
取阴干的头状花序,用水蒸气馏法提取挥发油,经硫酸钠脱水,得蓝绿色挥发油(每ml挥发油含生药材300g)。再取其去油后的野菊花加水煎煮,滤取煎煮液,浓缩至适当浓度，真空干燥，得水提物干膏(每克干膏含生药5g)。临用前挥发油和干膏加水配制成所需浓度。
, 百拇医药
2.2 抑菌试验
2.2.1 琼脂打洞扩散法 将肺炎链球菌(1010个/ml),大肠埃希菌(105个/ml),福氏志贺菌(105个/ml),绿脓假单胞菌(105个/ml)和金黄色葡萄球菌(105个/ml),分别涂布于厚约6mm的药皿平板上,然后在其中打成直径约6mm的孔若干,加满野菊花水提物(1.16g干膏/ml)和野菊花挥发油,37℃培养24h,观察抑菌圈大小。
2.2.2 琼脂扩散法 在血平板上加入野菊花水提物及挥发油,取水提物干膏加水溶解,使水提物(以干膏重量克计)浓度分别为0.2g/ml,0.1g/ml,0.05g/ml,0.025g/ml,0.0125g/ml。再取挥发油加水稀释，加适量乳化剂，用剪切乳化机高速搅拌得到均匀的乳化液，其浓度(以含油量ml计)分别为5%,2.5%,1.25%,0.625%,0.325%,0.156%。然后在血平板上点种肺炎链球菌(1010/ml),大肠埃希菌(105个/ml),福氏志贺菌(105个/ml),绿脓假单胞菌(105个/ml)和金黄色葡萄球菌(105个/ml)。37℃培养24h分别观察野菊花水提物和挥发油的抑制生长的最低药物浓度MIC。
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2.3 抗病毒试验
2.3.1 病毒毒力测定 MDCK细胞96孔板,用无血清培养液洗两次,加入病毒10倍系例稀释液,每稀释度接种4孔、35℃、5%CO2中吸附2h后弃去病毒液,换入维持液(不含牛血清、含2μg/ml胰酶)继续培养3d,观察细胞病变情况(CPE),测定该病毒半数感染量(TCID50)。
2.3.2 药物对细胞毒性测定 MDCK细胞96孔板,加入2倍系列稀释药液(水提物0.4g/ml,挥发油)各7个浓度,每稀释度4孔,35℃,5%CO2培养3d,观察CPE,找出药物最大无毒浓度(TCD0)。
2.3.3 抗病毒实验 MDCK细胞96孔培养板,加入10TCID50病毒液(病毒液作10-3稀释),35℃,5%CO2吸附2h,弃去病毒液,加入最大无毒浓度药液2倍系列稀释液各6个浓度,每一稀释度3孔,培养3d,观察CPE,测定药物对CPE的抑制。同时设病毒对照(不加药液),细胞对照(不加病毒),药物对照(细胞不加病毒,加以不同浓度药液)。
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3 结 果
3.1 抑菌试验
3.1.1 琼脂打洞扩散法 琼脂打洞扩散法抑菌试验结果见表1。
Tab 1 Bacteriostatic result by agar punch diffusion Bacteria
Diameter of bacteriostatic circle
Aqueous extract(mm)
VolutiLe oil(mm)
Streptococcus pneumoniae(1010cells/ml)
, 百拇医药
8
14
Staphylococcus aureus (105cells/ml)
12
15
Escherichia coli (105cells/ml)
8
13
Pseudomonas pyocyanea (105cells/ml)
9
, 百拇医药 10
Shigella dysenteriae (105cells/ml)
10
13
由表1可知，野菊花水提物及挥发油均形成一定直径的抑菌圈 ，显示有较强的抑菌作用。
3.1.2 琼脂扩散法 琼脂扩散法抑菌试验结果见表2。Tab 2 Bacteriostatic result by agar diffusion Bacteria
Minimum inhibitory concentration
Aqueous extract(%)
, 百拇医药
VolutiLe oil(%)
Streptococcus pneumoniae(1010cells/ml)
0.1
0.156
Staphylococcus aureus (105cells/ml)
0.025
0.3125
Escherichia coli (105cells/ml)
0.1
0.625
, 百拇医药
Pseudomonas pyocyanea (105cells/ml)
0.05
2.5
Shigella dysenteriae (105cells/ml)
0.025
0.625
由表2进一步可知，野菊花水提物及挥发油的最低抑菌浓度。其中对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、福氏志贺菌的抑制作用水提物强于挥发油，而对肺炎链球菌，则挥发油强于水提物。
3.2 抗病毒试验
3.2.1 病毒毒力 病毒毒力实验结果见表3。Tab 3 Determination of virus virulence Virus concentration
, 百拇医药
Ratio of infectional foramen
10-1
4/4
10-2
4/4
10-3
4/4
10-4
2/4
10-5
0/4
, 百拇医药
10-6
0/4
由表3可知，该病毒的TCID50为10-4。
3.2.2 药物对细胞毒性测定 药物对细胞毒性测定结果见表4。Tab 4 Determination of cytotoxicity by drug Drug
concentration
Ratio on foramen of cytotoxicity
Aqueous
extra
Volutile
, http://www.100md.com
oil
Virazole
1∶64
4/4
4/4
4/4
1∶128
4/4
4/4
0/4
1∶256
4/4
4/4
, 百拇医药
1∶512
4/4
4/4
1∶1024
0/4
4/4
1∶2048
4/4
1∶4096
4/4
1∶8192
0/4
由表4可知，野菊花水提物TCD0=1∶1024, 挥发油TCD0=1∶8192, 病毒唑TCD0=1∶128。
, 百拇医药
3.2.3 药物的抗病毒试验 药物的抗病毒试验结果见表5。Tab 5 Determination of CPE inhibition by drug Drug
Concentration
Ratio of CPE inhibition foramen
Virus
control
Drug
control
Cell
control
Aqueous
, 百拇医药
extract
Volutile
oil
Virazole
1
3/3
3/3
3/3
+
-
-
1∶2
3/3
, http://www.100md.com
3/3
3/3
+
-
-
1∶4
3/3
0/3
3/3
+
-
-
1∶8
0/3
, 百拇医药
0/3
3/3
+
-
-
1∶16
0/3
0/3
3/3
+
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1∶32
0/3
, 百拇医药
0/3
0/3
+
-
-
由表5可知，抑制10TCID50病毒引起的CPE的各组药物浓度为，野菊花水提物1∶4096，挥发油1∶6384，病毒唑1∶2048。4 讨 论
4.1 抑菌作用
由琼脂打洞扩散法和琼脂扩散法抑菌试验结果表明,野菊花水提物与挥发油均具有较强的抗菌作用,但对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌和福氏志贺菌的作用,水提物明显强于挥发油,而对肺炎链球菌的作用则相反。
4.2 抗病毒作用
, http://www.100md.com
由病毒毒力和药物对细胞毒性测定试验结果表明，病毒的TCID50为10-4；药物对细胞的TCD0：野菊花水提物1∶1024，挥发油1∶8192，病毒唑1∶128。在此基础上，药物对CPE抑制测定试验结果又表明,可以抑制10TCID50病毒引起CPE的各药物组的浓度分别为，野菊花水提物1:4096,挥发油1:6384,病毒唑1:2048。由此可见野菊花水提物具较强抗病毒活性。
参考文献
1 江苏新医学院编.中药大辞典.上海:上海人民出版社,1977.2128
2 刘应国.野菊花的药理研究及临床应用概况.时珍国药,1991;2(3)：103
收稿日期：1999-10-06, 百拇医药