抗人C1q杂交瘤细胞中一未知DNA片段的克隆与分析
作者：王 晴 朱锡华f$sh, 百拇医药
单位：第三军医大学免疫学教研室，中国人民解放军免疫学研究所 重庆 400038f$sh, 百拇医药
关键词：杂交瘤细胞；抗人C1qMcAb；克隆；核苷酸序列分析f$sh, 百拇医药
免疫学杂志990211 摘 要 使用一对IgVH通用引物，应用RT-PCR技术，从分泌抗人C1q McAb的B6杂交瘤细胞株总RNA扩增出一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。但检索结果表明，它与鼠的多种基因及鼠、人Ig超家族的某些基因序列有一些相似性。对来自鼠杂交瘤细胞的未知DNA片段的克隆与分析，将为以后的基因工程抗体方面的研究提供一些线索。f$sh, 百拇医药
中图号 R392.1f$sh, 百拇医药
CLONING AND ANALYSIS OF AN UNKNOWN DNAf$sh, 百拇医药
FRAGMENT FROM HYBRIDOMA CELLf$sh, 百拇医药
SECRETING McAb AGAINST HUMAN C1qf$sh, 百拇医药
Wang Qing，Zhu Xihuaf$sh, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038)f$sh, 百拇医药
Abstract Utilizing standard RT-PCR with a pair of primers derived from framework 1 and framework 4 consensus sequences of immunoglobulin heavy chain variable domains，we amplified a 390bp±DNA fragment from the total cellular RNA of hybridoma cell B6 secreting specific McAb against human C1q.The PCR fragment was then directionally inserted into the vector pGEM-11Zf(-).Nucleic acid sequence was determined by DNA sequencing and characterized by computer-aided sequence homology analysis.The results showed that：(i)The DNA fragment consists of 387 nucleotides.(ii)It is not identical or significantly similar(homologous)to any of the published sequences，but it is very close to many mouse genes and some Ig superfamily genes of human and mouse.The cloning of the unknown 387bp fragment from mouse hybridoma cell will give some help for the later gene engineering antibody research market.
Key words Hybridoma，C1q，McAb，Cloning，Sequence analysisp9., 百拇医药
本研究利用PCR技术，选取本室制备的分泌抗人C1q McAb的B6杂交瘤细胞株进行可变区(Ⅴ区)基因的克隆、测序，为探讨Ⅴ基因的作用及进一步研制抗人C1q小抗体提供有益的指导。结果利用合成的一对IgVH通用引物，从抗人C1qB6杂交瘤细胞总RNA经RT-PCR扩增得到一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。现将实验过程及结果披露如下，并对该未知DNA片段进行初步分析与讨论。p9., 百拇医药
1 材料和方法p9., 百拇医药
1.1 材料p9., 百拇医药
1.1.1 细胞株、质粒及菌种：鼠杂交瘤细胞株B6，分泌抗人C1q McAb(IgG1)，由本室制备及保存[1]。质粒pGEM-11Zf(-)、大肠杆菌JM109由本室保存。p9., 百拇医药
1.1.2 试剂：RNA酶(Promega，美国)，逆转录酶(Gibco BRL，美国)，Taq DNA聚合酶(Promega，美国)，PCR引物(中科院上海细胞所)，低熔点琼脂糖(华美公司)，限制性内切酶EcoR I、Sal I(Promega，美国)，T4 DNA连接酶(Promega，美国)，小量制备质粒试剂盒(Bio-Rad，美国)，DNA测序试剂盒T7 Sequence Kit(Pharmacia，瑞士)。p9., 百拇医药
1.2 方法p9., 百拇医药
1.2.1 复苏及扩增培养B6杂交瘤细胞：按常规方法进行。p9., 百拇医药
1.2.2 提取B6杂交瘤细胞总RNA：参照Chomczynski[2]方法进行。p9., 百拇医药
1.2.3 PCR引物的设计：本实验所用引物是根据Orlandi[3]等设计的通用引物顺序，在5′和3′端分别引入Sal I、EcoR I酶切位点，以利于扩增的DNA片段定向克隆进测序载体。
1.2.4 RT-PCR扩增：首先依反转录cDNA第一链合成Kit合成cDNA第一链，再设定循环参数进行PCR反应：在100μl的反应体系中加入适量逆转录产物(RNA*cDNA)，2μl dNTPs(10mmol)，10μl MgCl2(15mmol)，扩增VH的正、反向引物(26pmol/μl、23pmol/μl)各1μl，10μl10×buffer，95°C变性10min后，加入Taq DNA聚合酶3μl(1u/μl)，而后进行如下循环：93°C变性1min、55°C退火1min、72°C延伸1.5min，33次循环后，72°C继续延伸10min。扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳观察。按分子克隆[4]的方法，用低熔点琼脂糖(LMA)凝胶挖块回收法回收PCR扩增片段。n, http://www.100md.com
1.2.5 PCR产物克隆进pGEM-11Zf(-)：克隆策略见图1，经氨苄抗性、α-互补颜色筛选法初筛重组子，EcoR I、Sal I双酶切和PCR扩增法进一步鉴定。
n, http://www.100md.com
图 1 PCR扩增片段克隆进pGEM-11Zf(-)质粒载体n, http://www.100md.com
Fig 1 Cloning of PCR product into plasmid pGEM-11Zf(-)n, http://www.100md.com
1.2.6 DNA序列测定及分析：以小量制备质粒试剂盒制备重组子模板，用Sanger的双脱氧链终止法，以pUC/M13正向引物、VHback引物分别从二头对PCR扩增片段进行手工序列测定。通过计算机网络系统，借助BLASTX、TBLASTN、TBLASTX、FASTA等程序对获得的DNA片段进行GenBank、EMBL、DDBJ、PPB等序列数据库的类似性检索。n, http://www.100md.com
2 结果n, http://www.100md.com
2.1 杂交瘤细胞总RNA的提取、鉴定 图2示不同批次提取的细胞总RNA，清晰可见其内对照标准28S、18S、5S三条带和位于18S附近呈云雾状的mRNA，说明所提细胞总RNA是完整的。
图 2 杂交瘤细胞总RNA9, 百拇医药
Fig 2 Total RNA of B6 hybridoma cell9, 百拇医药
Lane 1：5SRNA Marker Lane 2～4：Total RNA of B6 hybridoma cell from different batches9, 百拇医药
2.2 RT-PCR 经PT-PCR扩增产生一条390bp±的DNA片段，但可见非特异性连续梯度带的出现，见图3。
9, 百拇医药
图 3 RT-PCR扩增产物电泳图谱9, 百拇医药
Fig 3 2% agarose gel electrophoresis of the PCR pro-ducts9, 百拇医药
Lane 1：390bp±band with non-specific continous bands；9, 百拇医药
Lane 2：DNA small molecular weight marker(bp)：9, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/1109, 百拇医药
2.3 重组子的筛选与鉴定 在转化平皿上，挑取氨苄抗性白色菌落，扩增后小量快速抽提质粒，以EcoR I单酶切后，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察到有DNA滞后带，说明可能是因插入外源DNA而成为分子量增大的重组子。对可疑阳性重组子进行EcoR I、Sal I双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳可见切下390bp±的小片段DNA(见图4)。挑取阳性重组子作PCR扩增，获得390bp±的DNA片段(见图5)。
9, 百拇医药
图 4 可疑阳性重组子双酶切电泳图谱9, 百拇医药
Fig 4 2% agarose gel electrophoresis of recombinant DNA digested by EcoR I and sal I
Lane 1，2，4，5：390bp±bandg@x, 百拇医药
Lane 3：DNA Small molecular weight marker(bp)：g@x, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/110
g@x, 百拇医药
图 5 阳性重组子PCR扩增产物电泳图谱g@x, 百拇医药
Fig 5 2% agarose gel electrophoresis pattern of recombinant DNA after PCRg@x, 百拇医药
Lane 1，2，4，5：390bp±bandg@x, 百拇医药
Lane 3：DNA Small molecular weight marker(bp)：g@x, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/110g@x, 百拇医药
2.4 PCR扩增片段序列测定 PCR扩增片段序列测定结果表明，该DNA片段的长度为387bp(见图6、图7)。
g@x, 百拇医药
图 6 DNA序列的放射自显影图g@x, 百拇医药
Fig 6 Autoradiograph of the insert containing clones
g@x, 百拇医药
图 7 PCR扩增片段序列g@x, 百拇医药
Fig 7 Nucleotide sequence of 387bp DNA fragmentg@x, 百拇医药
3 讨论g@x, 百拇医药
本实验以一对IgVH通用引物，在从抗人C1q B6杂交瘤细胞株克隆VH基因的过程中，得到一长为387bp的DNA片段。其长度与预测的VH长度相近。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。但检索结果表明，它与鼠的多种基因及鼠、人IgVH、TCR β链等Ig超家族某些基因的一小段序列(短序列，几十个碱基到上百个碱基不等)有62%～95%的相同率，说明该未知DNA片段与鼠的基因及鼠、人Ig超家族的某些基因序列有一些相似性。对该来自鼠杂交瘤细胞的未知DNA片段的获得，考虑有以下两个方面的原因：
3.1 PCR自身局限性导致的假阳性结果 PCR技术是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。它只需设计一对特异性引物，通过模板的变性、引物与模板的退火和延伸三步骤的循环反应，便可在数小时内将目的基因扩增百万倍，从而极大地减轻了实验室的工作强度。对整个PCR扩增体系，引物设计是最为关键的问题。本实验所用的一对通用引物分别与FR1、FR4互补，并引入了限制性内切酶位点EcoR I、Sal I。引物VHback 28bp，G+C含量64%；VH for 31bp，G+C含量55%，基本符合PCR反应所要求的引物设计原则。0'8du.{, http://www.100md.com
尽管PCR给人们提供了诸多便利，但仍存在自身局限性。PCR的强大扩增能力和极高的检测灵敏度可导致假阳性结果，且在扩增过程中单核苷酸掺入的忠实性并非100%，因此该技术最大的缺憾就在于灵敏度过高和非特异扩增所带来的假阳性结果。要提高PCR反应的特异性，可采取适当提高引物与模板的退火温度、降低引物浓度、缩短延伸反应的时间、保持最适的Mg++浓度等措施。本实验在采取上述措施后，PCR产物经电泳分析仍可见非特异性连续梯度带。任何事物都具有两面性，也许正是由于PCR固有的缺陷，方为本研究克隆到一未知DNA片段提供了可能。0'8du.{, http://www.100md.com
3.2 杂交瘤细胞自身的复杂性 杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合而成。据文献报道[5～7]，当从杂交瘤细胞克隆抗体VH或VL时，用抗体可变区特异性引物常扩增得到一些异常序列，它们来自杂交瘤细胞中的异常mRNA。这些异常mRNA有时可能会大大超过正常的抗体mRNA，影响了RT-PCR克隆的效率，使得正常轻、重链的扩增效率很低，甚至只能得到异常的序列。通常情况下，这些异常序列可能实际上成为PCR扩增的阻抑子[8]。Carroll等[9]认为对这些异常mRNA转录程度的控制可能依赖一条独立的染色体，而该染色体在细胞融合过程中丢失，从而使得异常mRNA过度表达。从杂交瘤细胞中得到的这些异常序列的来源常可追寻至用作融合的骨髓瘤细胞系MOPC21，实验证实它们来自MOPC21非功能性基因，经过RNA转录、进一步剪切为成熟的mRNA[10]。这些异常mRNA在VJ重组位点异常重排，导致移码突变或终止密码子出现，使其不能翻译为有功能的蛋白质。有些异常mRNA的来源不能追寻至用作细胞融合的骨髓瘤细胞，而可能来自参与杂交瘤融合的抗原刺激的正常B淋巴细胞的第二个等位基因的错误重排，这种错排直到功能性膜Ig合成后才终止。某些情况下，有的杂交瘤甚至可能是多个B细胞与骨髓瘤细胞的融合，从而可能导致产生不止一条典型的重链或轻链表达，仅通过序列分析不能区分功能性与非功能性，而必须借助抗原结合功能检测。此外，Krebber等[11]发现由不同杂交瘤所产生的一些异常mRNA似乎有其特异性，在发表过的文献或任何序列数据库中都找不到。可见从杂交瘤细胞中克隆抗体可变区基因有其复杂性和一定的难度，以至于在本实验中就出现了克隆到一387bp未知DNA片段的情况。
作者简介 第一作者：女，28岁，硕士，助教-4, 百拇医药
参考文献-4, 百拇医药
1 谢佩蓉，王雪峰，朱锡华，等.分泌抗人C1q单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立.单克隆抗体通讯，1985，4(13)：13-4, 百拇医药
2 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method RNA isolation by acid guanidinium thiocynate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem，1987，162：156-4, 百拇医药
3 Orlandi R，Gussow DH，Jones PT，et al.Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：3833-4, 百拇医药
4 萨姆布鲁克丁，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，黎孟枫，等译.北京：科学出版社.1992.322～323-4, 百拇医药
5 Kaluza B，Betzl G，Shao H，et al.A general method for chimerization of monoclonal antibodies by inverse polymerase chain reaction which conserves authentic N-terminal sequences.Gene，1992，122：321-4, 百拇医药
6 Kutemeier G，Harloff C，Mocikat R.Rapid isolation of immunoglobulin variable genes from cell lysates of rat hybridomas by polymerase chain reaction.Hybridoma，1992，11(1)：23-4, 百拇医药
7 Lingxun Duan，Roger J，Pomerantz.Elimination of endogenous aberrant kappa chain transcripts from sp2/0-derived hybridoma cells by specific ribozyme cleavage：utility in genetic therapy of HIV-1 infectionsa.Nucleic Acids Research，1994，22(24)：5433
8 Ostermeier C，Michel H.Improved cloning of antibody variable regions from hybridomas by an antisense-directed RNAse H digestion of the P3-X63-Ag8.653 derived pseudogene mRNA.Nucleic Acids Res，1996，24：19795?, 百拇医药
9 William L，Carroll，Eileen Mendel，et al.Hybridoma fusion cell lines contain an aberrant kappa transcript.Molecular Immunology，1988，25(10)：9915?, 百拇医药
10 Walfield A，Storb U，Selsing E，et al.Comparison of different rearranged immunoglobulin kappa genes of a myeloma by electronmicroscopy and restriction mapping of cloned DNA：implications for “allelic exclusion”.Nucleic Acids Res，1980，8(20)：46895?, 百拇医药
11 Krebber A，Bornhauser S，Burmester J，et al.Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.Journal of immunological method，1997，201：355?, 百拇医药
(1998-10-22收稿；1999-01-15修回)(王 晴 朱锡华)
单位：第三军医大学免疫学教研室，中国人民解放军免疫学研究所 重庆 400038f$sh, 百拇医药
关键词：杂交瘤细胞；抗人C1qMcAb；克隆；核苷酸序列分析f$sh, 百拇医药
免疫学杂志990211 摘 要 使用一对IgVH通用引物，应用RT-PCR技术，从分泌抗人C1q McAb的B6杂交瘤细胞株总RNA扩增出一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。但检索结果表明，它与鼠的多种基因及鼠、人Ig超家族的某些基因序列有一些相似性。对来自鼠杂交瘤细胞的未知DNA片段的克隆与分析，将为以后的基因工程抗体方面的研究提供一些线索。f$sh, 百拇医药
中图号 R392.1f$sh, 百拇医药
CLONING AND ANALYSIS OF AN UNKNOWN DNAf$sh, 百拇医药
FRAGMENT FROM HYBRIDOMA CELLf$sh, 百拇医药
SECRETING McAb AGAINST HUMAN C1qf$sh, 百拇医药
Wang Qing，Zhu Xihuaf$sh, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038)f$sh, 百拇医药
Abstract Utilizing standard RT-PCR with a pair of primers derived from framework 1 and framework 4 consensus sequences of immunoglobulin heavy chain variable domains，we amplified a 390bp±DNA fragment from the total cellular RNA of hybridoma cell B6 secreting specific McAb against human C1q.The PCR fragment was then directionally inserted into the vector pGEM-11Zf(-).Nucleic acid sequence was determined by DNA sequencing and characterized by computer-aided sequence homology analysis.The results showed that：(i)The DNA fragment consists of 387 nucleotides.(ii)It is not identical or significantly similar(homologous)to any of the published sequences，but it is very close to many mouse genes and some Ig superfamily genes of human and mouse.The cloning of the unknown 387bp fragment from mouse hybridoma cell will give some help for the later gene engineering antibody research market.
Key words Hybridoma，C1q，McAb，Cloning，Sequence analysisp9., 百拇医药
本研究利用PCR技术，选取本室制备的分泌抗人C1q McAb的B6杂交瘤细胞株进行可变区(Ⅴ区)基因的克隆、测序，为探讨Ⅴ基因的作用及进一步研制抗人C1q小抗体提供有益的指导。结果利用合成的一对IgVH通用引物，从抗人C1qB6杂交瘤细胞总RNA经RT-PCR扩增得到一387bp的DNA片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。现将实验过程及结果披露如下，并对该未知DNA片段进行初步分析与讨论。p9., 百拇医药
1 材料和方法p9., 百拇医药
1.1 材料p9., 百拇医药
1.1.1 细胞株、质粒及菌种：鼠杂交瘤细胞株B6，分泌抗人C1q McAb(IgG1)，由本室制备及保存[1]。质粒pGEM-11Zf(-)、大肠杆菌JM109由本室保存。p9., 百拇医药
1.1.2 试剂：RNA酶(Promega，美国)，逆转录酶(Gibco BRL，美国)，Taq DNA聚合酶(Promega，美国)，PCR引物(中科院上海细胞所)，低熔点琼脂糖(华美公司)，限制性内切酶EcoR I、Sal I(Promega，美国)，T4 DNA连接酶(Promega，美国)，小量制备质粒试剂盒(Bio-Rad，美国)，DNA测序试剂盒T7 Sequence Kit(Pharmacia，瑞士)。p9., 百拇医药
1.2 方法p9., 百拇医药
1.2.1 复苏及扩增培养B6杂交瘤细胞：按常规方法进行。p9., 百拇医药
1.2.2 提取B6杂交瘤细胞总RNA：参照Chomczynski[2]方法进行。p9., 百拇医药
1.2.3 PCR引物的设计：本实验所用引物是根据Orlandi[3]等设计的通用引物顺序，在5′和3′端分别引入Sal I、EcoR I酶切位点，以利于扩增的DNA片段定向克隆进测序载体。
1.2.4 RT-PCR扩增：首先依反转录cDNA第一链合成Kit合成cDNA第一链，再设定循环参数进行PCR反应：在100μl的反应体系中加入适量逆转录产物(RNA*cDNA)，2μl dNTPs(10mmol)，10μl MgCl2(15mmol)，扩增VH的正、反向引物(26pmol/μl、23pmol/μl)各1μl，10μl10×buffer，95°C变性10min后，加入Taq DNA聚合酶3μl(1u/μl)，而后进行如下循环：93°C变性1min、55°C退火1min、72°C延伸1.5min，33次循环后，72°C继续延伸10min。扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳观察。按分子克隆[4]的方法，用低熔点琼脂糖(LMA)凝胶挖块回收法回收PCR扩增片段。n, http://www.100md.com
1.2.5 PCR产物克隆进pGEM-11Zf(-)：克隆策略见图1，经氨苄抗性、α-互补颜色筛选法初筛重组子，EcoR I、Sal I双酶切和PCR扩增法进一步鉴定。
n, http://www.100md.com图 1 PCR扩增片段克隆进pGEM-11Zf(-)质粒载体n, http://www.100md.com
Fig 1 Cloning of PCR product into plasmid pGEM-11Zf(-)n, http://www.100md.com
1.2.6 DNA序列测定及分析：以小量制备质粒试剂盒制备重组子模板，用Sanger的双脱氧链终止法，以pUC/M13正向引物、VHback引物分别从二头对PCR扩增片段进行手工序列测定。通过计算机网络系统，借助BLASTX、TBLASTN、TBLASTX、FASTA等程序对获得的DNA片段进行GenBank、EMBL、DDBJ、PPB等序列数据库的类似性检索。n, http://www.100md.com
2 结果n, http://www.100md.com
2.1 杂交瘤细胞总RNA的提取、鉴定 图2示不同批次提取的细胞总RNA，清晰可见其内对照标准28S、18S、5S三条带和位于18S附近呈云雾状的mRNA，说明所提细胞总RNA是完整的。
图 2 杂交瘤细胞总RNA9, 百拇医药
Fig 2 Total RNA of B6 hybridoma cell9, 百拇医药
Lane 1：5SRNA Marker Lane 2～4：Total RNA of B6 hybridoma cell from different batches9, 百拇医药
2.2 RT-PCR 经PT-PCR扩增产生一条390bp±的DNA片段，但可见非特异性连续梯度带的出现，见图3。
9, 百拇医药图 3 RT-PCR扩增产物电泳图谱9, 百拇医药
Fig 3 2% agarose gel electrophoresis of the PCR pro-ducts9, 百拇医药
Lane 1：390bp±band with non-specific continous bands；9, 百拇医药
Lane 2：DNA small molecular weight marker(bp)：9, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/1109, 百拇医药
2.3 重组子的筛选与鉴定 在转化平皿上，挑取氨苄抗性白色菌落，扩增后小量快速抽提质粒，以EcoR I单酶切后，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察到有DNA滞后带，说明可能是因插入外源DNA而成为分子量增大的重组子。对可疑阳性重组子进行EcoR I、Sal I双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳可见切下390bp±的小片段DNA(见图4)。挑取阳性重组子作PCR扩增，获得390bp±的DNA片段(见图5)。
9, 百拇医药图 4 可疑阳性重组子双酶切电泳图谱9, 百拇医药
Fig 4 2% agarose gel electrophoresis of recombinant DNA digested by EcoR I and sal I
Lane 1，2，4，5：390bp±bandg@x, 百拇医药
Lane 3：DNA Small molecular weight marker(bp)：g@x, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/110
g@x, 百拇医药图 5 阳性重组子PCR扩增产物电泳图谱g@x, 百拇医药
Fig 5 2% agarose gel electrophoresis pattern of recombinant DNA after PCRg@x, 百拇医药
Lane 1，2，4，5：390bp±bandg@x, 百拇医药
Lane 3：DNA Small molecular weight marker(bp)：g@x, 百拇医药
501/498，404，331，242，190，147，111/110g@x, 百拇医药
2.4 PCR扩增片段序列测定 PCR扩增片段序列测定结果表明，该DNA片段的长度为387bp(见图6、图7)。
g@x, 百拇医药图 6 DNA序列的放射自显影图g@x, 百拇医药
Fig 6 Autoradiograph of the insert containing clones
g@x, 百拇医药图 7 PCR扩增片段序列g@x, 百拇医药
Fig 7 Nucleotide sequence of 387bp DNA fragmentg@x, 百拇医药
3 讨论g@x, 百拇医药
本实验以一对IgVH通用引物，在从抗人C1q B6杂交瘤细胞株克隆VH基因的过程中，得到一长为387bp的DNA片段。其长度与预测的VH长度相近。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似(同源)的序列。但检索结果表明，它与鼠的多种基因及鼠、人IgVH、TCR β链等Ig超家族某些基因的一小段序列(短序列，几十个碱基到上百个碱基不等)有62%～95%的相同率，说明该未知DNA片段与鼠的基因及鼠、人Ig超家族的某些基因序列有一些相似性。对该来自鼠杂交瘤细胞的未知DNA片段的获得，考虑有以下两个方面的原因：
3.1 PCR自身局限性导致的假阳性结果 PCR技术是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。它只需设计一对特异性引物，通过模板的变性、引物与模板的退火和延伸三步骤的循环反应，便可在数小时内将目的基因扩增百万倍，从而极大地减轻了实验室的工作强度。对整个PCR扩增体系，引物设计是最为关键的问题。本实验所用的一对通用引物分别与FR1、FR4互补，并引入了限制性内切酶位点EcoR I、Sal I。引物VHback 28bp，G+C含量64%；VH for 31bp，G+C含量55%，基本符合PCR反应所要求的引物设计原则。0'8du.{, http://www.100md.com
尽管PCR给人们提供了诸多便利，但仍存在自身局限性。PCR的强大扩增能力和极高的检测灵敏度可导致假阳性结果，且在扩增过程中单核苷酸掺入的忠实性并非100%，因此该技术最大的缺憾就在于灵敏度过高和非特异扩增所带来的假阳性结果。要提高PCR反应的特异性，可采取适当提高引物与模板的退火温度、降低引物浓度、缩短延伸反应的时间、保持最适的Mg++浓度等措施。本实验在采取上述措施后，PCR产物经电泳分析仍可见非特异性连续梯度带。任何事物都具有两面性，也许正是由于PCR固有的缺陷，方为本研究克隆到一未知DNA片段提供了可能。0'8du.{, http://www.100md.com
3.2 杂交瘤细胞自身的复杂性 杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合而成。据文献报道[5～7]，当从杂交瘤细胞克隆抗体VH或VL时，用抗体可变区特异性引物常扩增得到一些异常序列，它们来自杂交瘤细胞中的异常mRNA。这些异常mRNA有时可能会大大超过正常的抗体mRNA，影响了RT-PCR克隆的效率，使得正常轻、重链的扩增效率很低，甚至只能得到异常的序列。通常情况下，这些异常序列可能实际上成为PCR扩增的阻抑子[8]。Carroll等[9]认为对这些异常mRNA转录程度的控制可能依赖一条独立的染色体，而该染色体在细胞融合过程中丢失，从而使得异常mRNA过度表达。从杂交瘤细胞中得到的这些异常序列的来源常可追寻至用作融合的骨髓瘤细胞系MOPC21，实验证实它们来自MOPC21非功能性基因，经过RNA转录、进一步剪切为成熟的mRNA[10]。这些异常mRNA在VJ重组位点异常重排，导致移码突变或终止密码子出现，使其不能翻译为有功能的蛋白质。有些异常mRNA的来源不能追寻至用作细胞融合的骨髓瘤细胞，而可能来自参与杂交瘤融合的抗原刺激的正常B淋巴细胞的第二个等位基因的错误重排，这种错排直到功能性膜Ig合成后才终止。某些情况下，有的杂交瘤甚至可能是多个B细胞与骨髓瘤细胞的融合，从而可能导致产生不止一条典型的重链或轻链表达，仅通过序列分析不能区分功能性与非功能性，而必须借助抗原结合功能检测。此外，Krebber等[11]发现由不同杂交瘤所产生的一些异常mRNA似乎有其特异性，在发表过的文献或任何序列数据库中都找不到。可见从杂交瘤细胞中克隆抗体可变区基因有其复杂性和一定的难度，以至于在本实验中就出现了克隆到一387bp未知DNA片段的情况。
作者简介 第一作者：女，28岁，硕士，助教-4, 百拇医药
参考文献-4, 百拇医药
1 谢佩蓉，王雪峰，朱锡华，等.分泌抗人C1q单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立.单克隆抗体通讯，1985，4(13)：13-4, 百拇医药
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(1998-10-22收稿；1999-01-15修回)(王 晴 朱锡华)