洛法他汀产生菌的激光诱变育种研究
作者：赵炎生 邓建慧 宋丽雅 胡瑜君 张春珍 王会珍 戴明伟 王红怡
单位：赵炎生(中国药科大学 南京210009)；邓建慧 宋丽雅 胡瑜君 张春珍 王会珍 戴明伟 王红怡(华北制药集团新药研究开发中心 石家庄050015)
关键词：洛法他汀；激光；诱变
摘 要 使用氦氖激光
摘 要 使用氦氖激光、Nd∶YAG倍频脉冲激光和铜蒸气激光，以不同剂量对洛法他汀产生菌L-1-109进行诱变照射，同时对激光修复作用进行探讨。结果表明，被照菌株产洛法能力有不同程度提高。氦氖激光照射最高提高23.2%，Nd∶YAG倍频脉冲激光照射最高提高20.8%。铜蒸气激光照射提高6.3%。将菌株紫外线辐射后再以低剂量氦氖激光照射，获得一株高产优质新菌种L-2-101，产洛法能力提高30%以上，遗传性能稳定。
, http://www.100md.com
Study of Laser-Induced Strain Selection
on Lovastation Producing Strains
Zhao Yansheng 1Deng Jianhui 1Song Liya 1Hu Yujun
1Zhang Chunzhen 1Wang Huizhen 1Dai Mingwe 1Wang Hongyi
(China Pharmaceutical University, Nanjing 210009；1North China Pharmaceutical Coperation Group New Drug Reserch and Development Center, Shijiazhuang 050015)
, 百拇医药
Abstract In this paper, the effect that Lovastatin-producig st rains L-1-109 were irradiated with copper vapor laser, He-Ne laser and frequency-doublin g Nd∶YAG pulse laser for diff erent radiation dosages were studied, at the same time discussed the He-Ne l aser reparation affect. The experimental result indicated that the yield of Lova statin produced by L-1-109 that was irradiated with He-Ne laser for 15 minute s increased 23.2%, with frequency-doubling Nd∶YAG pulse laser irradiated for 6 0 times increased 20.8%, with copper vapor laser irrdiated increased 6.3%. A hig h yield strain L-2-101 which were irradiated with UV and low dosages He-Ne la ser was obtained, its ability of producing Lovastatin is higher 30% than its par ent strain, and this ability can be steadily inherited.
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Key Words Lovastatin, Laser, Mutation
洛法他汀是1987年在美国上市的降血脂药物。它是由土曲霉发酵产物分离出来的一种还原酶抑制剂。洛法他汀与烟酸和降胆固醇树脂联合应用目前被认为是最理想的降血脂的三药治疗方案。为了提高土曲霉发酵产量，我们使用了不同的激光照射和紫外线与激光复合处理方法对洛法他汀产生菌进行诱变，取得了较好的效果。尤其是经紫外线辐照与激光修复复合诱变后，获得一株高产优良菌株，其性能稳定，即将用于生产。
1 材料与方法
1.1 出发菌株
土曲霉(Aspergillus Terreus) L-1-109
1.2 培养基
斜面、分离、母瓶及发酵培养基主要成分：葡萄糖、淀粉，玉米浆，黄豆饼粉(以上均为华北制药厂自产)，蛋白胨(武汉)，NaNO3，KCl,CaCO3，甘油(以上均为分析纯试剂)，酵母粉(华美公司)。
, 百拇医药
1.3 培养条件
培养温度培养时间斜面26-28℃5-8d平板菌落26-28℃5-8d母瓶26-28℃1-2d发酵26-28℃8-10d
1.4 激光处理方法
1.4.1 单孢子悬液的制备 将培养好的L-1-109斜面孢子用无菌水洗下，制成浓度为107个/ml的单孢子悬液。
1.4.2 单纯的激光照射 铜蒸气激光：照射时间为2min，4min，8min，照射剂量分别为2.9j/cm2,5.8j/cm2,11.6j/cm2。λ1=578.2nm,λ2=510.6nm。
氦氖激光：照射时间为10min，15min，20min，照射剂量分别为17.8mj/cm2,26.7mj/cm2,35.6mj/cm2。λ=632.8nm。
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Nd∶YAG脉冲倍频激光：60次，90次，120次，照射剂量分别为22.3j/cm2,33.5j/cm2,44.6j/cm2。λ=532nm。脉冲宽度15ns，照射频率1次/s。
上述激光器均为中国药科大学激光室自行设计研制。
1.4.3 紫外光与激光的复合处理 先以紫外光照射单孢子悬液，照射距离为32cm，照射时间为120秒，将经照射后的单孢子悬液以氦氖激光照射，照射时间为3min，5min，7min。照射剂量分别为5.3mj/cm2,8.9mj/cm2,12.4mj/cm2。
1.5 突变株筛选
1.5.1 摇瓶初筛 经激光照射的样品以无菌水稀释后，涂布于分离培养基上。单菌落分离后传代于斜面培养基上再培养，培养好后接种于摇瓶进行摇瓶试验。摇床转速为220r/min。以HPLC测定培养物的摇瓶效价单位。
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1.5.2 复筛 挑选一定量的初筛最佳菌种，接种摇瓶进行复筛，复筛条件及摇瓶效价测定方法与初筛相同。
2 结 果
2.1 激光诱变效应
2.1.1 铜蒸气激光诱变效果 铜蒸气激光照射2min,4min,8min死亡率为零，照射2min、4min正变率为30%，其诱变效果不太明显，效价提高6.3%。
2.1.2 氦氖激光的诱变效果 氦氖激光的诱变效果见表1。
Tab 1 Mutation effect of He-Ne laser
Irradiation
time
, http://www.100md.com
(min)
Positive
mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Mortality
(%)
Improvement
(%)
10
, 百拇医药 70
30
0
9.9
15
100
0
0
23.2
20
70
30
14.6
15.6
, http://www.100md.com
试验证明，随着照射剂量的加大，死亡率增加。氦氖激光对洛法他汀产生菌有一定的诱变效果，照射时间15min正变率达到100%。
2.1.3 Nd∶YAG倍频脉冲激光的诱变效果
Nd∶YAG倍频脉冲激光的诱变效果见表2。试验证明，脉冲激光对洛法他汀产生菌有一定的诱变效果，随着脉冲次数的减少，正变率逐渐加大，脉冲次数为60次时正变率为100%。Tab 2 Mutation effect of Nd∶YAG Frequency-doubling pulse laser
Radiation
dosage
(times)
Positive
, http://www.100md.com
mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Mort ality
(%)
Improvement
(%)
60
100
0
10.2
, 百拇医药
20.8
90
90
10
0
15.3
120
44
50
6.6
15.7
2.1.4 紫外光与氦氖激光的复合处理 将该菌种经紫外光诱变后，用较低剂量的氦氖激光进行照射修复。结果见表3。Tab 3 Mutation effect of UV and laser complex radiation
, 百拇医药
Radiation
dosage
(min)
Positive
mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Repara tion
rate
(%)
, 百拇医药
Improvement
(%)
3
26
74
50.4
13.6
5
53
47
264
16.1
7
, 百拇医药
58
42
75.2
31.2
UV
47
47
0
36.4
试验证明，随着氦氖激光照射时间的增加，正变率随之增大，与对照单一紫外处理组相比较，经氦氖激光照射5min及7min正变率有增加趋势；从激光的修复作用来看，氦氖激光照射5min的修复作用最好，达到264%；单一紫外处理菌种的初筛效价增量最高，但经复筛后其高产特性未能稳定遗传。修复率为：(He-Ne照射后孢子存活数-紫外光照射后孢子存活数)÷紫外光照射后的孢子存活数×100%。
, 百拇医药
2.2 突变株的筛选
2.2.1 不同激光处理及复合处理的菌种突变株筛选 挑取单菌170株进行摇瓶初筛，摇瓶初筛后选出不同激光照射后筛选出的5株高产菌种进行3次摇瓶复筛，得到一株高产菌种L-2-101，结果见表4。Tab 4 The flask shaking fermentation results of high yield strains
Laser
Strain
Pre-screening
Improvement
(%)
Re-trial 1
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Improvement
(%)
Re-trial 2
Improvement
(%)
Re-trial 3
Improvement
(%)
Cu vapor
L-2-28
6.3
0
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25.7
10.5
He-Ne
L-2-58
14.5
9.1
9.2
12.2
YAG Pulse
L-2-63
20.4
5.2
0
, 百拇医药
10.0
UV+He-Ne
L-2-101
13.6
27.4
36.7
36.0
UV
L-2-152
36.4
6.7
16.7
0
, 百拇医药
Note: The data of Tab 4 is produced by comparing with the yield of o riginal strain.
由表4结果可以看出铜激光及Nd∶YAG倍频脉冲激光对该菌种有一定的诱变效应，但复筛显示不稳定性较明显，而且效价增加幅度不大；由氦氖激光选出的菌种虽较稳定，但其诱变效果不太明显；经紫外诱变的菌种，初筛效价增加幅度较大，可是高产特性得不到稳定遗传；紫外诱变后经氦氖激光修复得到的L-2-101，初筛效价增幅不很大，经传代后复筛，高产特性得以稳定表达，且均保持良好特性。除此之外，该菌种的特性有一定的变化，具体表现为菌落变小，发酵液颜色略浅，由此认为，L-2-101有较好的品质，可以进一步考查。
2.2.2 稳定性考查 为考查新菌种L-2-101的传代稳定性，对其进行传代试验，经四次传代后与初筛结果比较见图1：
, 百拇医药
Fig1. The steady character of mutant L-2-101 strain
图1结果显示，该菌株的传代稳定性较好，传至第四代稍有下降，总体上说，该菌种的特性比较优良。
3 讨 论
激光是一种物理诱变剂，选择合适的波长和功率照射对微生物有不同的诱变效果。在农业上，万贤国等人[1]利用激光及其与γ射线复合处理水稻干种子，认为可以提高诱变效果。在微生物方面，赵炎生等对赤霉素产生菌进行多种激光处理[2]及化学诱变后用激光修复[3]显著提高了赤霉素产生菌的效价。紫外线是一种优良的物理诱变剂，可引起生物体染色体畸变还可以导致DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，使DNA复制出现差错，从而诱发突变[4，5]，但在本实验中使用的菌种经过多次反复的物理、化学诱变剂处理，可能出现了饱和效应，因此菌种虽有正突变，但不能保持遗传稳定。单一激光对洛法他汀产生菌造成的变异较小。对紫外照射后的菌种经氦氖激光修复，孢子死亡率减少，其修复率最高达264%，诱变效果显著，获得了稳定的高产菌种。分析其原因，我们认为：菌种被紫外线照射后，造成DNA损伤，其生物学活性主要表现为胸腺嘧啶二聚体的形成，阻碍碱基的正常配对。从混沌理论和量子生物学观点认为[6]，遗传物质DNA碱基基态与第一激发态之间能量差在2eV左右，如胸腺嘧啶(T)为2.05eV，腺嘌呤(A)1.80eV，鸟嘌呤(G)为1.16eV，胞嘧啶(C)为2.00eV。He-Ne激光的光子能量为2eV，当其作用于DNA后，可以直接激发碱基或通过弛豫过程激发碱基，碱基对之间氢键质子能量改变，隧道效应提高，促使碱基错配进而通过掺入错误和复制错误导致了碱基置换突变，引起基因突变。被紫外线照射后濒于死亡的菌种通过了错误修复，提高了存活率，同时提高了突变株出现频率，为筛选优良菌种提供更大的机会，修复率与存活率相关，是否与正突变株有关，还须进一步研究。
, http://www.100md.com
低剂量He-Ne激光用于菌种选育，对紫外诱变后的突变株进行修复是一种较好的方法。本文只是对激光的诱变作用和修复作用作了探索，有很多问题仍需进一步研究。
江苏省科委基础研究资助项目(J91162)
参考文献
1万贤国，庞伯良，朱效等.激光及其γ射线复合处理水稻干种子提高诱变效果的研究.激光生物学报，1993，2(1)：196
2 赵炎生，钱海伦，肖灿鹏，等.赤霉素产生菌的激光诱变育种研究.激光生物学报，1997，4(6)：1198
3 赵炎生，肖灿鹏，苏保亮，等.赤霉素产生菌的激光、化学复合诱变育种研究.激光生物学报，1997，4(6)：1202
4 施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学.福州：福建科学技术出版社，1991
5 沈萍.微生物遗传学.武汉：武汉大学出版社，1995
6 邵耀椿，封福如，薛林，等.He-Ne激光引起DNA突变的量子模式.激光生物学，1992,1(3):104
收稿日期：1998-10-16, 百拇医药
单位：赵炎生(中国药科大学 南京210009)；邓建慧 宋丽雅 胡瑜君 张春珍 王会珍 戴明伟 王红怡(华北制药集团新药研究开发中心 石家庄050015)
关键词：洛法他汀；激光；诱变
摘 要 使用氦氖激光
摘 要 使用氦氖激光、Nd∶YAG倍频脉冲激光和铜蒸气激光，以不同剂量对洛法他汀产生菌L-1-109进行诱变照射，同时对激光修复作用进行探讨。结果表明，被照菌株产洛法能力有不同程度提高。氦氖激光照射最高提高23.2%，Nd∶YAG倍频脉冲激光照射最高提高20.8%。铜蒸气激光照射提高6.3%。将菌株紫外线辐射后再以低剂量氦氖激光照射，获得一株高产优质新菌种L-2-101，产洛法能力提高30%以上，遗传性能稳定。
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Study of Laser-Induced Strain Selection
on Lovastation Producing Strains
Zhao Yansheng 1Deng Jianhui 1Song Liya 1Hu Yujun
1Zhang Chunzhen 1Wang Huizhen 1Dai Mingwe 1Wang Hongyi
(China Pharmaceutical University, Nanjing 210009；1North China Pharmaceutical Coperation Group New Drug Reserch and Development Center, Shijiazhuang 050015)
, 百拇医药
Abstract In this paper, the effect that Lovastatin-producig st rains L-1-109 were irradiated with copper vapor laser, He-Ne laser and frequency-doublin g Nd∶YAG pulse laser for diff erent radiation dosages were studied, at the same time discussed the He-Ne l aser reparation affect. The experimental result indicated that the yield of Lova statin produced by L-1-109 that was irradiated with He-Ne laser for 15 minute s increased 23.2%, with frequency-doubling Nd∶YAG pulse laser irradiated for 6 0 times increased 20.8%, with copper vapor laser irrdiated increased 6.3%. A hig h yield strain L-2-101 which were irradiated with UV and low dosages He-Ne la ser was obtained, its ability of producing Lovastatin is higher 30% than its par ent strain, and this ability can be steadily inherited.
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Key Words Lovastatin, Laser, Mutation
洛法他汀是1987年在美国上市的降血脂药物。它是由土曲霉发酵产物分离出来的一种还原酶抑制剂。洛法他汀与烟酸和降胆固醇树脂联合应用目前被认为是最理想的降血脂的三药治疗方案。为了提高土曲霉发酵产量，我们使用了不同的激光照射和紫外线与激光复合处理方法对洛法他汀产生菌进行诱变，取得了较好的效果。尤其是经紫外线辐照与激光修复复合诱变后，获得一株高产优良菌株，其性能稳定，即将用于生产。
1 材料与方法
1.1 出发菌株
土曲霉(Aspergillus Terreus) L-1-109
1.2 培养基
斜面、分离、母瓶及发酵培养基主要成分：葡萄糖、淀粉，玉米浆，黄豆饼粉(以上均为华北制药厂自产)，蛋白胨(武汉)，NaNO3，KCl,CaCO3，甘油(以上均为分析纯试剂)，酵母粉(华美公司)。
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1.3 培养条件
培养温度培养时间斜面26-28℃5-8d平板菌落26-28℃5-8d母瓶26-28℃1-2d发酵26-28℃8-10d
1.4 激光处理方法
1.4.1 单孢子悬液的制备 将培养好的L-1-109斜面孢子用无菌水洗下，制成浓度为107个/ml的单孢子悬液。
1.4.2 单纯的激光照射 铜蒸气激光：照射时间为2min，4min，8min，照射剂量分别为2.9j/cm2,5.8j/cm2,11.6j/cm2。λ1=578.2nm,λ2=510.6nm。
氦氖激光：照射时间为10min，15min，20min，照射剂量分别为17.8mj/cm2,26.7mj/cm2,35.6mj/cm2。λ=632.8nm。
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Nd∶YAG脉冲倍频激光：60次，90次，120次，照射剂量分别为22.3j/cm2,33.5j/cm2,44.6j/cm2。λ=532nm。脉冲宽度15ns，照射频率1次/s。
上述激光器均为中国药科大学激光室自行设计研制。
1.4.3 紫外光与激光的复合处理 先以紫外光照射单孢子悬液，照射距离为32cm，照射时间为120秒，将经照射后的单孢子悬液以氦氖激光照射，照射时间为3min，5min，7min。照射剂量分别为5.3mj/cm2,8.9mj/cm2,12.4mj/cm2。
1.5 突变株筛选
1.5.1 摇瓶初筛 经激光照射的样品以无菌水稀释后，涂布于分离培养基上。单菌落分离后传代于斜面培养基上再培养，培养好后接种于摇瓶进行摇瓶试验。摇床转速为220r/min。以HPLC测定培养物的摇瓶效价单位。
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1.5.2 复筛 挑选一定量的初筛最佳菌种，接种摇瓶进行复筛，复筛条件及摇瓶效价测定方法与初筛相同。
2 结 果
2.1 激光诱变效应
2.1.1 铜蒸气激光诱变效果 铜蒸气激光照射2min,4min,8min死亡率为零，照射2min、4min正变率为30%，其诱变效果不太明显，效价提高6.3%。
2.1.2 氦氖激光的诱变效果 氦氖激光的诱变效果见表1。
Tab 1 Mutation effect of He-Ne laser
Irradiation
time
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(min)
Positive
mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Mortality
(%)
Improvement
(%)
10
, 百拇医药 70
30
0
9.9
15
100
0
0
23.2
20
70
30
14.6
15.6
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试验证明，随着照射剂量的加大，死亡率增加。氦氖激光对洛法他汀产生菌有一定的诱变效果，照射时间15min正变率达到100%。
2.1.3 Nd∶YAG倍频脉冲激光的诱变效果
Nd∶YAG倍频脉冲激光的诱变效果见表2。试验证明，脉冲激光对洛法他汀产生菌有一定的诱变效果，随着脉冲次数的减少，正变率逐渐加大，脉冲次数为60次时正变率为100%。Tab 2 Mutation effect of Nd∶YAG Frequency-doubling pulse laser
Radiation
dosage
(times)
Positive
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mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Mort ality
(%)
Improvement
(%)
60
100
0
10.2
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20.8
90
90
10
0
15.3
120
44
50
6.6
15.7
2.1.4 紫外光与氦氖激光的复合处理 将该菌种经紫外光诱变后，用较低剂量的氦氖激光进行照射修复。结果见表3。Tab 3 Mutation effect of UV and laser complex radiation
, 百拇医药
Radiation
dosage
(min)
Positive
mutants
(%)
Negative
mutants
(%)
Repara tion
rate
(%)
, 百拇医药
Improvement
(%)
3
26
74
50.4
13.6
5
53
47
264
16.1
7
, 百拇医药
58
42
75.2
31.2
UV
47
47
0
36.4
试验证明，随着氦氖激光照射时间的增加，正变率随之增大，与对照单一紫外处理组相比较，经氦氖激光照射5min及7min正变率有增加趋势；从激光的修复作用来看，氦氖激光照射5min的修复作用最好，达到264%；单一紫外处理菌种的初筛效价增量最高，但经复筛后其高产特性未能稳定遗传。修复率为：(He-Ne照射后孢子存活数-紫外光照射后孢子存活数)÷紫外光照射后的孢子存活数×100%。
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2.2 突变株的筛选
2.2.1 不同激光处理及复合处理的菌种突变株筛选 挑取单菌170株进行摇瓶初筛，摇瓶初筛后选出不同激光照射后筛选出的5株高产菌种进行3次摇瓶复筛，得到一株高产菌种L-2-101，结果见表4。Tab 4 The flask shaking fermentation results of high yield strains
Laser
Strain
Pre-screening
Improvement
(%)
Re-trial 1
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Improvement
(%)
Re-trial 2
Improvement
(%)
Re-trial 3
Improvement
(%)
Cu vapor
L-2-28
6.3
0
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25.7
10.5
He-Ne
L-2-58
14.5
9.1
9.2
12.2
YAG Pulse
L-2-63
20.4
5.2
0
, 百拇医药
10.0
UV+He-Ne
L-2-101
13.6
27.4
36.7
36.0
UV
L-2-152
36.4
6.7
16.7
0
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Note: The data of Tab 4 is produced by comparing with the yield of o riginal strain.
由表4结果可以看出铜激光及Nd∶YAG倍频脉冲激光对该菌种有一定的诱变效应，但复筛显示不稳定性较明显，而且效价增加幅度不大；由氦氖激光选出的菌种虽较稳定，但其诱变效果不太明显；经紫外诱变的菌种，初筛效价增加幅度较大，可是高产特性得不到稳定遗传；紫外诱变后经氦氖激光修复得到的L-2-101，初筛效价增幅不很大，经传代后复筛，高产特性得以稳定表达，且均保持良好特性。除此之外，该菌种的特性有一定的变化，具体表现为菌落变小，发酵液颜色略浅，由此认为，L-2-101有较好的品质，可以进一步考查。
2.2.2 稳定性考查 为考查新菌种L-2-101的传代稳定性，对其进行传代试验，经四次传代后与初筛结果比较见图1：
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Fig1. The steady character of mutant L-2-101 strain
图1结果显示，该菌株的传代稳定性较好，传至第四代稍有下降，总体上说，该菌种的特性比较优良。
3 讨 论
激光是一种物理诱变剂，选择合适的波长和功率照射对微生物有不同的诱变效果。在农业上，万贤国等人[1]利用激光及其与γ射线复合处理水稻干种子，认为可以提高诱变效果。在微生物方面，赵炎生等对赤霉素产生菌进行多种激光处理[2]及化学诱变后用激光修复[3]显著提高了赤霉素产生菌的效价。紫外线是一种优良的物理诱变剂，可引起生物体染色体畸变还可以导致DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，使DNA复制出现差错，从而诱发突变[4，5]，但在本实验中使用的菌种经过多次反复的物理、化学诱变剂处理，可能出现了饱和效应，因此菌种虽有正突变，但不能保持遗传稳定。单一激光对洛法他汀产生菌造成的变异较小。对紫外照射后的菌种经氦氖激光修复，孢子死亡率减少，其修复率最高达264%，诱变效果显著，获得了稳定的高产菌种。分析其原因，我们认为：菌种被紫外线照射后，造成DNA损伤，其生物学活性主要表现为胸腺嘧啶二聚体的形成，阻碍碱基的正常配对。从混沌理论和量子生物学观点认为[6]，遗传物质DNA碱基基态与第一激发态之间能量差在2eV左右，如胸腺嘧啶(T)为2.05eV，腺嘌呤(A)1.80eV，鸟嘌呤(G)为1.16eV，胞嘧啶(C)为2.00eV。He-Ne激光的光子能量为2eV，当其作用于DNA后，可以直接激发碱基或通过弛豫过程激发碱基，碱基对之间氢键质子能量改变，隧道效应提高，促使碱基错配进而通过掺入错误和复制错误导致了碱基置换突变，引起基因突变。被紫外线照射后濒于死亡的菌种通过了错误修复，提高了存活率，同时提高了突变株出现频率，为筛选优良菌种提供更大的机会，修复率与存活率相关，是否与正突变株有关，还须进一步研究。
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低剂量He-Ne激光用于菌种选育，对紫外诱变后的突变株进行修复是一种较好的方法。本文只是对激光的诱变作用和修复作用作了探索，有很多问题仍需进一步研究。
江苏省科委基础研究资助项目(J91162)
参考文献
1万贤国，庞伯良，朱效等.激光及其γ射线复合处理水稻干种子提高诱变效果的研究.激光生物学报，1993，2(1)：196
2 赵炎生，钱海伦，肖灿鹏，等.赤霉素产生菌的激光诱变育种研究.激光生物学报，1997，4(6)：1198
3 赵炎生，肖灿鹏，苏保亮，等.赤霉素产生菌的激光、化学复合诱变育种研究.激光生物学报，1997，4(6)：1202
4 施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学.福州：福建科学技术出版社，1991
5 沈萍.微生物遗传学.武汉：武汉大学出版社，1995
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收稿日期：1998-10-16, 百拇医药