组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体研制及其特性鉴定
作者：王钦红 王鸿利 邵慧珍 朱立红 王学峰
单位：王钦红(上海第二医科大学第六临床医院，上海 200233)；王鸿利(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；邵慧珍(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；朱立红(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；王学峰(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)
关键词：组织型纤溶酶原激活物；杂交瘤技术；单克隆抗体
中国免疫学杂志000310 摘 要：目的：应用t-PA单克隆抗体建立ELISA法检测t-PA含量以及研究t-PA功能和结构的关系。方法：运用杂交瘤技术研制5株t-PA单克隆抗体，进行较系统的免疫特性的鉴定。结果：5株单抗特异性高，与u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA均无交叉反应；亲和力强，1H4>3C10>5H10>4E6>4C6；腹水效价5×10-6～1×10-7；免疫球蛋白亚类为IgG1和IgG2a；5株抗体中，3C10和1H4可明显抑制t-PA活性，而5H10、4E6、4C6则对t-PA活性无明显影响。结论：为进一步应用这些单抗作为研究手段提供了基础。
, 百拇医药
中国图书分类号：R392.11
The production and charactor identification of monoclonal antibodies against tissue-type plasminogen activator
WANG Qin-Hong
(Shanghai Sixth Hospital，Shanghai Second Medical University,Shanghai 200233)
WANG Hong-Li SHAO Hui-Zhen et al.
(Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200000)
, 百拇医药
Abstract：Objective:To establish sandwich ELISA assay by self-made monoclonal antibody against tissue-type plasminogen activator (t-PA) and study the relationship between struction and function for t-PA.Methods:Successfully produced five hybridoma cell lines of tissue-type plasminogen activator and performed the identification of immunologic charactors to great extent.Results:Five monoclonal antibodies have mainly possessed charactors as following.High specificity with no cross reaction with u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA；strong affinity which showed 1H4>3C10>5H10>4E6>4C6;high titer degree of ascites fluid that was 5×10-6～1×10-7 and immunoglobulin subclass was IgG1 and IgG2a.Furthermore,among these t-PA McAb,3C10、1H4 could obviously inhibit t-PA activity while 5H10、4E4、4C6 had no significantly influence on t-PA activity.Conclusion:It is suggested that these t-PA McAb can almost likely be applied for further study.
, 百拇医药
Key words：Tissue-type plasminogen activator Hybridoma technology Monoclonal antibody
组织型纤溶酶原激活物(Tissue type plasminogen activator,t-PA)是体内纤溶系统的重要组成，其含量和活性的变化可直接反映纤溶状态的改变，与血栓形成性疾病和高凝状态关系密切，因此，定量检测t-PA含量和活性不仅为血栓形成的诊断提供客观依据，同时也在研究疾病发生机制、指导临床用药以及预后估计等方面具有重要意义。本文成功地研制了5株t-PA单克隆抗体，并对其免疫学特性作了鉴定，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料 rt-PA抗原：中科院上海细胞研究所戚正武教授惠赠；Balb/c小鼠：上海BK公司；HAT，HT培养基：Sigma公司产品；PX8.AG.653瘤细胞株：上海捷门生物公司引进。
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1.2 方法
1.2.1 t-PA杂交瘤细胞株的建立和McAb制备 按常规方法进行。
1.2.2 杂交瘤细胞培养上清液和效价测定 间接ELISA法。
1.2.3 t-PA McAb免疫球蛋白亚类鉴定 琼脂扩散法。
1.2.4 t-PA McAb纯度及t-PA抗原纯度鉴定 SDS-PAGE电泳。
1.2.5 t-PA McAb特异性鉴定 分别将u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA包板(20 μg/孔)，间接ELISA法观察t-PA McAb与这些物质有无交叉反应。
1.2.6 抗原阻断试验 以10-2稀释的小鼠腹水或已纯化的McAb与等体积t-PA抗原(200 μg/ml)混合，4℃过夜，离心3 000 r/min，20 min，吸取上清作一系列10倍稀释，与固相t-PA作ELISA间接法为试验组；同法以PBS代替t-PA为对照组。
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1.2.7 相对亲和力测定 按文献[1]进行。
1.2.8 t-PA McAb抗原结合位点的分析(相加试验) 按文献[2]进行。
1.2.9 t-PA McAb对t-PA活性的影响 按文献[3]进行。羊抗鼠Ig多抗同样处理作为对照组。
1.2.10 杂交瘤细胞株稳定性试验 杂交瘤细胞株于液氮-196℃冻存半年以上，经复苏、培养，检查其上清液分泌t-PA McAb的能力。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株建立 共进行3次细胞融合，从初始44个阳性孔中经2～3次克隆化获得5株能稳定分泌t-PA McAb的细胞株，分别命名为5H10、1H4、4C6、4E6、3C10，抗体分泌平均阳性率为5.3%。
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2.2 培养上清液和腹水效价与Ig亚类 见表1。
表1 5株t-PA McAb 培养上清液和腹水效价以及Ig亚类
Tab.1 The OD value of culture supernate,titer degree of ascites fluid and immunoglobulin subclass for five t-PA McAb Cell line
Supernate of culture
Ascite fluid
Immunoglobulin subclass
5H10
1.909
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5×10-6
IgG1
1H4
1.922
5×10-6
IgG1
4C6
2.010
1×10-7
IgG2a
4E6
1.920
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1×10-7
IgG1
3C10
1.699
1×10-7
IgG1
2.3 特异性鉴定 5株t-PA McAb与u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA均无交叉反应，测得的OD值与对照孔无明显差异，说明各McAb具有较高的特异性。
2.4 抗原阻断试验 t-PA McAb经t-PA抗原吸收后，其上清液用ELISA法检测，结果与对照组相比，OD值明显下降。以1H4为例，见图1。
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图1 1H4 t-PA McAb抗原吸收试验
Fig.1 The test of antigen absorbtion for 1H4 t-PA McAb
2.5 抗原结合位点的分析 单抗相加试验可以较简便地分析2种McAb所针对的抗原决定簇，当相加指数A.I值>50%时，即可认为识别不同的抗原决定簇。实验结果见表2，5株t-PA McAb针对3株抗原决定簇。
表2 5株t-PA McAb相加试验结果
Tab.2 The results of additive test five t-PA McAbs
t-PA McAb
5H10
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1H4
4C6
4E6
3C10
5H10
—
67
21
38
8.6
1H4
67
—
, http://www.100md.com 40
81
88
4C6
21
40
—
39
42
4E6
38
81
39
—
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76
3C10
8.6
88
42
76
—
2.6 对t-PA活性的影响 5株McAb中，3C10和1H4表现为明显抑制t-PA活性；而5H10、4E6、4C6则对t-PA活性无明显影响，见图2。
图2 t-PA McAb对t-PA活性的影响
Fig.2 The influence of t-PA McAb on t-PA activity
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2.7 t-PA McAb相对亲和力 见图3相对亲和力曲线。各McAb 50%最大结合浓度：5H10 0.185 μg/ml；1H4 0.146 μg/ml；4E6 0.312 μg/ml；4C6 0.44 μg/ml；3C10 0.153 μg/ml，由于亲和力越大，所需抗体浓度越低，故相对亲和力为1H4>3C10>5H10>4E6>4C6。
图3 5株t-PA McAb相对亲和力曲线
Fig.3 The curve of relative affinity for five t-PA McAb
3 讨论
本文以常规方法成功地建立了5株稳定分泌rt-PA单抗的杂交瘤细胞株，并对其免疫学特性进行了系统的鉴定，这为进一步应用这些单抗建立ELISA法检测t-PA：Ag含量、制备亲和层析柱纯化t-PA抗原以及进行t-PA结构和功能的研究奠定了基础。5株t-PA McAb分别为IgG1、IgG2a型，腹水效价5×10-6～1×10-7，亲和力及特异性高。杂交瘤细胞株性质稳定，冻存半年以上仍具分泌抗体能力。相对亲和力为1H4>3C10>5H10>4E6>4C6。良好的亲和力和特异性为应用这些单抗建立ELISA法检测t-PA：Ag提供了有力的保证。
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抗原结合位点的分析方法有多种[4]，其中经典的双抗体竞争ELISA法，结果直观易分析，但需提纯和酶标各种McAb，手续较麻烦。本文应用简便快速的ELISA相加试验，结果表明3C10和1H4各针对1个抗原决定簇；而5H10、4E6、4C6则针对同1个抗原决定簇或决定簇位置较接近。
t-PA为一种血管内皮细胞合成释放的糖蛋白，由527个氨基酸组成。双链t-PA由重链和轻链组成，自N端起重链由4个结构区域组成(F-BGF-K-K)，其中K区域是t-PA结合纤维蛋白的部位，是t-PA活性发挥的先决条件；而轻链则是t-PA活性中心的部位。本文研制的5株单抗中，1H4和3C10能明显抑制t-PA活性，推测可能直接作用于t-PA活性中心部位，但也不排除作用于t-PA纤维蛋白结合部位或其他区域而影响了t-PA活性的发挥。同时由于1H4和3C10分别识别2种不同的抗原位点，故认为可能其中之一识别t-PA活性中心，而另一株则识别t-PA的纤维蛋白结合部位。但国外有文献报道，某些t-PA McAb既不识别活性中心也不识别纤维蛋白结合部位，同样也能抑制t-PA的活性，因此研究某一单抗识别位点的最好方法是DNA重组技术构建几种不同的t-PA变构体，利用这些变构体作为抗原就有可能分析不同的t-PA单抗所识别的结构区域。
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作者简介：王钦红，男，30岁，血液学专业硕士生
参考文献：
[1]Graewe R,Nimmo A M,Lew C M et al.Influence of antibody on the performance of different antibodies assay.J Immunol Methods,1984;72:177
[2]Frigue B,Chariance L D,Pays J et al.A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.J Immunol Methods,1983;60:351
[3]Hao D,Wang J Y,Jia H Y et al.Production and characterization of monocolonal antibodies against tissue-type plasminogen activator.Chin J CO Biochemi,1989;6:223
[4]章谷生，顾梁明，朱可一et al.单克隆抗体在医学领域中的应用.上海：上海科学技术出版社，1984:128-134
收稿日期：1998-05-18
修改日期：1998-08-30, 百拇医药
单位：王钦红(上海第二医科大学第六临床医院，上海 200233)；王鸿利(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；邵慧珍(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；朱立红(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)；王学峰(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200000)
关键词：组织型纤溶酶原激活物；杂交瘤技术；单克隆抗体
中国免疫学杂志000310 摘 要：目的：应用t-PA单克隆抗体建立ELISA法检测t-PA含量以及研究t-PA功能和结构的关系。方法：运用杂交瘤技术研制5株t-PA单克隆抗体，进行较系统的免疫特性的鉴定。结果：5株单抗特异性高，与u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA均无交叉反应；亲和力强，1H4>3C10>5H10>4E6>4C6；腹水效价5×10-6～1×10-7；免疫球蛋白亚类为IgG1和IgG2a；5株抗体中，3C10和1H4可明显抑制t-PA活性，而5H10、4E6、4C6则对t-PA活性无明显影响。结论：为进一步应用这些单抗作为研究手段提供了基础。
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中国图书分类号：R392.11
The production and charactor identification of monoclonal antibodies against tissue-type plasminogen activator
WANG Qin-Hong
(Shanghai Sixth Hospital，Shanghai Second Medical University,Shanghai 200233)
WANG Hong-Li SHAO Hui-Zhen et al.
(Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200000)
, 百拇医药
Abstract：Objective:To establish sandwich ELISA assay by self-made monoclonal antibody against tissue-type plasminogen activator (t-PA) and study the relationship between struction and function for t-PA.Methods:Successfully produced five hybridoma cell lines of tissue-type plasminogen activator and performed the identification of immunologic charactors to great extent.Results:Five monoclonal antibodies have mainly possessed charactors as following.High specificity with no cross reaction with u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA；strong affinity which showed 1H4>3C10>5H10>4E6>4C6;high titer degree of ascites fluid that was 5×10-6～1×10-7 and immunoglobulin subclass was IgG1 and IgG2a.Furthermore,among these t-PA McAb,3C10、1H4 could obviously inhibit t-PA activity while 5H10、4E4、4C6 had no significantly influence on t-PA activity.Conclusion:It is suggested that these t-PA McAb can almost likely be applied for further study.
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Key words：Tissue-type plasminogen activator Hybridoma technology Monoclonal antibody
组织型纤溶酶原激活物(Tissue type plasminogen activator,t-PA)是体内纤溶系统的重要组成，其含量和活性的变化可直接反映纤溶状态的改变，与血栓形成性疾病和高凝状态关系密切，因此，定量检测t-PA含量和活性不仅为血栓形成的诊断提供客观依据，同时也在研究疾病发生机制、指导临床用药以及预后估计等方面具有重要意义。本文成功地研制了5株t-PA单克隆抗体，并对其免疫学特性作了鉴定，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料 rt-PA抗原：中科院上海细胞研究所戚正武教授惠赠；Balb/c小鼠：上海BK公司；HAT，HT培养基：Sigma公司产品；PX8.AG.653瘤细胞株：上海捷门生物公司引进。
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1.2 方法
1.2.1 t-PA杂交瘤细胞株的建立和McAb制备 按常规方法进行。
1.2.2 杂交瘤细胞培养上清液和效价测定 间接ELISA法。
1.2.3 t-PA McAb免疫球蛋白亚类鉴定 琼脂扩散法。
1.2.4 t-PA McAb纯度及t-PA抗原纯度鉴定 SDS-PAGE电泳。
1.2.5 t-PA McAb特异性鉴定 分别将u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA包板(20 μg/孔)，间接ELISA法观察t-PA McAb与这些物质有无交叉反应。
1.2.6 抗原阻断试验 以10-2稀释的小鼠腹水或已纯化的McAb与等体积t-PA抗原(200 μg/ml)混合，4℃过夜，离心3 000 r/min，20 min，吸取上清作一系列10倍稀释，与固相t-PA作ELISA间接法为试验组；同法以PBS代替t-PA为对照组。
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1.2.7 相对亲和力测定 按文献[1]进行。
1.2.8 t-PA McAb抗原结合位点的分析(相加试验) 按文献[2]进行。
1.2.9 t-PA McAb对t-PA活性的影响 按文献[3]进行。羊抗鼠Ig多抗同样处理作为对照组。
1.2.10 杂交瘤细胞株稳定性试验 杂交瘤细胞株于液氮-196℃冻存半年以上，经复苏、培养，检查其上清液分泌t-PA McAb的能力。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株建立 共进行3次细胞融合，从初始44个阳性孔中经2～3次克隆化获得5株能稳定分泌t-PA McAb的细胞株，分别命名为5H10、1H4、4C6、4E6、3C10，抗体分泌平均阳性率为5.3%。
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2.2 培养上清液和腹水效价与Ig亚类 见表1。
表1 5株t-PA McAb 培养上清液和腹水效价以及Ig亚类
Tab.1 The OD value of culture supernate,titer degree of ascites fluid and immunoglobulin subclass for five t-PA McAb Cell line
Supernate of culture
Ascite fluid
Immunoglobulin subclass
5H10
1.909
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5×10-6
IgG1
1H4
1.922
5×10-6
IgG1
4C6
2.010
1×10-7
IgG2a
4E6
1.920
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1×10-7
IgG1
3C10
1.699
1×10-7
IgG1
2.3 特异性鉴定 5株t-PA McAb与u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA均无交叉反应，测得的OD值与对照孔无明显差异，说明各McAb具有较高的特异性。
2.4 抗原阻断试验 t-PA McAb经t-PA抗原吸收后，其上清液用ELISA法检测，结果与对照组相比，OD值明显下降。以1H4为例，见图1。
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图1 1H4 t-PA McAb抗原吸收试验
Fig.1 The test of antigen absorbtion for 1H4 t-PA McAb
2.5 抗原结合位点的分析 单抗相加试验可以较简便地分析2种McAb所针对的抗原决定簇，当相加指数A.I值>50%时，即可认为识别不同的抗原决定簇。实验结果见表2，5株t-PA McAb针对3株抗原决定簇。
表2 5株t-PA McAb相加试验结果
Tab.2 The results of additive test five t-PA McAbs
t-PA McAb
5H10
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1H4
4C6
4E6
3C10
5H10
—
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1H4
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2.6 对t-PA活性的影响 5株McAb中，3C10和1H4表现为明显抑制t-PA活性；而5H10、4E6、4C6则对t-PA活性无明显影响，见图2。
图2 t-PA McAb对t-PA活性的影响
Fig.2 The influence of t-PA McAb on t-PA activity
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2.7 t-PA McAb相对亲和力 见图3相对亲和力曲线。各McAb 50%最大结合浓度：5H10 0.185 μg/ml；1H4 0.146 μg/ml；4E6 0.312 μg/ml；4C6 0.44 μg/ml；3C10 0.153 μg/ml，由于亲和力越大，所需抗体浓度越低，故相对亲和力为1H4>3C10>5H10>4E6>4C6。
图3 5株t-PA McAb相对亲和力曲线
Fig.3 The curve of relative affinity for five t-PA McAb
3 讨论
本文以常规方法成功地建立了5株稳定分泌rt-PA单抗的杂交瘤细胞株，并对其免疫学特性进行了系统的鉴定，这为进一步应用这些单抗建立ELISA法检测t-PA：Ag含量、制备亲和层析柱纯化t-PA抗原以及进行t-PA结构和功能的研究奠定了基础。5株t-PA McAb分别为IgG1、IgG2a型，腹水效价5×10-6～1×10-7，亲和力及特异性高。杂交瘤细胞株性质稳定，冻存半年以上仍具分泌抗体能力。相对亲和力为1H4>3C10>5H10>4E6>4C6。良好的亲和力和特异性为应用这些单抗建立ELISA法检测t-PA：Ag提供了有力的保证。
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抗原结合位点的分析方法有多种[4]，其中经典的双抗体竞争ELISA法，结果直观易分析，但需提纯和酶标各种McAb，手续较麻烦。本文应用简便快速的ELISA相加试验，结果表明3C10和1H4各针对1个抗原决定簇；而5H10、4E6、4C6则针对同1个抗原决定簇或决定簇位置较接近。
t-PA为一种血管内皮细胞合成释放的糖蛋白，由527个氨基酸组成。双链t-PA由重链和轻链组成，自N端起重链由4个结构区域组成(F-BGF-K-K)，其中K区域是t-PA结合纤维蛋白的部位，是t-PA活性发挥的先决条件；而轻链则是t-PA活性中心的部位。本文研制的5株单抗中，1H4和3C10能明显抑制t-PA活性，推测可能直接作用于t-PA活性中心部位，但也不排除作用于t-PA纤维蛋白结合部位或其他区域而影响了t-PA活性的发挥。同时由于1H4和3C10分别识别2种不同的抗原位点，故认为可能其中之一识别t-PA活性中心，而另一株则识别t-PA的纤维蛋白结合部位。但国外有文献报道，某些t-PA McAb既不识别活性中心也不识别纤维蛋白结合部位，同样也能抑制t-PA的活性，因此研究某一单抗识别位点的最好方法是DNA重组技术构建几种不同的t-PA变构体，利用这些变构体作为抗原就有可能分析不同的t-PA单抗所识别的结构区域。
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作者简介：王钦红，男，30岁，血液学专业硕士生
参考文献：
[1]Graewe R,Nimmo A M,Lew C M et al.Influence of antibody on the performance of different antibodies assay.J Immunol Methods,1984;72:177
[2]Frigue B,Chariance L D,Pays J et al.A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.J Immunol Methods,1983;60:351
[3]Hao D,Wang J Y,Jia H Y et al.Production and characterization of monocolonal antibodies against tissue-type plasminogen activator.Chin J CO Biochemi,1989;6:223
[4]章谷生，顾梁明，朱可一et al.单克隆抗体在医学领域中的应用.上海：上海科学技术出版社，1984:128-134
收稿日期：1998-05-18
修改日期：1998-08-30, 百拇医药