Candida lypolytica脂肪酶催化布洛芬酯对映选择性水解
作者：夏仕文 俞耀庭 徐诗伟
单位：夏仕文(第三军医大学医学检验系，重庆400038)；俞耀庭(南开大学分子生物学研究所，天津300071)；徐诗伟(中国科学院微生物研究所，北京100080)
关键词：脂肪酶；布洛芬；对映选择性水解；S-布洛芬
药物生物技术990411 摘 要 以国产Candida lypolytica lipase脂肪酶(CLL)为手性催化剂催化布洛芬酯对映选择性水解。研究底物修饰、pH、温度和有机辅溶剂对拆分转化率和对映选择性的影响。CLL催化布洛芬乙酯水解的优势产物为S-布洛芬。在最优反应条件下，转化率30.2%，对映体过量为83.8%。
Enantioselective Hydrolysis of Ibuprofen
Esters Catalyzed by Candida lypolytica Lipase(CLL)
, 百拇医药
Xia Shiwen, Yu Yaoting1, Xu Shiwei2
(Faculty of Medical Laboratory Sciences, Third Military Medical University, Chongqing 400038； 1Institute of Molecular Biology, Nankai Universit y , Tianjin
300071； 2Institute of Microbiology, Chinese Academy of Scienc es, Beijing 100080)
Abstract Candida lypolytica lipase(CLL) was used as a chiral resoluti ng catalyst for the enantioselective Hydrolysis of ibuprofen esters. The effect s of substr ate modification, pH, temperature and cosolvents on the conversion and enantiome ric excess (ee) were studied. The product of Candida lypolytica lipase-cat al yzed hydrolysis of ibuprofen ethyl ester was S-ibuprofen. Under the optimal re action conditions, the conversion and enantiomeric excess (ee) were 30.2% and 8 3.8% respectively.
, 百拇医药
Key Words Candida lypolytica lipase, Ibuprofen, Enantiosele ctive hydrolysis, S-ibuprofen
布洛芬(ibuprofen)是一种重要的α-芳基丙酸类非甾体抗炎药物，临床上主要用于解热镇痛、消炎和治疗风湿病等。药理研究证实S-布洛芬在体内抑制前列腺素合成的活性是R-对映体的160倍[1]。在人体内，R-对映体与辅酶A形成的酯能够替代甘油三酯中的天然脂肪酸形成杂化甘油三酯，干扰正常的脂代谢和膜功能，因而R-布洛芬具有毒副作用[2]。单一的S-对映体比外消旋体的疗效更好、毒副作用更小，已于1997年在瑞士获得认可[3]。
除了化学不对称合成和拆分外，以酶或微生物细胞为手性催化剂的生物拆分也是制备S-布洛芬的一条有效途径[4]。本文以国产的Candida lypolytica lipase脂肪酶(CLL)为催化剂催化布洛芬酯不对称水解，研究底物修饰和反应条件对拆分转化率和对映选择性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
CLL购于无锡酶制剂厂，外消旋布洛芬及其甲酯、乙酯、氯乙酯和异丙酯由山东新华制药厂提供。其余试剂均为分析纯。
1.2 实验仪器
日立365型紫外-可见分光光度计，法国Gilson高效液相色谱仪，恒温摇床。
1.3 水解反应
50ml三角瓶中加入0.5gCLL,0.5g外消旋布洛芬酯和20ml磷酸盐缓冲液(50mmol/L,pH7.0),40℃,200r/min摇床反应5h。
1.4 分析方法
转化率的测定采用碱处理-紫外分光光度法[5]。对映体过量按文献[6]方法测定。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 底物修饰对拆分的影响
测定CLL水解布洛芬甲酯、乙酯、异丙酯和氯乙酯的转化率和对映体过量，研究底物修饰对拆分的影响。见表1。所有底物水解的优势产物均为S-布洛芬。底物分子中的醇单元对转化率和对映体过量具有显著影响。氯乙酯为底物时由于吸电子基的引入使酶催化反应更易进行，具有最高的转化率，而异丙酯为底物时由于空阻的存在妨碍了酶与底物的结合，转化率最低。甲酯和氯乙酯为底物时对映选择性较低，乙酯和异丙酯为底物时表现出相似的对映选择性。醇单元链长和转化率以及对映体过量不存在相关性。
Tab 1 Effect of substrate modification on the
conversion and ena ntiomeric excess(ee) Ibuprofen ester
, 百拇医药
Conversion
(%)
S-ibuprofen
ee(%)
Methyl
23.1
38.8
Ethyl
30.2
83.8
Isopropyl
18.6
, 百拇医药 79.8
Chloroethyl
38.5
29.2
All reactions were carried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen este rs in 20ml phosphate buffer (50mmol/L, pH7.0) at 40℃
2.2 pH对拆分的影响
CLL催化布洛芬乙酯水解的最适pH为7。pH对转化率和对映体过量的影响具有相同的趋势。在酸性条件下，转化率和对映体过量随pH增大而增大。在碱性条件下，对映选择性降低可能是化学水解的直接结果。见图1。
, 百拇医药
Fig 1 Effect of pH on the conversion (■) and ee
(▲) of CLL-cataly zed hydrolysis of racemic ibuprofen ethyl ester
All reactions were carried out u sing 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen esters in 20ml 50mmol/L phosphate buffer at 40℃ except pH.
2.3 温度对拆分的影响
图2的结果表明，CLL水解布洛芬乙酯的转化率和对映体过量对温度的变化非常敏感，最适温度为40℃。低于40℃，转化率和对映体过量与温度正相关。高于40℃，转化率和对映体过量因酶的热失活而降低。
, http://www.100md.com
Fig2 Effect of temperature on the conversion (■) and ee
(▲) of CL L-catalyzed hydrolysis of racemic ibuprofen ethyl ester
All reactions were caaried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic
ibuprofen esters in 20ml phosphate buffer(50mmol/L,pH7.0) except temperature.
2.4 有机辅溶剂对拆分的影响
CLL在磷酸盐缓冲液中催化布洛芬水解为三相反应体系，底物在缓冲液中的溶解度很小。为了增大溶解度，我们在反应体系中加入10%(V/V)的有机辅溶剂，考察有机辅溶剂对拆分的影响。表2的结果表明，有机辅溶剂的加入在提高转化率的同时也降低对映选择性。辅溶剂的介电常数和疏水性参数与对映体过量没有相关性。
, 百拇医药
Tab 2 Effect of cosolvents on the conversion and enantiomeric excess(ee) Cosolvent
Conversion
(%)
S-ibuprofen
ee(%)
Control
30.2
83.8
Pyridine
35.6
17.5
, http://www.100md.com
THF
32.5
25.0
DMF
32.5
77.6
DMSO
41.3
46.6
All reactions were carried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen ethy l esters in 20ml phosphate buffer (50mmol/L, pH7.0) added 10%(V/V) cosolven ts at 40℃.3 讨 论
, 百拇医药
(1)CLL是一种粗酶制剂，蛋白含量约为1.5%，除了脂肪酶外还含有细胞碎片、核酸、色素以及其它水解酶。这些杂质尤其是具有较低或相反对映选择性的水解酶的存在可能影响CLL催化布洛芬酯水解的对映选择性。通过分离纯化制备均一的CLL并用于布洛芬乙酯的不对称水解，有可能进一步提高对映选择性。
(2)根据Phillips[7]有关温度对酶催化反应对映选择性影响的理论，温度越低，对映选择性越高。而我们的结果与此相反，说明在低于40℃时，CLL催化布洛芬乙酯水解不是由活化焓差而是由活化熵差控制的。
参考文献
1 Adams S S, Bresloff P, Mason G C. Pharmacological difference between the optical isomers of Ibuprofen: evidence for metabolic inversion of the (-) isomer. J Pharm Pharmacol, 1976，28∶256
, http://www.100md.com
2 Williams K, Day R, Knihinicki R, et al. The stereoselective uptake of Ibupro fen enantiomers into adipose tissue. Biochem Pharmacol,1986，35∶20
3 胡圣榆.右旋布洛芬在瑞士上市.国外药讯，1997，(8)∶20
4 徐诗伟，徐清.2-芳基丙酸类药物的拆分研究进展.微生物学通报，1995，22(2)：95
5 徐诗伟，徐清，曹桂芳.微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究Ⅱ.反应条件和产物提取.微生物学报，1995，35(4)∶275
6 徐诗伟，徐清，曹桂芳.手性高效液相色谱法测定S(+)-布洛芬对映体过量.微生物学通报，1993，20(6)∶371
7 Phillips R S. Temperature modulation of the stereochemistry of enzymatic cat alysis: prospects for exploitation.TIBTECH,1996，14∶13
收稿日期：1999-11-11, 百拇医药
单位：夏仕文(第三军医大学医学检验系，重庆400038)；俞耀庭(南开大学分子生物学研究所，天津300071)；徐诗伟(中国科学院微生物研究所，北京100080)
关键词：脂肪酶；布洛芬；对映选择性水解；S-布洛芬
药物生物技术990411 摘 要 以国产Candida lypolytica lipase脂肪酶(CLL)为手性催化剂催化布洛芬酯对映选择性水解。研究底物修饰、pH、温度和有机辅溶剂对拆分转化率和对映选择性的影响。CLL催化布洛芬乙酯水解的优势产物为S-布洛芬。在最优反应条件下，转化率30.2%，对映体过量为83.8%。
Enantioselective Hydrolysis of Ibuprofen
Esters Catalyzed by Candida lypolytica Lipase(CLL)
, 百拇医药
Xia Shiwen, Yu Yaoting1, Xu Shiwei2
(Faculty of Medical Laboratory Sciences, Third Military Medical University, Chongqing 400038； 1Institute of Molecular Biology, Nankai Universit y , Tianjin
300071； 2Institute of Microbiology, Chinese Academy of Scienc es, Beijing 100080)
Abstract Candida lypolytica lipase(CLL) was used as a chiral resoluti ng catalyst for the enantioselective Hydrolysis of ibuprofen esters. The effect s of substr ate modification, pH, temperature and cosolvents on the conversion and enantiome ric excess (ee) were studied. The product of Candida lypolytica lipase-cat al yzed hydrolysis of ibuprofen ethyl ester was S-ibuprofen. Under the optimal re action conditions, the conversion and enantiomeric excess (ee) were 30.2% and 8 3.8% respectively.
, 百拇医药
Key Words Candida lypolytica lipase, Ibuprofen, Enantiosele ctive hydrolysis, S-ibuprofen
布洛芬(ibuprofen)是一种重要的α-芳基丙酸类非甾体抗炎药物，临床上主要用于解热镇痛、消炎和治疗风湿病等。药理研究证实S-布洛芬在体内抑制前列腺素合成的活性是R-对映体的160倍[1]。在人体内，R-对映体与辅酶A形成的酯能够替代甘油三酯中的天然脂肪酸形成杂化甘油三酯，干扰正常的脂代谢和膜功能，因而R-布洛芬具有毒副作用[2]。单一的S-对映体比外消旋体的疗效更好、毒副作用更小，已于1997年在瑞士获得认可[3]。
除了化学不对称合成和拆分外，以酶或微生物细胞为手性催化剂的生物拆分也是制备S-布洛芬的一条有效途径[4]。本文以国产的Candida lypolytica lipase脂肪酶(CLL)为催化剂催化布洛芬酯不对称水解，研究底物修饰和反应条件对拆分转化率和对映选择性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
CLL购于无锡酶制剂厂，外消旋布洛芬及其甲酯、乙酯、氯乙酯和异丙酯由山东新华制药厂提供。其余试剂均为分析纯。
1.2 实验仪器
日立365型紫外-可见分光光度计，法国Gilson高效液相色谱仪，恒温摇床。
1.3 水解反应
50ml三角瓶中加入0.5gCLL,0.5g外消旋布洛芬酯和20ml磷酸盐缓冲液(50mmol/L,pH7.0),40℃,200r/min摇床反应5h。
1.4 分析方法
转化率的测定采用碱处理-紫外分光光度法[5]。对映体过量按文献[6]方法测定。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 底物修饰对拆分的影响
测定CLL水解布洛芬甲酯、乙酯、异丙酯和氯乙酯的转化率和对映体过量，研究底物修饰对拆分的影响。见表1。所有底物水解的优势产物均为S-布洛芬。底物分子中的醇单元对转化率和对映体过量具有显著影响。氯乙酯为底物时由于吸电子基的引入使酶催化反应更易进行，具有最高的转化率，而异丙酯为底物时由于空阻的存在妨碍了酶与底物的结合，转化率最低。甲酯和氯乙酯为底物时对映选择性较低，乙酯和异丙酯为底物时表现出相似的对映选择性。醇单元链长和转化率以及对映体过量不存在相关性。
Tab 1 Effect of substrate modification on the
conversion and ena ntiomeric excess(ee) Ibuprofen ester
, 百拇医药
Conversion
(%)
S-ibuprofen
ee(%)
Methyl
23.1
38.8
Ethyl
30.2
83.8
Isopropyl
18.6
, 百拇医药 79.8
Chloroethyl
38.5
29.2
All reactions were carried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen este rs in 20ml phosphate buffer (50mmol/L, pH7.0) at 40℃
2.2 pH对拆分的影响
CLL催化布洛芬乙酯水解的最适pH为7。pH对转化率和对映体过量的影响具有相同的趋势。在酸性条件下，转化率和对映体过量随pH增大而增大。在碱性条件下，对映选择性降低可能是化学水解的直接结果。见图1。
, 百拇医药
Fig 1 Effect of pH on the conversion (■) and ee
(▲) of CLL-cataly zed hydrolysis of racemic ibuprofen ethyl ester
All reactions were carried out u sing 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen esters in 20ml 50mmol/L phosphate buffer at 40℃ except pH.
2.3 温度对拆分的影响
图2的结果表明，CLL水解布洛芬乙酯的转化率和对映体过量对温度的变化非常敏感，最适温度为40℃。低于40℃，转化率和对映体过量与温度正相关。高于40℃，转化率和对映体过量因酶的热失活而降低。
, http://www.100md.com
Fig2 Effect of temperature on the conversion (■) and ee
(▲) of CL L-catalyzed hydrolysis of racemic ibuprofen ethyl ester
All reactions were caaried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic
ibuprofen esters in 20ml phosphate buffer(50mmol/L,pH7.0) except temperature.
2.4 有机辅溶剂对拆分的影响
CLL在磷酸盐缓冲液中催化布洛芬水解为三相反应体系，底物在缓冲液中的溶解度很小。为了增大溶解度，我们在反应体系中加入10%(V/V)的有机辅溶剂，考察有机辅溶剂对拆分的影响。表2的结果表明，有机辅溶剂的加入在提高转化率的同时也降低对映选择性。辅溶剂的介电常数和疏水性参数与对映体过量没有相关性。
, 百拇医药
Tab 2 Effect of cosolvents on the conversion and enantiomeric excess(ee) Cosolvent
Conversion
(%)
S-ibuprofen
ee(%)
Control
30.2
83.8
Pyridine
35.6
17.5
, http://www.100md.com
THF
32.5
25.0
DMF
32.5
77.6
DMSO
41.3
46.6
All reactions were carried out using 0.5g CLL, 0.5g racemic ibuprofen ethy l esters in 20ml phosphate buffer (50mmol/L, pH7.0) added 10%(V/V) cosolven ts at 40℃.3 讨 论
, 百拇医药
(1)CLL是一种粗酶制剂，蛋白含量约为1.5%，除了脂肪酶外还含有细胞碎片、核酸、色素以及其它水解酶。这些杂质尤其是具有较低或相反对映选择性的水解酶的存在可能影响CLL催化布洛芬酯水解的对映选择性。通过分离纯化制备均一的CLL并用于布洛芬乙酯的不对称水解，有可能进一步提高对映选择性。
(2)根据Phillips[7]有关温度对酶催化反应对映选择性影响的理论，温度越低，对映选择性越高。而我们的结果与此相反，说明在低于40℃时，CLL催化布洛芬乙酯水解不是由活化焓差而是由活化熵差控制的。
参考文献
1 Adams S S, Bresloff P, Mason G C. Pharmacological difference between the optical isomers of Ibuprofen: evidence for metabolic inversion of the (-) isomer. J Pharm Pharmacol, 1976，28∶256
, http://www.100md.com
2 Williams K, Day R, Knihinicki R, et al. The stereoselective uptake of Ibupro fen enantiomers into adipose tissue. Biochem Pharmacol,1986，35∶20
3 胡圣榆.右旋布洛芬在瑞士上市.国外药讯，1997，(8)∶20
4 徐诗伟，徐清.2-芳基丙酸类药物的拆分研究进展.微生物学通报，1995，22(2)：95
5 徐诗伟，徐清，曹桂芳.微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究Ⅱ.反应条件和产物提取.微生物学报，1995，35(4)∶275
6 徐诗伟，徐清，曹桂芳.手性高效液相色谱法测定S(+)-布洛芬对映体过量.微生物学通报，1993，20(6)∶371
7 Phillips R S. Temperature modulation of the stereochemistry of enzymatic cat alysis: prospects for exploitation.TIBTECH,1996，14∶13
收稿日期：1999-11-11, 百拇医药