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编号:10279014
血小板生成素糖基化与其体内生物学活性关系的研究*
http://www.100md.com 《免疫学杂志》1999年第2期
     作者:刘 丽 王 颖 田生礼 芦兴武 孟 岩 刘立忠 谢宝树 冷爱军j&vl, 百拇医药

    单位:刘 丽、王 颖、孟 岩、刘立忠、谢宝树、冷爱军(空军总医院临床分子生物研究中心 北京 100036);田生礼、 芦兴武( 东北师范大学细胞与遗传研究所 长春 130024)j&vl, 百拇医药

    关键词:血小板生成素;糖基化;生物学活性j&vl, 百拇医药

    免疫学杂志990210 摘 要 为探讨血小板生成素(TPO)糖基化与其体内生物学活性的关系,给血小板缺乏症小鼠模型腹腔分别注射相同活性单位酵母系统表达的人TPO成熟肽或大肠杆菌表达的人TPO N-端结构域蛋白,连续给药5d,每天一次,末次给药后3d,比较两种TPO组动物外周血血小板数量、骨髓巨核细胞培养单位(CFU-Meg)、骨髓有核细胞DNA含量。结果高、中、低剂量的TPO成熟肽组动物的血小板数、巨核细胞集落数和骨髓DNA含量均明显高于TPO N-端结构域蛋白的相应组(P<0.01)。显示酵母系统表达的TPO成熟肽比大肠杆菌表达的TPO N-端结构域有明显的生物学活性,这可能与它们的糖基化程度及半衰期有关。j&vl, 百拇医药

    中图号 Q78j&vl, 百拇医药

    STUDIES ON RELATIONS OF THROMBOPOIETINj&vl, 百拇医药

    GLYCOSYLATION AND ITS BIOLOGICAL EFFECTS IN VIVOj&vl, 百拇医药

    Liu Li,Wang Ying,Tian Shengli,Lu Xingwu,Meng Yan,Liu Lizhong,Xie Baoshu,Leng Aijunj&vl, 百拇医药

    (Research Center of Molecular Biology of Air Force General Hospital,Beijing 100036)j&vl, 百拇医药

    Abstract To investigate the relation of thrombopoietin(TPO)glycosylation and its biological effects in vivo,human TPO mature peptide expressed by Piochia Pastoris or TPO N-terminal domain protein expressed by E.coli were injected into thrombocytopenia mice with the same activity unit in 5 days by intraperitoneal injection once for a day.On fourth day after last injection,peripheral platelet number,CFU-Meg and DNA content in bone marrow cells were compared in two kinds of TPO.The results showed that platelet number,CFU-Meg and DAN content in TPO mature peptide were remarkably higher than that of APO N-terminal domain protein in different dosage groups.TPO mature peptide expressed by Pichia Pastoris has significantly higher biological activity than that of TPO N-terminal domain protein expressed by E.coli.It may be related to their glycosylation degree and half-life.

    Key words Thrombopoietin,Glycosylation,Biological activityte[t, 百拇医药

    血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又称巨核细胞发育形成因子(Megakaryocyte growth and development factor,MGDF)或mpl配基(Mpl Li-gand,ML),是1958年从血小板缺乏症动物的血浆中发现的一种特异地作用于巨核细胞增殖、分化及血小板生成的细胞因子。由于多种因素使TPO研究工作在近半个世纪里进展不大。90年代发现c-mpl原癌基因(c-myeloproliferative leukemia)是强有力的促巨核细胞生成调节物的受体,以c-mpl cDNA为依据,利用亲合层析法,成功地纯化出有活性的mpl配体蛋白,并根据其末端氨基酸序列合成寡核苷酸引物,利用PCR方法从人胎肝cDNA文库中筛选出ML cDNA,即人们一直寻找的TPO cDNA,至此TPO的研究工作才有了突破性进展。te[t, 百拇医药

    已有研究表明,TPO的糖基化不影响它的体外生物学活性[1~3],但与体内生物学活性及半衰期的关系如何,目前尚不十分清楚。本文通过在血小板缺乏症小鼠体内对巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人TPO成熟肽和大肠杆菌表达的人TPO N-端结构域的生物学活性比较,初步探讨了TPO糖基化与其体内生物学活性的关系。te[t, 百拇医药

    1 材料与方法te[t, 百拇医药

    1.1 培养基和试剂 DEME培养基,美国产品;胎牛血清,购自北京经科化学试剂公司;碘化乙酰胆碱,美国产品,购自邦定生物工程公司。其它试剂均为国产或进口分析纯。te[t, 百拇医药

    1.2 动物 C57小鼠,体重88~22g,雌雄各半,购自军事医学科学院动物中心。te[t, 百拇医药

    1.3 蛋白 TPO成熟肽:巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中的332个氨基酸的人TPO成熟肽[4](TPO332)。TPO N-端结构域蛋白(TPO153):是将编码人TPO成熟肽N-端152个氨基酸的cDNA与pREST(B)原核表达载体重组,重组质粒在E.coli DE3宿主菌中经IPTG诱导表达的人TPO N-端结构域1~153个氨基酸,由本课题组研制。te[t, 百拇医药

    1.4 分组及给药方法 两种TPO蛋白均设高、中、低剂量组,每组6只动物,雌雄各半,同一剂量组两种TPO给药的活性单位数相同。高、中、低剂量组一次给TPO蛋白剂量分别为3×104、2×104、1×104U/kg体重。腹腔注射TPO 5d,于第3d给TPO的同时腹腔注射100mg/kg环磷酰胺。同时设环磷酰胺对照组,与实验组相同时间仅给环磷酰胺,其它时间给同样体积的生理盐水

    1.5 骨髓DNA测定 取一侧完整股骨,除干净软组织,用0.005mol CaCl2(0.005mol CaCl2∶称取无水CaCl2 0.555g,加水至1 000ml)10ml将全部骨髓冲入离心管中,置4°C冰箱30min,2 500r/min离心15min,弃上清;将沉淀加入0.2N HCIO4;[0.2N HCIO4∶取HCIO4(70%~72%)17.7ml加水至1 000ml]5ml充分混匀,90°C加热15min,冷却,过滤;滤液用紫外分光光度计268nm测定紫外吸收OD值。4p8e, 百拇医药

    1.6 骨髓巨核细胞培养 用含2%胎牛血清的DMEM培养基2ml通过6号针头洗出同一组同一性别的3只动物的骨髓细胞(混合在一起),离心弃上清后用同样培养基调细胞浓度为2×106个细胞/ml。取1ml细胞混悬液与3ml 0.8%甲基纤维素半固体培养基(含20%胎牛血清和10-4M巯基乙醇)混合。取2块消毒后的小平皿,各加该混合物2ml,37°C,5%CO2培养7d,通过显示小鼠巨核细胞特有的乙酰胆碱酯酶识别巨核细胞,显微镜下计数细胞的集落形成单位。4p8e, 百拇医药

    2 结果4p8e, 百拇医药

    2.1 促进血小板生成作用的比较 分别取以高、中、低剂量腹腔注射rhTPO332和rhTPO153蛋白5d后血小板缺乏症小鼠外周血,在相差显微镜下计数血小板,两种TPO相应剂量组血小板数经统计学处理,结果rhTPO332各剂量组的血小板数均明显高于rhTPO153各相应剂量组(P<0.01),见表1。4p8e, 百拇医药

    表1 两种TPO蛋白在小鼠体内促进血小板生成作用的比较4p8e, 百拇医药

    Tab 1 Effect of two kinds of rhTPO protein on platelets of mice in vivo Groups4p8e, 百拇医药

    Doses/kg4p8e, 百拇医药

    Platelets(±s)4p8e, 百拇医药

    (×109/L)

    Salinek%@3, 百拇医药

    0.2mlk%@3, 百拇医药

    436±79k%@3, 百拇医药

    Cyclophosphanek%@3, 百拇医药

    100mgk%@3, 百拇医药

    264±76k%@3, 百拇医药

    rhTPO332k%@3, 百拇医药

    3×104Uk%@3, 百拇医药

    799±54k%@3, 百拇医药

    2×104Uk%@3, 百拇医药

    589±74k%@3, 百拇医药

    1×104Uk%@3, 百拇医药

    461±76k%@3, 百拇医药

    rhTPO153k%@3, 百拇医药

    3×104Uk%@3, 百拇医药

    586±80*k%@3, 百拇医药

    2×104Uk%@3, 百拇医药

    492±94*k%@3, 百拇医药

    1×104Uk%@3, 百拇医药

    334±106*k%@3, 百拇医药

    *P<0.01 Compard with Cyclophosphane groupk%@3, 百拇医药

    P<0.01 Compared of rhTPO332 with rhTPO153k%@3, 百拇医药

    2.2 骨髓巨核系细胞生成单位的比较 为了比较两种TPO蛋白刺激骨髓巨核系细胞生成单位的作用,给药后两种TPO蛋白的高、中、低剂量组各取性别一致的3只动物,取骨髓细胞,按上述方法进行骨髓细胞培养,用乙酰胆碱酯酶染色巨核细胞,显微镜下计数细胞的集落形成单位。结果表明,人TPO成熟肽各剂量组刺激小鼠骨髓细胞形成CFU-Meg的活性均明显高于TPO N-端结构域相应剂量组(P<0.01),见表2。

    表2 两种TPO对小鼠骨髓巨核系细胞生成单位的影响], http://www.100md.com

    Tab 2 Effect of two kinds of rhTPO protein on stimulation of murine CFU-Meg Groups], http://www.100md.com

    Doses/kg], http://www.100md.com

    CFU-Meg/105 cells], http://www.100md.com

    (±s)], http://www.100md.com

    Saline], http://www.100md.com

    0.2ml], http://www.100md.com

    0], http://www.100md.com

    Cyclophosphane], http://www.100md.com

    100mg], http://www.100md.com

    0], http://www.100md.com

    rhTPO332], http://www.100md.com

    3×104U], http://www.100md.com

    19.8±1.2], http://www.100md.com

    2×104U], http://www.100md.com

    18.2±1.2], http://www.100md.com

    1×104U], http://www.100md.com

    16.3±0.8], http://www.100md.com

    rhTPO153], http://www.100md.com

    3×104U], http://www.100md.com

    14.1±1.3], http://www.100md.com

    2×104U], http://www.100md.com

    11.2±0.9

    1×104U[0am, http://www.100md.com

    8.6±1.7[0am, http://www.100md.com

    P<0.01 Comparison of rhTPO332 with rhTPO153[0am, http://www.100md.com

    2.3 骨髓有核细胞DNA含量的比较 骨髓DNA含量与骨髓有核细胞总数密切相关,实验误差小,方法简便,故可用此方法代替骨髓有核细胞计数。分别取两种TPO蛋白,各实验组给药后动物的一侧完整股骨的全部骨髓,按方法中所述处理,测定268nm处的紫外吸收值,同时作阴性对照和环磷酰胺对照组。结果rhTPO332蛋白各组的DNA含量均高于rhTPO153组,各实验组DNA含量均比环磷酰胺对照组高(P<0.01),见图1。[0am, http://www.100md.com

    图1 rhTPO332和rhTPO153对骨髓有核细胞DNA含量的影响[0am, http://www.100md.com

    Fig 1 The effects of rhTPO332 and rhTPO153 on DNA content in bone marrow cells[0am, http://www.100md.com

    3 讨论[0am, http://www.100md.com

    人TPO分子由21个氨基酸的信号肽和两个结构域共353个氨基酸组成,分成两个功能区,即N-端功能区有153个氨基酸,C-端功能区有179个氨基酸。TPO的N-端氨基酸顺序不同的动物间高度保守,人与鼠和人与猪同源性均在80%以上,小鼠和大鼠间有96%的同源性,N-端氨基酸顺序与EPO同源性23%。TPO分子中6个潜在的N-糖基化位点全部在C端功能区。De Sauvage等证明,TPO蛋白N-端153个氨基酸残基和TPO受体Mpl结合并刺激Mpl与TPO全长分子具有相似的活性;Foster等证明,TPO蛋白N-端195个氨基酸残基与其全长分子对诱导来自人CD34+细胞的巨核细胞形成亦有相似的活性;Bartley和Kaushansky等也得出了相似的结果。表明TPO的糖基化不影响它的体外生物学活性,但与体内生物学活性及半衰期的关系如何目前尚不清楚。[0am, http://www.100md.com

    巴氏毕赤酵母表达系统是一种甲醇营养型酵母表达系统。它与传统的酿酒酵母相比,具有产量高、分泌表达、不过度糖基化等优点[5]。非糖基化的rhTPO分子量约为37kD,Gurney等在人胚肾细胞系293中表达的TPO分子量为6885kD[6]。本文在酵母系统表达的TPO蛋白分子量约为66kDa。

    血小板系统包括造血组织中的巨核细胞和外周血中的血小板。血小板是由成熟的、带有多核的巨核细胞衍化而来的。骨髓中巨核细胞数量的多少直接关系到外周血中血小板生成的数量。故本研究在血小板缺乏症小鼠体内,从血小板数量、巨核细胞集落数和骨髓DNA含量3个方面比较了酵母系统表达的人TPO成熟肽和大肠杆菌表达的人TPO N-端结构域蛋白的生物学活性。结果显示:TPO成熟肽的生物学作用明显比TPO N-端结构域蛋白强。u, 百拇医药

    从本文研究结果推测,造成这两种TPO蛋白体内生物学活性差异的原因,很可能与它们的糖基化程度及半衰期有关。这两种TPO蛋白半衰期的研究比较,本课题组正在进行之中。这些将为TPO的基础研究和应用研究奠定基础。u, 百拇医药

    * 国家自然科学基金资助项目(39870881)u, 百拇医药

    作者简介 第一作者:女,42岁,博士,研究员u, 百拇医药

    参考文献u, 百拇医药

    1 De Sauvage FJ,Hass PE,Spencer SD,et al.Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.Nature,1994,369:533u, 百拇医药

    2 Lok S,Kaushansky K,Holly RD,et al.Cloning and expression of murine thrombopoietin cDNA and stimulation of platelet production in vivo.Nature,1994,369:565u, 百拇医药

    3 Kaushansky K,Lok S,Holly RD,et al.Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thromobopoietin.Nature,1994,369:568u, 百拇医药

    4 田生礼,刘 丽,芦兴武,等.人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析,中国生物化学与分子生物学报,1998,14(4):6u, 百拇医药

    5 Cregg JM,Vedvick TS,Raschke WC.Recent advances in the expression of foreign gene in Pichia pastoris.Bio Technology,1993,11:905u, 百拇医药

    6 Gurney AL,Kuang WJ,Xin MH,et al.Genomic structure,chromosomal localization,and conserved alternative splice forms of thrombopoietin.Blood,1995,85:981u, 百拇医药

    (1998-06-16收稿;1998-09-23修回)(刘 丽 王 颖 田生礼 芦兴武 孟 岩 刘立忠 谢宝树 冷爱军)