卡介苗素抗哮喘有效成分的分离及其药理作用研究
作者：刘 煜 盛海林 吴梧桐 吴文俊
单位：刘煜 吴梧桐 吴文俊(中国药科大学生物制药学院，南京210009)；盛海林(中国药科大学数学教研室，南京210009)
关键词：卡介苗素，卡介菌多糖，分离纯化，药理活性
摘 要 卡介苗素具有平喘作用
摘 要 卡介苗素具有平喘作用，主要含多糖和核酸两种组分，为明确其有效成分，将卡介苗素经核酸酶酶解，去除其中的核酸组成后，经Sephadex G-100柱层析分离纯化，得到一种白色粉末状多糖——卡介菌多糖(BCG-PSA)。该多糖经聚丙烯酰胺凝胶电泳，Sephadex G-200柱层析证实为均一成分。对BCG-PSA的化学组成分析表明，该多糖的分子量为1.705×105，不含硫酸基和糖醛酸。经纸层析、薄层层析及气相层析确证，其单糖组成仅为D-葡萄糖，属均一多糖类。对BCG-PSA的药理研究表明，该多糖具有明显的免疫调节功能和平喘作用，且毒性很小，是卡介苗素抗哮喘的有效成分。
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Isolation and Purification of Antiasthma Composition
from BCG-PSN and Study on Its Pharmacological Properties
Liu Yu, Sheng Hailin1, Wu Wutong, Wu Wenjun
(Biopharmaceutics College, China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ；1Department of mathematics, China Pharmaceutical University , Nanji ng 210009)
Abstract The purification of BCG-polysaccharide-nucleic aci d (BCG-PSN) was described in this paper. Nucleic acid and protein composition was removed with nuclease an d trichloroacetic acid-butanol respectively. A white powder was got by Sephadex G -100 column chromatography. This white powder was BCG-polysaccharide (BCG-PS A). Examined with polyacrylamide gelelectrophoresis and Sephadex G-200 column chroma tography, the BCG-PSA was homogeneous. The analysis in BCG-PSA's chemical com position showed that its molecular weight was 1.705×105. Its monosaccharide compos ition was D-glucose only confirmed by paper chromatography, TLC and gas chromat ography.
, 百拇医药
Key Words BCG-PSN, BCG-PSA, Separation, Pharmacological activity
卡介苗素即卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)，是由卡介菌中分离提取得到的一种生物活性物质，主要含多糖和核酸两种组分，其中多糖占75%以上。作为一种免疫调节剂其注射剂早在1985年已被列入《生物制品试行规程》，但其进一步的纯化研究工作国内外尚未报道。
多糖类药物如研究较多的香菇多糖[1，2]，褚苓多糖[3]，银耳多糖等在免疫调节，抗凝，降血脂，抗肿瘤，抗辐射等方面都具有显著的药理活性，而对一些细菌多糖的研究还较少。卡介苗素是一种免疫调节物质，能提高T细胞的免疫功能并通过激活T细胞，促进白细胞介素(IL-1,2)等的生成以及产生多种免疫调节的淋巴因子，并能增强巨噬细胞的功能，提高机体免疫细胞杀伤细菌、病毒等病原体的能力及提高溶菌酶活力，发挥重要的抗感染作用，在临床上用于防治感冒、哮喘、慢支等，有效率达96.49%。本文研究了卡介苗素的分离纯化及其多糖组分的药理活性，旨在从卡介苗素中分离出一种均一的抗哮喘有效成分。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
1.1 试剂
卡介苗素(BCG-PSA)由长沙九芝堂提供(商品名“斯奇康”)；核糖核酸酶为中国科学院上海生物化学研究所产品；脱氧核糖核酸酶为包头市生物化学制药厂产品；SephadexG-100,SephadexG-200为进口分装；基础液，氧化液，还原液，阿利新蓝染色液：(以上四种溶液按文献[5]配制)；蓝色葡聚糖，标准分子量的Dextran为进口分装；
1.2 仪器
恒温水浴；721分光光度计；BS423型稳流稳压电泳仪；循环水泵；日本岛津(Shimadzu)GC-9A气相层析仪，记录仪为岛津(Shimadzu)C-R3A。
1.3 动物
, 百拇医药 昆明种小鼠、豚鼠由中国药科大学动物房提供
2 实验方法
2.1 卡介菌多糖半纯品的提取分离
取卡介苗素1g，以蒸馏水溶解定容至200ml，加Dnase、Rnase各5mg，于35.5℃保温20h，加入氯仿和正丁醇，振摇10min去蛋白，流水透析48h，80℃浓缩，加入预冷的95%乙醇，搅拌均匀，置4℃冰箱过夜，真空干燥得淡黄色粉末0.765g，即为半纯品。
2.2 卡介菌多糖的纯化
SephadexG-100层析柱(1.5×40cm)预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取上述半纯品50mg，溶于2ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心除去不溶物，上柱，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，分部收集，每管收集5ml，流速0.5ml/min。用蒽酮试剂比色法测定各管多糖含量[4]，一直洗到多糖呈阴性反应。合并含糖部分，透析除盐，浓缩，乙醇沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得卡介菌多糖组分(BCG-PSA)。
, 百拇医药
2.3 卡介菌多糖的纯度检查
2.3.1 凝胶柱层析 SephadexG-200层析柱(1.5×40cm)，预先以0.02mol/LNaCl溶液平衡。取经SephadexG-100纯化所得多糖样品40mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心取上清，如前法收集多糖组分，绘制洗脱曲线。
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 胶浓为6%，缓冲液为0.025MpH9.0的硼砂液。样品为2mg/ml，每管进样20ul，电压110伏，每管电流量约2mA，电泳4小时，按文献[5]方法以阿利新蓝染色。
2.4 卡介菌多糖的Mr测定
SephadexG-200层析柱(1.5×40cm)，预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取卡介菌多糖样品15mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，加入柱顶，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，按1ml/管分部收集，以蒽酮法测各管含糖量，以测定样品的洗脱高峰体积。同时用五种已知Mr的Dextran标准品(Mr分别为10，000、40，000、70，000、100，000、500，000)，用兰色葡聚糖(Mr=2，000，000)测外水体积。
, 百拇医药
2.5 卡介菌多糖的基团分析
2.5.1 硫酸基的鉴定[6] 取卡介菌多糖5mg，溶于1ml6mol/LHCl中，封管水解12h，滴加氯化钡试剂，观察有无沉淀产生。
2.5.2 糖醛酸分析 取卡介菌多糖溶液1ml(5mg/ml)，按Bitter[7]的方法测定糖醛酸含量。
2.6 组成单糖的鉴定
2.6.1 纸层析 用慢速层析滤纸15×12cm2，层析点间距2.0cm，与相应的标准单糖样品作对照(D-葡萄糖、D-木糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖)，用乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水(12∶3∶3∶2)为展开剂，室温展开15cm左右，晾干后用苯胺-邻苯二甲酸显色[8]。
2.6.2 薄层层析 以硅胶GF254按常规方法铺板(15×20cm2)，105℃活化30min备用，层析点间距为1.5cm，同样以上述各标准单糖样品作对照，展开剂、显色剂同纸层析。
, 百拇医药
2.6.3 气相层析 按文献[9]方法，将多糖水解物和标准单糖制成还原乙酰化衍生物，进行气相层析。填充柱为5%OV-225/AW-DMCS-ChromosorbW80-100目，1.0×0.3mmid,柱温210℃，载气N240ml/min，氢火焰检测器，测定各样品的滞留时间。
2.7 卡介菌多糖的药理作用研究
2.7.1 平喘试验 取经测定引喘潜伏期合格[10]的幼年豚鼠(体重≤200g)24只，雌雄各半，随机分成4组，连续口服给药10d，于d10给药后1h，按文献[10]方法测豚鼠的引喘潜伏期，用t值法对结果进行统计学处理。
2.7.2 溶血素测定 取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献[11]的方法测定半数溶血值HC50。
, 百拇医药
2.7.3 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应(DTH) 取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献[12]的方法致敏、攻击，测鼠耳肿胀度、脾指数和胸腺指数，观察各组差异。
3 实验结果
3.1 卡介菌多糖的纯化
SephadexG-100柱层析洗脱曲线见图1。将卡介菌多糖组分经紫外扫描(400～200nm)，260nm、280nm处均无特征吸收，表明核酸、蛋白组分已基本去除，结果见图2。
(1)BCG-ΡSA (2)Nucleic acid component
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Fig 1 Separation of BCA-PSA on Sephadex G-100 column
Fig 2 Separation of BCA-PSA on Sephadex G-200 column
3.2 卡介菌多糖的纯度检查
3.2.1 凝胶柱层析 Sephadex G-200柱层析洗脱结果见图2，为一左右对称的单峰，表明该多糖为单一组分。
3.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 卡介菌多糖呈单一区带。
3.3 卡介菌多糖的Mr测定结果
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外水体积V0=18ml；五种已知Mr的Dextran标准品的洗脱高峰体积Ve分别为44ml，33ml,28ml,25ml,9ml,样品的洗脱高峰体积Ve为21ml。线性回归得回归方程为：Y=118.99-18.73X(r=0.9993)
由方程得样品的平均Mr为1.705×105。
3.4 卡介菌多糖的基团分析
3.4.1 硫酸基的鉴定 无白色沉淀产生，表明不含硫酸基。
3.4.2 糖醛酸分析 按该法测定不含糖醛酸，属中性多糖。
3.5 组成单糖的鉴定
3.5.1 纸层析和薄层层析 由两层析图谱可见，样品呈一个点，其Rf值与葡萄糖标准品及L-阿拉伯糖标准品的相近。
, 百拇医药
3.5.2 气相层析 样品水解物的还原乙酰化衍生物仅出一个峰，滞留时间为12.07min，葡萄糖标准品的滞留时间为12.63min，L-阿拉伯糖的滞留时间为4.35min。因此，卡介菌多糖的单糖组成仅为D-葡萄糖。气相图谱见图3。
(1)D-glucose and L-arabinase
a. D-glucose b. L-arabinase
(2) BCG-PSA
Fig 3 The gas chromatography of BCG-PSA
3.6 卡介菌多糖的药理作用研究
, 百拇医药
3.6.1 平喘试验结果 平喘试验结果见表1。
Tab 1 The effect of BCG-PSA on prolonging asthmatic latency period
Group
Dose
(mg/kg)
Animal
Number
Latency period
(min)
Control
, 百拇医药 /
6
0.964±0.166
BCG-PSN
50(i.g)
6
4.583±2.200***
BCG-PSA
50(i.g)
6
4.855±1.876***
BCG-PSN
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injection
25(i.p)
6
4.986±1.327***
*** P<0.01 (vs control group)
由表1可见：卡介菌多糖能显著地延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，有明显的平喘作用。
3.6.2 溶血素测定结果 溶血素测定结果见表2。
Tab 2 The effect of BCG-PSA on raising serum haemolysin
Group
, 百拇医药
Does
(mg/kg)
HC50
(x±s)
Control
/
153.77±9.77
BCG-PSN
50(i.g)
179.56±21.17***
BCG-PSA
50(i.g)
, 百拇医药
186.47±15.91***
BCG-PSN injection
25(i.p)
203.04±21.56***
***P<0.01 (vs control group)
由表2可见：卡介菌多糖能有效地提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，能增强小鼠的特异性体液免疫功能。
3.6.3 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果见表3。
Tab 3 The effect of BCG-PSA on mice's delayed allergy induced by DNFB
, 百拇医药
Group
Dose
(mg/kg)
Swelling level
(mg)
Spleen index
(mg/kg)
Thymus index
(mg/kg)
Control
/
5.61±2.37
, 百拇医药
59.25±16.51
23.76±7.74
BCG-PSN
50(i.g)
2.69±1.10***
59.68±16.54
20.74±4.49
BCG-PSA
50(i.g)
2.81±0.88***
58.22±17.23
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28.75±7.50
Antigen control
25(i.p)
-0.1±1.2***
56.80±10.30
30.60±2.70
*** P<0.01(vs control group )
由表3可见：卡介菌多糖能显著降低小鼠右耳的肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿。
4 结论与讨论
经对实验条件诸如温度、时间等的数学优化处理后的纯化条件，精制纯化得一白色粉末状物质，对硫酸-蒽酮试剂呈阳性反应，260nm、280nm紫外扫描无特征吸收，SephadexG-200呈单一洗脱峰，表明该样品为均一的多糖组分，其中的核酸组分已基本去除。对该多糖组分的化学研究结果表明，该多糖组分为均一组分，Mr约170000，其单糖组成仅为D-葡萄糖一种，属均多糖类。对其药理研究结果表明，该多糖具有免疫调节功能，能明显提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能；能显著降低二硝基氟苯所致小鼠右耳肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿，能有效提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，增强小鼠特异性体液免疫功能。该多糖能显著延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，具有明显的平喘作用。据文献报道，由黄芪、褚苓中提取出的多糖组分中也有仅含葡萄糖组分的，其作用机理还有待于进一步研究探讨。
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参考文献
1 沙静妹，毛洪奎.香菇菌多糖.中国药学杂志，1989，24(2)：116
2 汪友永.抗乙肝新药——猪苓多糖注射液.中国医院药学杂志，1992，12(10)：477
3 杨模坤.中草药的高分子活性成分.药学通报，1981，16(11)：29
4 徐秀兰主编.生物化学实验与指导.北京：中国医药科技出版社，1994，231
5 吴梧桐，余品华，夏尔宁，等.银耳孢子多糖TF-A、TF-B、TF-C的分离、纯化及组成单糖的鉴定.生物化学与生物物理学报，1984，16(4)：393
6 樊绘曾.刺参酸性粘多糖的分离及其理化性质.药学学报，1980，15(5)：263
, 百拇医药
7 BitterT.A modified uronic acid carbazole reaction. Anal B iochem， 1962;4:330
8 柴田村治主编.纸色谱法及其应用.北京：科学出版社，1978，108
9 吴梧桐，陈琼华，徐碧如.银耳孢子多糖的分离和分析.真菌学报，1982，1(2)：119
10 中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，80
11 中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，132
12 中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，135
收稿日期：1999-03-16, 百拇医药
单位：刘煜 吴梧桐 吴文俊(中国药科大学生物制药学院，南京210009)；盛海林(中国药科大学数学教研室，南京210009)
关键词：卡介苗素，卡介菌多糖，分离纯化，药理活性
摘 要 卡介苗素具有平喘作用
摘 要 卡介苗素具有平喘作用，主要含多糖和核酸两种组分，为明确其有效成分，将卡介苗素经核酸酶酶解，去除其中的核酸组成后，经Sephadex G-100柱层析分离纯化，得到一种白色粉末状多糖——卡介菌多糖(BCG-PSA)。该多糖经聚丙烯酰胺凝胶电泳，Sephadex G-200柱层析证实为均一成分。对BCG-PSA的化学组成分析表明，该多糖的分子量为1.705×105，不含硫酸基和糖醛酸。经纸层析、薄层层析及气相层析确证，其单糖组成仅为D-葡萄糖，属均一多糖类。对BCG-PSA的药理研究表明，该多糖具有明显的免疫调节功能和平喘作用，且毒性很小，是卡介苗素抗哮喘的有效成分。
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Isolation and Purification of Antiasthma Composition
from BCG-PSN and Study on Its Pharmacological Properties
Liu Yu, Sheng Hailin1, Wu Wutong, Wu Wenjun
(Biopharmaceutics College, China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ；1Department of mathematics, China Pharmaceutical University , Nanji ng 210009)
Abstract The purification of BCG-polysaccharide-nucleic aci d (BCG-PSN) was described in this paper. Nucleic acid and protein composition was removed with nuclease an d trichloroacetic acid-butanol respectively. A white powder was got by Sephadex G -100 column chromatography. This white powder was BCG-polysaccharide (BCG-PS A). Examined with polyacrylamide gelelectrophoresis and Sephadex G-200 column chroma tography, the BCG-PSA was homogeneous. The analysis in BCG-PSA's chemical com position showed that its molecular weight was 1.705×105. Its monosaccharide compos ition was D-glucose only confirmed by paper chromatography, TLC and gas chromat ography.
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Key Words BCG-PSN, BCG-PSA, Separation, Pharmacological activity
卡介苗素即卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)，是由卡介菌中分离提取得到的一种生物活性物质，主要含多糖和核酸两种组分，其中多糖占75%以上。作为一种免疫调节剂其注射剂早在1985年已被列入《生物制品试行规程》，但其进一步的纯化研究工作国内外尚未报道。
多糖类药物如研究较多的香菇多糖[1，2]，褚苓多糖[3]，银耳多糖等在免疫调节，抗凝，降血脂，抗肿瘤，抗辐射等方面都具有显著的药理活性，而对一些细菌多糖的研究还较少。卡介苗素是一种免疫调节物质，能提高T细胞的免疫功能并通过激活T细胞，促进白细胞介素(IL-1,2)等的生成以及产生多种免疫调节的淋巴因子，并能增强巨噬细胞的功能，提高机体免疫细胞杀伤细菌、病毒等病原体的能力及提高溶菌酶活力，发挥重要的抗感染作用，在临床上用于防治感冒、哮喘、慢支等，有效率达96.49%。本文研究了卡介苗素的分离纯化及其多糖组分的药理活性，旨在从卡介苗素中分离出一种均一的抗哮喘有效成分。
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1 仪器与试剂
1.1 试剂
卡介苗素(BCG-PSA)由长沙九芝堂提供(商品名“斯奇康”)；核糖核酸酶为中国科学院上海生物化学研究所产品；脱氧核糖核酸酶为包头市生物化学制药厂产品；SephadexG-100,SephadexG-200为进口分装；基础液，氧化液，还原液，阿利新蓝染色液：(以上四种溶液按文献[5]配制)；蓝色葡聚糖，标准分子量的Dextran为进口分装；
1.2 仪器
恒温水浴；721分光光度计；BS423型稳流稳压电泳仪；循环水泵；日本岛津(Shimadzu)GC-9A气相层析仪，记录仪为岛津(Shimadzu)C-R3A。
1.3 动物
, 百拇医药 昆明种小鼠、豚鼠由中国药科大学动物房提供
2 实验方法
2.1 卡介菌多糖半纯品的提取分离
取卡介苗素1g，以蒸馏水溶解定容至200ml，加Dnase、Rnase各5mg，于35.5℃保温20h，加入氯仿和正丁醇，振摇10min去蛋白，流水透析48h，80℃浓缩，加入预冷的95%乙醇，搅拌均匀，置4℃冰箱过夜，真空干燥得淡黄色粉末0.765g，即为半纯品。
2.2 卡介菌多糖的纯化
SephadexG-100层析柱(1.5×40cm)预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取上述半纯品50mg，溶于2ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心除去不溶物，上柱，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，分部收集，每管收集5ml，流速0.5ml/min。用蒽酮试剂比色法测定各管多糖含量[4]，一直洗到多糖呈阴性反应。合并含糖部分，透析除盐，浓缩，乙醇沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得卡介菌多糖组分(BCG-PSA)。
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2.3 卡介菌多糖的纯度检查
2.3.1 凝胶柱层析 SephadexG-200层析柱(1.5×40cm)，预先以0.02mol/LNaCl溶液平衡。取经SephadexG-100纯化所得多糖样品40mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心取上清，如前法收集多糖组分，绘制洗脱曲线。
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 胶浓为6%，缓冲液为0.025MpH9.0的硼砂液。样品为2mg/ml，每管进样20ul，电压110伏，每管电流量约2mA，电泳4小时，按文献[5]方法以阿利新蓝染色。
2.4 卡介菌多糖的Mr测定
SephadexG-200层析柱(1.5×40cm)，预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取卡介菌多糖样品15mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，加入柱顶，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，按1ml/管分部收集，以蒽酮法测各管含糖量，以测定样品的洗脱高峰体积。同时用五种已知Mr的Dextran标准品(Mr分别为10，000、40，000、70，000、100，000、500，000)，用兰色葡聚糖(Mr=2，000，000)测外水体积。
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2.5 卡介菌多糖的基团分析
2.5.1 硫酸基的鉴定[6] 取卡介菌多糖5mg，溶于1ml6mol/LHCl中，封管水解12h，滴加氯化钡试剂，观察有无沉淀产生。
2.5.2 糖醛酸分析 取卡介菌多糖溶液1ml(5mg/ml)，按Bitter[7]的方法测定糖醛酸含量。
2.6 组成单糖的鉴定
2.6.1 纸层析 用慢速层析滤纸15×12cm2，层析点间距2.0cm，与相应的标准单糖样品作对照(D-葡萄糖、D-木糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖)，用乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水(12∶3∶3∶2)为展开剂，室温展开15cm左右，晾干后用苯胺-邻苯二甲酸显色[8]。
2.6.2 薄层层析 以硅胶GF254按常规方法铺板(15×20cm2)，105℃活化30min备用，层析点间距为1.5cm，同样以上述各标准单糖样品作对照，展开剂、显色剂同纸层析。
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2.6.3 气相层析 按文献[9]方法，将多糖水解物和标准单糖制成还原乙酰化衍生物，进行气相层析。填充柱为5%OV-225/AW-DMCS-ChromosorbW80-100目，1.0×0.3mmid,柱温210℃，载气N240ml/min，氢火焰检测器，测定各样品的滞留时间。
2.7 卡介菌多糖的药理作用研究
2.7.1 平喘试验 取经测定引喘潜伏期合格[10]的幼年豚鼠(体重≤200g)24只，雌雄各半，随机分成4组，连续口服给药10d，于d10给药后1h，按文献[10]方法测豚鼠的引喘潜伏期，用t值法对结果进行统计学处理。
2.7.2 溶血素测定 取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献[11]的方法测定半数溶血值HC50。
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2.7.3 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应(DTH) 取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献[12]的方法致敏、攻击，测鼠耳肿胀度、脾指数和胸腺指数，观察各组差异。
3 实验结果
3.1 卡介菌多糖的纯化
SephadexG-100柱层析洗脱曲线见图1。将卡介菌多糖组分经紫外扫描(400～200nm)，260nm、280nm处均无特征吸收，表明核酸、蛋白组分已基本去除，结果见图2。
(1)BCG-ΡSA (2)Nucleic acid component
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Fig 1 Separation of BCA-PSA on Sephadex G-100 column
Fig 2 Separation of BCA-PSA on Sephadex G-200 column
3.2 卡介菌多糖的纯度检查
3.2.1 凝胶柱层析 Sephadex G-200柱层析洗脱结果见图2，为一左右对称的单峰，表明该多糖为单一组分。
3.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 卡介菌多糖呈单一区带。
3.3 卡介菌多糖的Mr测定结果
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外水体积V0=18ml；五种已知Mr的Dextran标准品的洗脱高峰体积Ve分别为44ml，33ml,28ml,25ml,9ml,样品的洗脱高峰体积Ve为21ml。线性回归得回归方程为：Y=118.99-18.73X(r=0.9993)
由方程得样品的平均Mr为1.705×105。
3.4 卡介菌多糖的基团分析
3.4.1 硫酸基的鉴定 无白色沉淀产生，表明不含硫酸基。
3.4.2 糖醛酸分析 按该法测定不含糖醛酸，属中性多糖。
3.5 组成单糖的鉴定
3.5.1 纸层析和薄层层析 由两层析图谱可见，样品呈一个点，其Rf值与葡萄糖标准品及L-阿拉伯糖标准品的相近。
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3.5.2 气相层析 样品水解物的还原乙酰化衍生物仅出一个峰，滞留时间为12.07min，葡萄糖标准品的滞留时间为12.63min，L-阿拉伯糖的滞留时间为4.35min。因此，卡介菌多糖的单糖组成仅为D-葡萄糖。气相图谱见图3。
(1)D-glucose and L-arabinase
a. D-glucose b. L-arabinase
(2) BCG-PSA
Fig 3 The gas chromatography of BCG-PSA
3.6 卡介菌多糖的药理作用研究
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3.6.1 平喘试验结果 平喘试验结果见表1。
Tab 1 The effect of BCG-PSA on prolonging asthmatic latency period
Group
Dose
(mg/kg)
Animal
Number
Latency period
(min)
Control
, 百拇医药 /
6
0.964±0.166
BCG-PSN
50(i.g)
6
4.583±2.200***
BCG-PSA
50(i.g)
6
4.855±1.876***
BCG-PSN
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injection
25(i.p)
6
4.986±1.327***
*** P<0.01 (vs control group)
由表1可见：卡介菌多糖能显著地延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，有明显的平喘作用。
3.6.2 溶血素测定结果 溶血素测定结果见表2。
Tab 2 The effect of BCG-PSA on raising serum haemolysin
Group
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Does
(mg/kg)
HC50
(x±s)
Control
/
153.77±9.77
BCG-PSN
50(i.g)
179.56±21.17***
BCG-PSA
50(i.g)
, 百拇医药
186.47±15.91***
BCG-PSN injection
25(i.p)
203.04±21.56***
***P<0.01 (vs control group)
由表2可见：卡介菌多糖能有效地提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，能增强小鼠的特异性体液免疫功能。
3.6.3 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应结果见表3。
Tab 3 The effect of BCG-PSA on mice's delayed allergy induced by DNFB
, 百拇医药
Group
Dose
(mg/kg)
Swelling level
(mg)
Spleen index
(mg/kg)
Thymus index
(mg/kg)
Control
/
5.61±2.37
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59.25±16.51
23.76±7.74
BCG-PSN
50(i.g)
2.69±1.10***
59.68±16.54
20.74±4.49
BCG-PSA
50(i.g)
2.81±0.88***
58.22±17.23
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28.75±7.50
Antigen control
25(i.p)
-0.1±1.2***
56.80±10.30
30.60±2.70
*** P<0.01(vs control group )
由表3可见：卡介菌多糖能显著降低小鼠右耳的肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿。
4 结论与讨论
经对实验条件诸如温度、时间等的数学优化处理后的纯化条件，精制纯化得一白色粉末状物质，对硫酸-蒽酮试剂呈阳性反应，260nm、280nm紫外扫描无特征吸收，SephadexG-200呈单一洗脱峰，表明该样品为均一的多糖组分，其中的核酸组分已基本去除。对该多糖组分的化学研究结果表明，该多糖组分为均一组分，Mr约170000，其单糖组成仅为D-葡萄糖一种，属均多糖类。对其药理研究结果表明，该多糖具有免疫调节功能，能明显提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能；能显著降低二硝基氟苯所致小鼠右耳肿胀度，减轻迟发型变态反应所致水肿，能有效提高免疫小鼠血清中溶血素的含量，增强小鼠特异性体液免疫功能。该多糖能显著延长乙酰胆碱所致豚鼠支气管痉挛的潜伏期，具有明显的平喘作用。据文献报道，由黄芪、褚苓中提取出的多糖组分中也有仅含葡萄糖组分的，其作用机理还有待于进一步研究探讨。
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参考文献
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12 中国卫生部药政司，新药临床前研究指导原则汇编，1993，135
收稿日期：1999-03-16, 百拇医药