应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价
作者：韩晓红 石远凯 刘鹏 王军 冯奉仪
单位：韩晓红(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)这；石远凯(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；刘鹏(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；王军(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；冯奉仪(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)
关键词：
中国免疫学杂志000315 中国图书分类号 R392-33
应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干 /祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及 APBSC中的CD34+细胞，本文比较了几种 FACS检测CD34+细胞方法的异同。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺(CTX)+重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的实体瘤患者(淋巴瘤、乳腺癌)，采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机(Baxter公司，美国)。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体(Immunotec，法国)室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll(相对密度1.007)梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
, 百拇医药 1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪(EPICS ELITE ESP， COULTER公司)测定CD34+细胞占单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的百分率，另一管经 1%多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10(ClassⅡ,Immunotec)和表达第3类抗原表位 8G12( HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson)的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC(J33)和抗CD34-PE(HPCA2)，用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异(P>0.50)。
2.2 同一样品经 1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9%～49.5%之间，平均CV值为 32.2%。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异(P>0.05)。
2.4 CD34-PE/CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5%，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3%。
, 百拇医药
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存(冷冻)、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果[1]。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1%～ 6%，批间变异<20%的国际质控标准[2]。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高[2]，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD34+细胞，结果是否有差异，则报道不一[3,4]。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08%～19.31%，CV值为100.1%～136.6%[1]。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会(ISHAGE)成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法[5]，建议双标记CD34-PE/CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干/祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光(SSC)一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开[4]。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群[5]。
, http://www.100md.com
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC[6]；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性[7]；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
基金项目：本课题受国家“九.五”攻关课题(96-906-01-12)和国家教委
高等学校博士学科点专项科研基金资助
作者简介：韩晓红，女，31岁，助理研究员，从事自体外周血造血干细
胞移植实验及实验肿瘤学研究；
石远凯，男，39岁，主任医师，硕士生导师，从事肿瘤内科及
, http://www.100md.com
自体外周血干细胞移植治疗恶性实体瘤的临床与实验研究
参考文献：
[1] Lowdell M W, Bainbridge D R. External quality assurance for CD34 cell enumeration-results of a preliminary national trial . Bone Marrow Trans- plantation , 1996 ; 17(5): 849
[2]Siena S , Bregni M , Brando B et al. Flow cytometry for clinical estimation of circulating hematopoietic progenitors for autologous transplantation in cancer patients . Blood , 1991 ; 77(2) : 400
, 百拇医药
[3]Titley I , Healy L E , Scott M et al. Extent of variability inherent in measurements of CD34-positive cells in different human hemapoietic tissues . Bone Marrow Transplantation , 1995; 16(4) : 611
[4]Sutherland D R , Keating A , Nayar R et al. Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematology, 1994 ; 22(10) : 1003
[5]Sutherland D R , Anderson L , Keeney M et al. The ISHAGE for CD34+ cell deterination by flow cytometry . J Hematotherapy , 1996 ; 5(3) : 213
, 百拇医药
[6]Lumley M A , McDonald D F , Czarnecka H M et al. Quality assurance of CD34+ cell stimation in leucapheresis products . Bone Marrow Transplantation ,1996 ; 18 (4): 791
[7]Chang A , David D F M A . The influence of flow cytometric gating strategy on the standardization of CD34+ cell quantitation : an Australian multicenter study .J Hematotherapy , 1996 ; 5 (6) : 605
收稿日期：1999-03-29
修改日期：1999-07-19, 百拇医药
单位：韩晓红(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)这；石远凯(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；刘鹏(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；王军(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)；冯奉仪(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院内科，北京100021)
关键词：
中国免疫学杂志000315 中国图书分类号 R392-33
应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干 /祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及 APBSC中的CD34+细胞，本文比较了几种 FACS检测CD34+细胞方法的异同。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺(CTX)+重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的实体瘤患者(淋巴瘤、乳腺癌)，采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机(Baxter公司，美国)。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体(Immunotec，法国)室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll(相对密度1.007)梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
, 百拇医药 1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪(EPICS ELITE ESP， COULTER公司)测定CD34+细胞占单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的百分率，另一管经 1%多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10(ClassⅡ,Immunotec)和表达第3类抗原表位 8G12( HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson)的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC(J33)和抗CD34-PE(HPCA2)，用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异(P>0.50)。
2.2 同一样品经 1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9%～49.5%之间，平均CV值为 32.2%。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异(P>0.05)。
2.4 CD34-PE/CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5%，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3%。
, 百拇医药
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存(冷冻)、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果[1]。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1%～ 6%，批间变异<20%的国际质控标准[2]。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高[2]，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD34+细胞，结果是否有差异，则报道不一[3,4]。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08%～19.31%，CV值为100.1%～136.6%[1]。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会(ISHAGE)成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法[5]，建议双标记CD34-PE/CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干/祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光(SSC)一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开[4]。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群[5]。
, http://www.100md.com
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC[6]；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性[7]；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
基金项目：本课题受国家“九.五”攻关课题(96-906-01-12)和国家教委
高等学校博士学科点专项科研基金资助
作者简介：韩晓红，女，31岁，助理研究员，从事自体外周血造血干细
胞移植实验及实验肿瘤学研究；
石远凯，男，39岁，主任医师，硕士生导师，从事肿瘤内科及
, http://www.100md.com
自体外周血干细胞移植治疗恶性实体瘤的临床与实验研究
参考文献：
[1] Lowdell M W, Bainbridge D R. External quality assurance for CD34 cell enumeration-results of a preliminary national trial . Bone Marrow Trans- plantation , 1996 ; 17(5): 849
[2]Siena S , Bregni M , Brando B et al. Flow cytometry for clinical estimation of circulating hematopoietic progenitors for autologous transplantation in cancer patients . Blood , 1991 ; 77(2) : 400
, 百拇医药
[3]Titley I , Healy L E , Scott M et al. Extent of variability inherent in measurements of CD34-positive cells in different human hemapoietic tissues . Bone Marrow Transplantation , 1995; 16(4) : 611
[4]Sutherland D R , Keating A , Nayar R et al. Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematology, 1994 ; 22(10) : 1003
[5]Sutherland D R , Anderson L , Keeney M et al. The ISHAGE for CD34+ cell deterination by flow cytometry . J Hematotherapy , 1996 ; 5(3) : 213
, 百拇医药
[6]Lumley M A , McDonald D F , Czarnecka H M et al. Quality assurance of CD34+ cell stimation in leucapheresis products . Bone Marrow Transplantation ,1996 ; 18 (4): 791
[7]Chang A , David D F M A . The influence of flow cytometric gating strategy on the standardization of CD34+ cell quantitation : an Australian multicenter study .J Hematotherapy , 1996 ; 5 (6) : 605
收稿日期：1999-03-29
修改日期：1999-07-19, 百拇医药