大肠杆菌海藻糖合成酶基因的克隆和表达
作者：戴秀玉 吴大鹏 周坚
单位：中国科学院微生物研究所， 北京 100080
关键词：otsBA基因；海藻糖；细胞内克隆； 表达
遗传学报000211
摘要： 利用Mu转座子细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶otsBA基因，克隆频率为1.45×10-3/Kanr转导子。经遗传互补、酶切和部分序列分析表明otsBA基因位于克隆质粒。亚克隆2.87kb DNA片段至不同拷贝数表达质粒并分别转化大肠杆菌otsBA基因缺失株，转化株恢复在0.5mol/L NaCl培养基上生长的功能，高渗透压诱导实验表明，转化株能够合成克隆基因产物海 藻糖，但合成量不受克隆质粒拷贝数影响。海藻糖良好的抗高渗能力可能在农作物育种方面发挥重要作用。为构建含有海藻糖合成酶基因的植物表达载体，并在农杆菌的介导下转入植物，赋予其抗高渗、耐干旱能力奠定了重要的研究基础。
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中图分类号： Q933 文献标识码： A
文章编号： 0379-172(2000)02-158-164
Cloning and Expression of Trehalose Synthase Genes in Escherchia coli
DAI Xiu-Yu, WU Da-Peng, ZHOU Jian
(Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)
Abstract: Escherichia coli trehalose synthase otsBA genes have been cloned by using transposon Mu in vivo. The cloning frequency was 1.45×10-3/Kanr transductant. Genetic complements, endonuclase digestion and partial nucleotide sequencing analysis of these clones indicated that otsBA gene was on plasmid Mud5005. Subcloning 2.87kb DNA fragment onto expression plasmids with higher or lower copy number and transforming into E. coli recipient strain FF4050, which have otsBA genes deleted respectively, the transformed strains obtained ability of growth on medium containing 0.5mol/L NaCl and increased trehalose synthesis under high osmotic pressure. Produ- ction and accumulation of trehalose may play an important role in crop breeding.These studies will lay an important foundation for constructing an expression vector with the otsBA genes and transformation to tobacco mediated by Agrobacterium, and obtaining ability for drought resistance and high osmotic pressure tolerance.
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Key words: otsBA gene; trehalose; cloning in vivo; gene expression
环境渗透压的改变与生物尤其是单细胞微生物的生存有着极为密切的关系。单细胞微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)在长期进化过程中形成了一套比较完整的抗渗透压调节机制，即通过体内累积K+、合成甘露醇、甜菜碱、氨基酸、海藻糖等相容性介质，使细胞内外的渗透压达到平衡，以维持正常的代谢活动[1]。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α1→1糖苷键结合的非还原性双糖，研究表明它不仅存在于高渗透压环境微生物中，而且在耐受完全干旱的植物、昆虫、遭受高温、饥饿等不良环境的酵母中均能发现大量海藻糖，海藻糖广泛存在于生物体内，对生 物体有着抗逆保护作用[2]，因而在医药、农业、食品、化妆品及轻化工等领域均有广阔的应用前景[3]。大肠杆菌中海藻糖的合成由otsA基因编码的海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再经0tsB基因编码的海藻糖磷酸酯酶脱磷酸后生成海藻糖[4]。Kaasen等人对43kb大肠杆菌的染色体片段进行了酶切分析后证明otsB和otsA基因包含在2.9kb的片段中，该片段定位于Kohara大肠杆菌染色体图41～42min位置。这两个基因组成一个操纵子[5]，otsBA基因的其他特性有待于进一步研究阐明。
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细胞内克隆是在细胞内通过转座子的作用，将目的基因转移到适当载体的过程[6]，是基因工程中很有用途的重组 技术。本文研究采用细胞内克隆的方法成功地克隆了Escherichia coli的otsBA基因并获得了表达。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 MH125leu-::Mucts, pEG5005质粒的溶源寄主菌，由M.M.Howe教授赠送；FF4050(MC4100Τ[otsA1：：Tn10φ(otsB-acZ)8]),otsA和otsB基因的缺失株，由A.R.Strom教授惠赠；MC4100(F-araD139(argF-lac)u169flb relAl rpsL deoCl ptsF25 rbsR)为otsBA+基因野生型菌株；pEG5005(MuctsA+B+ Kanr rep pMBl Ampr)是带有细胞内克隆系统Mud5005的质粒，10.2kb;pUC18、pACYC184、pGEM7Zf(-)等质粒均为本实验室收藏.
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1.1.2 培养基和抗生素浓度 LB培养基[7]；高渗透压选择培养基为M63基础培养基[8]补加0.5mol/L NaCl，抗生素Amp、Kan、Tet用于完全培养基时， 选择浓度分别为 50μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，用于基础培养基时减半。
1.1.3 试剂 实验用分子生物学试剂购自华美公司，琼脂糖为美国FMC公司产品，海藻糖购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 带有细胞内克隆系统的Mucts溶源菌的构建 将pEG5005经转化引入已经Mucts溶源化的MH125构建成MH125(pEG5005)菌株。
1.2.2 Mu噬菌体液的制备及效价测定 将上述溶源菌的过夜培养物以1100稀释至LB液，30℃培养至对数期，42℃热诱导25min，移至37℃摇床振荡培养至细胞裂解，加氯仿1滴，加MgSO4和CaCl2至终浓度分别为2mmol/L和0.2mmol/L，振荡数秒后离心，上清作效价测定。将噬菌体液作一系列稀释后取0.1ml与0.1ml指示菌混合加入2.5ml R 软琼脂培养基，即刻倾至R底层培养基，37℃培养过夜，计数噬菌斑。
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1.2.3 细胞内克隆 见实验结果。
1.2.4 质粒DNA的提取、纯化、酶切、回收、连接 均按文献[9]进行。
1.2.5 序列分析 采用荧光测序法，利用ABⅠ-73型自动测序仪对目的片段进行测序。
1.2.6 海藻糖提取和检测 将测试菌的过夜培养物转接于50ml M63培养液，37℃培养至对数后期补加NaCl至0.5mol/L，继续培养3h后4℃5000rpm/10min离心收集50ml高渗透压诱导培养细胞，用10ml不含葡萄糖的M63培养液洗涤菌体，离心，重悬于200μl0.6mol/L高氯酸，冰浴30min，10000rpm/10min离心收集上清液，加入KOH溶液中和上清液，去除过氯酸钾沉淀，加入0.1倍体积的2mol/L HCl至上清液，沸水浴15min，加入0.02倍体积的10mol/L NaOH，沸水浴15min，用HCl调pH至7.0，过DEAE朣epharose (pH7.0，磷酸缓冲液)柱收集流出液，用蒽酮-硫酸[10]测定海藻糖含量。用硅胶板薄层层析法(TLC)定性检测海藻糖[11]：样品点在硅胶板上，正丁醇乙酸水＝421层析系统展开后浸入15%硫酸溶液，即刻取出置100℃烤箱加热，显色，观察。
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2 结果
2.1 otsBA基因的分离和酶切图谱分析
2.1.1 otsBA基因细胞内克隆 大肠杆菌细胞内克隆系统由mini-Mn多拷贝质粒复制子和转座子Tn5的Kan抗性基因组成，7.9kb长，亦称Mud5005，Mud5005和Mucts均是Mu噬菌体的温度敏感突变体，30℃时保持溶源状态，42℃诱导时由于阻遏蛋白失活进入裂解期，使转座酶、包装、裂解等一系列后期基因表达。将带有Mud5005的pEG5005多拷贝质粒引入Mucts溶源化的MH125菌株，热诱导 MH125(pEG5005)制备Mu噬菌体裂解液，测定效价达1×108pfu/ml。以MIO 110与受体菌FF4050混合，30℃吸附30min，加1ml新鲜LB液，30℃振荡培养75min以利于克隆基因的表达。离心洗涤该培养物，依次涂布在LB+Kan和M63+Kan+0.5mol/L NaCl平皿，选择Kanr和KanrotsBA+转导子。在以上条件下，计算获得Kanr转导子频率为1.5×10-4噬菌体斑；KanrotsBA+转导子频率为2.2×10-7噬菌斑，因此，otsBA+克隆频率为1.45×10-3/Kanr转导子。
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2.1.2 克隆的筛选和鉴定 (1)琼脂糖凝胶电泳检查：由于Mu的转座具有很高的随机性，设想在拟克隆的基因两侧可能插入方向相同的两个Mu噬菌体，Mud5005和Mucts，以成熟Mu噬菌体为39kb计，Mud5005最多可包入拟克隆基因在内的30kb左右的寄主染色体片段，当用这种结构的噬菌体感染受体细胞时，通过两个Mu之间的同源重 组，形成带有目的基因的转导子。我们将以上获得的转导子平皿纯化后提取DNA，以pEG5005为对照检查其分子量的大小。从图1可看到，所有8个转导子均比对照分子量有所增大，说明它们携带了大小不等的寄主染色体片段。这些转导子被依次命名为pOSM(101～108)系列质粒。(2)遗传互补分析：为了证明otsBA基因被克隆到了pOSM质粒，我们将pOSM101转化至FF4050，分别在LB+Kan和M63+0.5mol/L NaCl平皿上选择转化子。结果发现在LB+Kan获得的转化子都能在M63+0.5mol/L NaCl平皿上生长；检测的100个otsBA+转化子均为Kan抗性。由于FF4050是otsBA缺失株，不可能产生回复突变，因此，在M63+0.5mol/L NaCl平皿上恢复生长功能的转化子是克隆的otsBA基因产物互补的结果，克隆的otsBA基因位于Mud5005质粒上。(3)酶切图谱分析：从图1看出每个pOSM质粒均比对照分子量增 大，但增大程度各不相同，即它们克隆到的染色体片段大小不等。已知otsBA两边有HindⅢ酶切位点，因此不论所克隆的染色体片段有多长，都应得到一定长度的otsBA基因片段，我们对pOSM系列质粒进行酶切分析，图谱如图2所示，以HindⅢ消化的λDNA为标准分子量，pEG5005有2个HindⅢ酶切，产生2个约5.2kb片段。检测的7个pOSM质粒经HindⅢ酶切后产生的DNA片段数量和大小均不相同，但它们都含有1个2.9kb的片段，这与Kaasen等人提出的大肠杆菌otsBA操纵子核苷酸长度相符[5]。
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图1 转导子的琼脂糖凝胶电泳分析
1～4和6～9.clones with chromosomal DNA fragmentsd .5.pEG5005 plasmid as size marker
图2 POSM的酶切图谱分析1～4和6～9HindIII酶切/转导子;5.HindIII/λDNA标准分子量;6..HindIII/PEG5005
2.2 otsBA基因的亚克隆和序列分析
由于Mud5005质粒很不稳定，且pOSM克隆质粒所含外源片段太大，不利于下一步的操作和分析，为此对otsBA基因进行了亚克隆。
2.2.1 pOSM201、pOSM202、pOSM203、pOSM204质粒构建 将带有otsBA基因的pOSM101质粒用 HindⅢ酶切后，分别与经同样酶切的高拷贝质粒pGEM7Zf(-)和低拷贝质粒PACYC184连接构建成pOSM201和pOSM202质粒，并分别转化otsBA缺失株FF4050，获 得FF40450(pOSM201)和FF4050 (pO- SM202)。同样将pOSM101质粒用HindⅢ+SmaⅠ进行双酶切，回收2.02kb片段和0.85kb片段与经HindⅢ+SmaⅠ双酶切的pUC18连接，获得测序质粒pOSM203、pOSM204(构建图略)。
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2.2.2 序列分析 用4种不同的荧光染料标记pOSM203、pOSM204核苷酸，用pUC/M13通用引物经DNA自动测序仪对前者正向测序，对后者反向测序。结果表明正向和反向共测定的785个核苷酸序列与Strom等[12]报道的完全相同(核苷酸序列略)，证实克隆片段是otsBA基因。
2.3 otsBA基因的诱导表达及产物分析
2.3.1 otsBA基因诱导表达 将上述构建的 FF4050(pOSM201)、FF4050(pOSM202)、MC4100和FF4050菌株分别接入M63培养液，37℃振荡培养过夜，以150稀释至50ml新鲜M63培养液，培养至对数后期，补加NaCl至终浓度为0.5mol/L(FF4050除外)，继续培养3h，离心收集细胞，分析测定海藻糖产物。
2.3.2 海藻糖提取和分析 结果见图3。经0.5mol/L NaCl诱导后野生型菌株MC4100能够合成海藻糖，图3中6位置，在与标准海藻糖相同层析高度显现较深的炭化条带，FF4050是otsBA基因缺失株，在任何生长或诱导条件下均不能表达该基因，也没有海藻糖的合成，因此在图中3位置看不到海藻糖炭化痕迹。FF4050(pOSM201)和FF4050(pOSM202)是带有2.9kb otsBA基因质粒转化株，经上述高渗诱导培养后，细胞中合成海藻糖，在薄层层析图谱(图3)4、5位置留下了清晰的糖炭化条带，说明克隆基因获得功能性表达。取同 样样品，用蒽酮-硫酸法定糖.结果如表1所示。
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图3 转化株中克隆基因的表达1.标准葡萄糖;2.标准海藻糖;3.otsBA基因缺失株;4.转化株1'5.转化株2;6.otsBA+野生株
Fig.3Cloning gene expression in transformed strains 1.Clucose ;2.Trehalose;3.FF4050;4.FF4050(posm201);5.FF4050(POSM202);6.MC4100
表1中FF4050是otsBA基因缺失株，在高盐培养基中不能生长，因此所列数据为未经诱导的海藻糖含量，MC4100在未经诱导时也有很低量的海藻糖合成(数据未列)，这可能是因为大肠杆菌细胞处于非高渗透压环境时，海藻糖合成酶基因otsBA的表达呈组成型。转化株诱导后均有海藻糖合成，其水平略低于野生型。pOSM201和pOSM202是带有克隆片段的不同拷贝数质粒，但海藻糖合成量并无明显差别，可见质粒拷贝数的高低对表达量的影响不大。
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表1 高渗诱导后转化株中的海藻糖合成
Table 1 Trehalose synthesis in transformed strains by osmotic induction 菌株
海藻糖含量8)(μg/109细胞)
Strains
Trehaolse amount(μg/109cell)
FF4050
0b)
FF4050(POSM201)
, http://www.100md.com 20.2
FF4050(POSM202)
19.5
MC4100
24.5
3 讨论
抗旱、抗盐碱等抗逆基因的发现及其克隆是植物基因工程研究领域中的重要课题。已经研究了上百种相关的代谢物，包括甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等。将这些渗调物质的合成酶基因转入植物后均能不同程度地提高耐盐性[13～15]。最近发现海藻 糖也是一种很有效的渗调剂，大肠杆菌中海藻糖负责细胞80%的抗高渗功能，由高渗诱导的海藻糖合成途径简单，只涉及两个基因、两步酶促反应，海藻糖合成酶基因被认为是重要和有希望的抗旱、抗盐碱基因而越来越受关注。 我们利用Mu转座子系统细胞内克隆的otsBA基因，与寄主染色体片段DNA序列完全一致，避免了用PCR方法扩增大片段DNA时可能产生的碱基错配，从而保证克隆基因的正确表达，而克隆基因的表达量并不受质粒拷贝数的影响。大肠杆菌合成与外界渗透压相平衡的海藻糖介质，或许可以更有效地利用能量和营养物质，克隆基因的表达同样受大肠杆菌抗渗透压机制的调节。将海藻糖合成酶基因转入植物对提高植物的抗高渗、耐干旱能力有重要意义。otsBA基因的克隆为进一步开展这一目的的研究，提供了可靠的实验依据和材料，有关研究正在进行之中。
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参考文献
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carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol., 1995, 108: 1387～1394., 百拇医药
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关键词：otsBA基因；海藻糖；细胞内克隆； 表达
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摘要： 利用Mu转座子细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶otsBA基因，克隆频率为1.45×10-3/Kanr转导子。经遗传互补、酶切和部分序列分析表明otsBA基因位于克隆质粒。亚克隆2.87kb DNA片段至不同拷贝数表达质粒并分别转化大肠杆菌otsBA基因缺失株，转化株恢复在0.5mol/L NaCl培养基上生长的功能，高渗透压诱导实验表明，转化株能够合成克隆基因产物海 藻糖，但合成量不受克隆质粒拷贝数影响。海藻糖良好的抗高渗能力可能在农作物育种方面发挥重要作用。为构建含有海藻糖合成酶基因的植物表达载体，并在农杆菌的介导下转入植物，赋予其抗高渗、耐干旱能力奠定了重要的研究基础。
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文章编号： 0379-172(2000)02-158-164
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DAI Xiu-Yu, WU Da-Peng, ZHOU Jian
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Abstract: Escherichia coli trehalose synthase otsBA genes have been cloned by using transposon Mu in vivo. The cloning frequency was 1.45×10-3/Kanr transductant. Genetic complements, endonuclase digestion and partial nucleotide sequencing analysis of these clones indicated that otsBA gene was on plasmid Mud5005. Subcloning 2.87kb DNA fragment onto expression plasmids with higher or lower copy number and transforming into E. coli recipient strain FF4050, which have otsBA genes deleted respectively, the transformed strains obtained ability of growth on medium containing 0.5mol/L NaCl and increased trehalose synthesis under high osmotic pressure. Produ- ction and accumulation of trehalose may play an important role in crop breeding.These studies will lay an important foundation for constructing an expression vector with the otsBA genes and transformation to tobacco mediated by Agrobacterium, and obtaining ability for drought resistance and high osmotic pressure tolerance.
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Key words: otsBA gene; trehalose; cloning in vivo; gene expression
环境渗透压的改变与生物尤其是单细胞微生物的生存有着极为密切的关系。单细胞微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)在长期进化过程中形成了一套比较完整的抗渗透压调节机制，即通过体内累积K+、合成甘露醇、甜菜碱、氨基酸、海藻糖等相容性介质，使细胞内外的渗透压达到平衡，以维持正常的代谢活动[1]。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α1→1糖苷键结合的非还原性双糖，研究表明它不仅存在于高渗透压环境微生物中，而且在耐受完全干旱的植物、昆虫、遭受高温、饥饿等不良环境的酵母中均能发现大量海藻糖，海藻糖广泛存在于生物体内，对生 物体有着抗逆保护作用[2]，因而在医药、农业、食品、化妆品及轻化工等领域均有广阔的应用前景[3]。大肠杆菌中海藻糖的合成由otsA基因编码的海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再经0tsB基因编码的海藻糖磷酸酯酶脱磷酸后生成海藻糖[4]。Kaasen等人对43kb大肠杆菌的染色体片段进行了酶切分析后证明otsB和otsA基因包含在2.9kb的片段中，该片段定位于Kohara大肠杆菌染色体图41～42min位置。这两个基因组成一个操纵子[5]，otsBA基因的其他特性有待于进一步研究阐明。
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细胞内克隆是在细胞内通过转座子的作用，将目的基因转移到适当载体的过程[6]，是基因工程中很有用途的重组 技术。本文研究采用细胞内克隆的方法成功地克隆了Escherichia coli的otsBA基因并获得了表达。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 MH125leu-::Mucts, pEG5005质粒的溶源寄主菌，由M.M.Howe教授赠送；FF4050(MC4100Τ[otsA1：：Tn10φ(otsB-acZ)8]),otsA和otsB基因的缺失株，由A.R.Strom教授惠赠；MC4100(F-araD139(argF-lac)u169flb relAl rpsL deoCl ptsF25 rbsR)为otsBA+基因野生型菌株；pEG5005(MuctsA+B+ Kanr rep pMBl Ampr)是带有细胞内克隆系统Mud5005的质粒，10.2kb;pUC18、pACYC184、pGEM7Zf(-)等质粒均为本实验室收藏.
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1.1.2 培养基和抗生素浓度 LB培养基[7]；高渗透压选择培养基为M63基础培养基[8]补加0.5mol/L NaCl，抗生素Amp、Kan、Tet用于完全培养基时， 选择浓度分别为 50μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，用于基础培养基时减半。
1.1.3 试剂 实验用分子生物学试剂购自华美公司，琼脂糖为美国FMC公司产品，海藻糖购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 带有细胞内克隆系统的Mucts溶源菌的构建 将pEG5005经转化引入已经Mucts溶源化的MH125构建成MH125(pEG5005)菌株。
1.2.2 Mu噬菌体液的制备及效价测定 将上述溶源菌的过夜培养物以1100稀释至LB液，30℃培养至对数期，42℃热诱导25min，移至37℃摇床振荡培养至细胞裂解，加氯仿1滴，加MgSO4和CaCl2至终浓度分别为2mmol/L和0.2mmol/L，振荡数秒后离心，上清作效价测定。将噬菌体液作一系列稀释后取0.1ml与0.1ml指示菌混合加入2.5ml R 软琼脂培养基，即刻倾至R底层培养基，37℃培养过夜，计数噬菌斑。
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1.2.3 细胞内克隆 见实验结果。
1.2.4 质粒DNA的提取、纯化、酶切、回收、连接 均按文献[9]进行。
1.2.5 序列分析 采用荧光测序法，利用ABⅠ-73型自动测序仪对目的片段进行测序。
1.2.6 海藻糖提取和检测 将测试菌的过夜培养物转接于50ml M63培养液，37℃培养至对数后期补加NaCl至0.5mol/L，继续培养3h后4℃5000rpm/10min离心收集50ml高渗透压诱导培养细胞，用10ml不含葡萄糖的M63培养液洗涤菌体，离心，重悬于200μl0.6mol/L高氯酸，冰浴30min，10000rpm/10min离心收集上清液，加入KOH溶液中和上清液，去除过氯酸钾沉淀，加入0.1倍体积的2mol/L HCl至上清液，沸水浴15min，加入0.02倍体积的10mol/L NaOH，沸水浴15min，用HCl调pH至7.0，过DEAE朣epharose (pH7.0，磷酸缓冲液)柱收集流出液，用蒽酮-硫酸[10]测定海藻糖含量。用硅胶板薄层层析法(TLC)定性检测海藻糖[11]：样品点在硅胶板上，正丁醇乙酸水＝421层析系统展开后浸入15%硫酸溶液，即刻取出置100℃烤箱加热，显色，观察。
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2 结果
2.1 otsBA基因的分离和酶切图谱分析
2.1.1 otsBA基因细胞内克隆 大肠杆菌细胞内克隆系统由mini-Mn多拷贝质粒复制子和转座子Tn5的Kan抗性基因组成，7.9kb长，亦称Mud5005，Mud5005和Mucts均是Mu噬菌体的温度敏感突变体，30℃时保持溶源状态，42℃诱导时由于阻遏蛋白失活进入裂解期，使转座酶、包装、裂解等一系列后期基因表达。将带有Mud5005的pEG5005多拷贝质粒引入Mucts溶源化的MH125菌株，热诱导 MH125(pEG5005)制备Mu噬菌体裂解液，测定效价达1×108pfu/ml。以MIO 110与受体菌FF4050混合，30℃吸附30min，加1ml新鲜LB液，30℃振荡培养75min以利于克隆基因的表达。离心洗涤该培养物，依次涂布在LB+Kan和M63+Kan+0.5mol/L NaCl平皿，选择Kanr和KanrotsBA+转导子。在以上条件下，计算获得Kanr转导子频率为1.5×10-4噬菌体斑；KanrotsBA+转导子频率为2.2×10-7噬菌斑，因此，otsBA+克隆频率为1.45×10-3/Kanr转导子。
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2.1.2 克隆的筛选和鉴定 (1)琼脂糖凝胶电泳检查：由于Mu的转座具有很高的随机性，设想在拟克隆的基因两侧可能插入方向相同的两个Mu噬菌体，Mud5005和Mucts，以成熟Mu噬菌体为39kb计，Mud5005最多可包入拟克隆基因在内的30kb左右的寄主染色体片段，当用这种结构的噬菌体感染受体细胞时，通过两个Mu之间的同源重 组，形成带有目的基因的转导子。我们将以上获得的转导子平皿纯化后提取DNA，以pEG5005为对照检查其分子量的大小。从图1可看到，所有8个转导子均比对照分子量有所增大，说明它们携带了大小不等的寄主染色体片段。这些转导子被依次命名为pOSM(101～108)系列质粒。(2)遗传互补分析：为了证明otsBA基因被克隆到了pOSM质粒，我们将pOSM101转化至FF4050，分别在LB+Kan和M63+0.5mol/L NaCl平皿上选择转化子。结果发现在LB+Kan获得的转化子都能在M63+0.5mol/L NaCl平皿上生长；检测的100个otsBA+转化子均为Kan抗性。由于FF4050是otsBA缺失株，不可能产生回复突变，因此，在M63+0.5mol/L NaCl平皿上恢复生长功能的转化子是克隆的otsBA基因产物互补的结果，克隆的otsBA基因位于Mud5005质粒上。(3)酶切图谱分析：从图1看出每个pOSM质粒均比对照分子量增 大，但增大程度各不相同，即它们克隆到的染色体片段大小不等。已知otsBA两边有HindⅢ酶切位点，因此不论所克隆的染色体片段有多长，都应得到一定长度的otsBA基因片段，我们对pOSM系列质粒进行酶切分析，图谱如图2所示，以HindⅢ消化的λDNA为标准分子量，pEG5005有2个HindⅢ酶切，产生2个约5.2kb片段。检测的7个pOSM质粒经HindⅢ酶切后产生的DNA片段数量和大小均不相同，但它们都含有1个2.9kb的片段，这与Kaasen等人提出的大肠杆菌otsBA操纵子核苷酸长度相符[5]。
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图1 转导子的琼脂糖凝胶电泳分析
1～4和6～9.clones with chromosomal DNA fragmentsd .5.pEG5005 plasmid as size marker
图2 POSM的酶切图谱分析1～4和6～9HindIII酶切/转导子;5.HindIII/λDNA标准分子量;6..HindIII/PEG5005
2.2 otsBA基因的亚克隆和序列分析
由于Mud5005质粒很不稳定，且pOSM克隆质粒所含外源片段太大，不利于下一步的操作和分析，为此对otsBA基因进行了亚克隆。
2.2.1 pOSM201、pOSM202、pOSM203、pOSM204质粒构建 将带有otsBA基因的pOSM101质粒用 HindⅢ酶切后，分别与经同样酶切的高拷贝质粒pGEM7Zf(-)和低拷贝质粒PACYC184连接构建成pOSM201和pOSM202质粒，并分别转化otsBA缺失株FF4050，获 得FF40450(pOSM201)和FF4050 (pO- SM202)。同样将pOSM101质粒用HindⅢ+SmaⅠ进行双酶切，回收2.02kb片段和0.85kb片段与经HindⅢ+SmaⅠ双酶切的pUC18连接，获得测序质粒pOSM203、pOSM204(构建图略)。
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2.2.2 序列分析 用4种不同的荧光染料标记pOSM203、pOSM204核苷酸，用pUC/M13通用引物经DNA自动测序仪对前者正向测序，对后者反向测序。结果表明正向和反向共测定的785个核苷酸序列与Strom等[12]报道的完全相同(核苷酸序列略)，证实克隆片段是otsBA基因。
2.3 otsBA基因的诱导表达及产物分析
2.3.1 otsBA基因诱导表达 将上述构建的 FF4050(pOSM201)、FF4050(pOSM202)、MC4100和FF4050菌株分别接入M63培养液，37℃振荡培养过夜，以150稀释至50ml新鲜M63培养液，培养至对数后期，补加NaCl至终浓度为0.5mol/L(FF4050除外)，继续培养3h，离心收集细胞，分析测定海藻糖产物。
2.3.2 海藻糖提取和分析 结果见图3。经0.5mol/L NaCl诱导后野生型菌株MC4100能够合成海藻糖，图3中6位置，在与标准海藻糖相同层析高度显现较深的炭化条带，FF4050是otsBA基因缺失株，在任何生长或诱导条件下均不能表达该基因，也没有海藻糖的合成，因此在图中3位置看不到海藻糖炭化痕迹。FF4050(pOSM201)和FF4050(pOSM202)是带有2.9kb otsBA基因质粒转化株，经上述高渗诱导培养后，细胞中合成海藻糖，在薄层层析图谱(图3)4、5位置留下了清晰的糖炭化条带，说明克隆基因获得功能性表达。取同 样样品，用蒽酮-硫酸法定糖.结果如表1所示。
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图3 转化株中克隆基因的表达1.标准葡萄糖;2.标准海藻糖;3.otsBA基因缺失株;4.转化株1'5.转化株2;6.otsBA+野生株
Fig.3Cloning gene expression in transformed strains 1.Clucose ;2.Trehalose;3.FF4050;4.FF4050(posm201);5.FF4050(POSM202);6.MC4100
表1中FF4050是otsBA基因缺失株，在高盐培养基中不能生长，因此所列数据为未经诱导的海藻糖含量，MC4100在未经诱导时也有很低量的海藻糖合成(数据未列)，这可能是因为大肠杆菌细胞处于非高渗透压环境时，海藻糖合成酶基因otsBA的表达呈组成型。转化株诱导后均有海藻糖合成，其水平略低于野生型。pOSM201和pOSM202是带有克隆片段的不同拷贝数质粒，但海藻糖合成量并无明显差别，可见质粒拷贝数的高低对表达量的影响不大。
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表1 高渗诱导后转化株中的海藻糖合成
Table 1 Trehalose synthesis in transformed strains by osmotic induction 菌株
海藻糖含量8)(μg/109细胞)
Strains
Trehaolse amount(μg/109cell)
FF4050
0b)
FF4050(POSM201)
, http://www.100md.com 20.2
FF4050(POSM202)
19.5
MC4100
24.5
3 讨论
抗旱、抗盐碱等抗逆基因的发现及其克隆是植物基因工程研究领域中的重要课题。已经研究了上百种相关的代谢物，包括甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等。将这些渗调物质的合成酶基因转入植物后均能不同程度地提高耐盐性[13～15]。最近发现海藻 糖也是一种很有效的渗调剂，大肠杆菌中海藻糖负责细胞80%的抗高渗功能，由高渗诱导的海藻糖合成途径简单，只涉及两个基因、两步酶促反应，海藻糖合成酶基因被认为是重要和有希望的抗旱、抗盐碱基因而越来越受关注。 我们利用Mu转座子系统细胞内克隆的otsBA基因，与寄主染色体片段DNA序列完全一致，避免了用PCR方法扩增大片段DNA时可能产生的碱基错配，从而保证克隆基因的正确表达，而克隆基因的表达量并不受质粒拷贝数的影响。大肠杆菌合成与外界渗透压相平衡的海藻糖介质，或许可以更有效地利用能量和营养物质，克隆基因的表达同样受大肠杆菌抗渗透压机制的调节。将海藻糖合成酶基因转入植物对提高植物的抗高渗、耐干旱能力有重要意义。otsBA基因的克隆为进一步开展这一目的的研究，提供了可靠的实验依据和材料，有关研究正在进行之中。
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