从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体*
作者：王 琰 刘群英 化 冰 陈宇萍 朱迎春 陈晓穗g%ti, 百拇医药
单位：解放军海军总医院 北京 100037g%ti, 百拇医药
关键词：噬菌体抗体库 TNF-α 人单链抗体g%ti, 百拇医药
免疫学杂志990204摘 要 通过噬菌体抗体库技术，不经免疫克隆抗TNF-α人单链抗体，用固相化的人重组TNF-α抗原对半合成噬菌体抗体库进行了4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，可见到明显富集，从第3轮和第4轮洗脱下来的克隆中获得两株可特异结合TNF-α的克隆，其可变区分别属于VH1、VH3和Vλ1亚群。g%ti, 百拇医药
中图号 R371-33g%ti, 百拇医药
CLONING OF HUMAN ScFv AGAINST TNF-α FROM Ag%ti, 百拇医药
SEMI-SYNTHETIC PHAGE ANTIBODY LIBRARYg%ti, 百拇医药
Wang Yan，Liu Qunying，Hua Bing，Chen Yuping，Zhu Yingchun，Chen Xiaosuig%ti, 百拇医药
(Navy General Hospital， Beijing 100037)g%ti, 百拇医药
Abstract Anti-TNF-α antibody has potential uses as a therapeutic reagent.A human semi-synthetic phage antibody library was used to clone anti-TNF α ScFvs by-passing immunization.During the four rounds of panning against TNF-α the enrichment of the eluted phage particles was observed.Screening of the clones obtained after the third and fourth round panning yielded two clones that could bind to TNF-α specifically.
Key words Phage antibody library， TNF-α， Human ScFvqa'r, 百拇医药
噬菌体抗体库技术的发展使单克隆抗体的制备发生了根本改观，尤其通过该技术可不经免疫制备抗体[1]，促进了人单抗技术的发展。本文报道用半合成抗体库尝试不经免疫克隆抗TNF-α的人单链抗体。qa'r, 百拇医药
1 材料和方法qa'r, 百拇医药
1.1 实验材料 半合成噬菌体抗体库来自英国MRC中心，在Griffiths的Fab半合成噬菌体抗体库[2]的基础上改建成为单链抗体(ScFv)半合成噬菌体抗体库。人重组TNF-α为军科院沈倍奋教授所赠。9E10单抗为本室保存，HRP-抗M13购自Pharmacia， HRP-羊抗小鼠IgG购自Sigma。大肠杆菌TG-1及辅助病毒VCSM13为本室保存，无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151来自英国MRC中心。用于检测ScFv基因完整性的PCR引物为：5′引物CAGTCCATATGAAATACCTATTGCCTAC；3′引物TCATTCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTT。它们分别与ScFv基因两侧的序列互补。qa'r, 百拇医药
1.2 抗体库的筛选 重组TNF-α以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释到50μg/ml，取1ml包被Immunetube(丹麦NUNC公司)，4°C过夜，次日以3%BSA封闭后加入1ml噬菌体抗体库液(约1013cfu)，37°C孵育2h后以0.05% Tween 20-PBS洗涤20次，加入1ml 0.1mol/L三乙胺室温10min进行洗脱，然后加入0.5ml 1mol/L pH7.4 Tris-HCl中和，取0.75ml感染10ml新鲜培养的TG1菌，37°C30min，取少许铺盘测定回收率，其余细菌全部铺于含1%葡萄糖的Amp-2TY琼脂盘，30°C培养过夜，次日将盘上菌落刮下取1/100接种50ml Amp-2TY中，生长至A600≈0.5时加入辅助病毒，30°C培养过夜，次日收集上清制备次级库进行下一轮筛选。qa'r, 百拇医药
1.3 噬菌体抗体的制备 挑取单个含有噬菌体抗体表达载体的TG1菌落，接种到2ml Amp-2TY中，37°C培养过夜，吸取30μl过夜菌液转种到2ml Amp-2TY中，37°C培养1h后加入30μl辅助病毒，30°C培养过夜，离心收取上清。
1.4 可溶性ScFv的制备 用含有噬菌体抗体的上清感染新鲜培养的HB2151，辅Amp-2TY盘，37°C培养过夜，挑取单个菌落，接种到2mlAmp-2TY中，培养至A600≈0.3左右时加IPTG至1mmol/L，30°C培养过夜，离心收取上清。2m5, http://www.100md.com
1.5 ELISA2m5, http://www.100md.com
1.5.1 测定噬菌体抗体：TNF-α以1μg/ml包被ELISA板，50μl/孔，1%BSA封闭后加入经等量1%BSA稀释的待测噬菌体抗体液，孵育洗涤后以HRP-抗M13着染，OPD底物显色，测A490。2m5, http://www.100md.com
1.5.2 检测ScFv：同上包被ELISA板，1%BSA封闭后加入待测上清，孵育洗涤后加入9E10单抗，再孵育洗涤后以HRP-羊抗鼠IgG着染，OPD底物显色，测定A490。2m5, http://www.100md.com
1.6 DNA指纹测定 选用适当的5′和3′端引物扩增待测的ScFv基因，将所扩增的约700bp的DNA经电泳及电洗脱纯化后以识别4个碱基的限制性内切酶HaeⅢ消化，用4%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，比较其带型以推测其是否为相同的基因。2m5, http://www.100md.com
1.7 DNA序列测定 使用GIBCO-BRL公司双链DNA循环测序系统或Pharmacia的T7测序套盒，按产品说明书操作测定DNA序列。2m5, http://www.100md.com
2 结果2m5, http://www.100md.com
2.1 半合成抗体库的筛选 将半合成抗体库对固相化的TNF-α进行了4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，测定每轮吸附前抗体库滴度和洗脱回收的滴度，计算回收率，发现回收率逐轮增高，显示噬菌体抗体的富集(见表1)。2m5, http://www.100md.com
表 1 筛选过程中噬菌体抗体的富集及与Ag结合的测定2m5, http://www.100md.com
Tab 1 Enrichment of phage antibodies and binding to Ag during panning Round of panning2m5, http://www.100md.com
Imput(cfu)2m5, http://www.100md.com
Elute(cfu)g8t, 百拇医药
Yieldg8t, 百拇医药
Binding to TNF(A490)△g8t, 百拇医药
1g8t, 百拇医药
1.5×1013g8t, 百拇医药
4.4×106g8t, 百拇医药
2.9×10-7g8t, 百拇医药
1.00±0.02g8t, 百拇医药
2g8t, 百拇医药
4.9×1013g8t, 百拇医药
3.4×107g8t, 百拇医药
6.9×10-7g8t, 百拇医药
1.05±0.03g8t, 百拇医药
3g8t, 百拇医药
2.9×1013g8t, 百拇医药
8.0×108g8t, 百拇医药
2.9×10-5g8t, 百拇医药
1.21±0.07g8t, 百拇医药
4g8t, 百拇医药
1.2×1013g8t, 百拇医药
4.4×108g8t, 百拇医药
3.7×10-5g8t, 百拇医药
1.68±0.03g8t, 百拇医药
△：A490 for original library was 0.34±0.03， for helper phage was 0.08±0.01
将原库和每轮洗脱回收后扩增的库用ELISA检测与TNF-α的结合，发现A值呈上升趋势(见表1)，提示特异性富集。-;|, http://www.100md.com
2.2 所获克隆鉴定 挑取第3轮和第4轮所获单克隆集落制备噬菌体抗体进行如下方面检测：共选取了145个克隆，先用ELISA测定其与TNF-α的结合，共得到61个阳性克隆；再用HBsAg、人IgG、胃蛋白酶等无关的抗原检查其特异性，有29个克隆特异性结合TNF-α；然后用单链抗体基因3′端和5′端的引物通过PCR法检测是否含有完整的ScFv基因，发现有24个克隆含有完整的ScFv基因，而有5个克隆仅含有一个V基因；进一步用HB2151菌株表达可溶性ScFv，检测其与TNF-α的结合，有10个克隆不能表达可与TNF-α结合的可溶性ScFv；最后检测DNA指纹发现最后筛出的14个克隆只有2种DNA指纹图谱，提示只获得了2个可特异结合TNF-α的ScFv基因。表2为最终所获2个克隆与不同抗原的ELISA结果。图1为用HaeⅢ消化的DNA指纹分析的一个例图。可见第1、4、5、6、9、10、11和14道图形一样，第2、3、8道一样。-;|, http://www.100md.com
表 2 所获2个克隆与不同抗原的ELISA结果-;|, http://www.100md.com
Tab 2 ELISA results of the two selected clones against different Ags-;|, http://www.100md.com
TNF-α-;|, http://www.100md.com
HBsAg-;|, http://www.100md.com
Pepsin-;|, http://www.100md.com
HuIgG-;|, http://www.100md.com
Clone 1-;|, http://www.100md.com
0.65±0.02-;|, http://www.100md.com
0.04±0.01-;|, http://www.100md.com
0.10±0.01-;|, http://www.100md.com
0.07±0.01-;|, http://www.100md.com
Clone 2-;|, http://www.100md.com
0.88±0.03-;|, http://www.100md.com
0.13±0.01
0.04±0.01+/], http://www.100md.com
0.08±0.02+/], http://www.100md.com
Control+/], http://www.100md.com
0.06±0.01+/], http://www.100md.com
0.08±0.01+/], http://www.100md.com
0.04±0.01+/], http://www.100md.com
0.07±0.01+/], http://www.100md.com
Control：Helper phages
+/], http://www.100md.com
图 1 DNA指纹分析图示+/], http://www.100md.com
Fig 1 Examples of DNA finger printing+/], http://www.100md.com
2.3 DNA序列测定 将所获2个可特异性结合TNF-α的克隆进行DNA测定(见图2)，发现克隆1的VH属VH3亚群，与人生殖细胞基因组中VH基因段DP-32有98.6%的同源性[3]，其CDR3有6个氨基酸残基，VL为λ链，属VλI亚群，与基因组中Vλ基因段DPL3序列完全相同[4]，其CDR3有11个氨基酸。克隆2的VH属VH5亚群，与生殖细胞基因组中VH基因段DP-73有98.6%的同源性[3]，CDR3有8个氨基酸，Vλ也是λ链，与克隆1的Vλ序列相同，但CDR3有10个氨基酸，其中前7个氨基酸也与克隆1相同。
+/], http://www.100md.com
图2 所获2个克隆的DNA及氨基酸序列+/], http://www.100md.com
Fig 2 DNA and deduced amino acid sequences of the two selected clones Underlined are CDRs.
3 讨论}j&4}, 百拇医药
TNF-α是炎症反应的主要介质，在许多疾病的病理过程中起着重要作用，因此抗TNF-α的抗体对多种疾病可有治疗效果，如：类风湿关节炎[5]、感染及创伤引起的休克[6]、炎症性肠病[7]等等。但获得可用于人体的抗TNF-α人单抗存在着一定难度，噬菌体抗体库技术的发展使不经免疫制备抗体成为可能，无疑也为制备抗TNF-α人单抗提供了一个可能途径，如何有效地绕过免疫用基因工程手段有效地制备人单抗现仍在不断摸索完善之中。半合成抗体库是这一技术中最主要的方法，我们在本研究中成功地克隆出抗TNF-α人ScFv，提示这样方法的可行性。在对半合成抗体库的筛选过程中我们发现所获克隆中有非特异结合倾向的克隆较多，而且在这些克隆中大部分只含有一个V基因，可能因缺少另一个V基因，不能组合成Fv而暴露出疏水面增加了“粘性”有关。因此在后来的筛选鉴定过程中，我们先用PCR直接从菌落鉴定有完整ScFv的克隆，再用ELISA检测其结合活性，可简化操作程序。在可结合TNF-α的噬菌体抗体克隆中，当进行可溶性表达后，有一部分丧失了与TNF-α结合的活性，其可能原因是有些克隆不能进行有效的可溶性表达，或有些克隆亲和力较低，当在噬菌体表面表达时因可能存在的多价显示而产生的“螯合”效应及HPR-抗M13的较强的信号放大作用才能测出，关于这一点国外也有类似的报道[8]。经过多种分析鉴定最后得到2株抗TNF-α的克隆，对其基因进行序列分析发现它们VH基因不同而VL同为DPL3 Vλ基因，2个轻链基因的序列仅在CDR3有3～4个氨基酸的差异，克隆1的CDR3较克隆2多一个氨基酸，此序列差异恰是人工引入CDR3的随机化序列部位[2]。}j&4}, 百拇医药
本研究证实利用半合成抗体库可绕过免疫制备TNF-α抗体，但还需进一步分析鉴定，并可能需通过体外亲和力成熟过程改善其性能。}j&4}, 百拇医药
* 国家863计划(863-102-09-02-01)和国家自然科学基金(39670679)资助项目}j&4}, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，53岁，硕士，教授}j&4}, 百拇医药
参考文献}j&4}, 百拇医药
1 Winter G，Griffith AD，Hawkins RE，et al.Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol，1994，12：433
2 Griffiths AD，Williams SC，Hartley O，et al.Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires.EMBO J，1994，13：3245xv@k, http://www.100md.com
3 Tomlinson IM，Walter G，Marks JD，et al.The repertoire of human germline VH segments reveals about fifty groups of VH segments with diferent hypervariable loops.J Mol Biol，1992，277：776xv@k, http://www.100md.com
4 Williams SC，Winter G.Cloning and sequencing of human immunoglobulin V λ gene segments.Eur J Immunol，1993，23：1456xv@k, http://www.100md.com
5 Maini RN，Elliott MJ，Brennan FM，et al.Beneficial effects of TNF-α blockade ib fheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol，1995，101：207xv@k, http://www.100md.com
6 Vincent JL，Bakker J， Marecaux G，et al.Administration of anti-TNF-α antibodiy improve left ventricular function in septic shock patients：result of a pilot study.Chest，1992，101：810xv@k, http://www.100md.com
7 Deventer SJ， Camoglio L.Monoclonal antibody therapy of iflammatory bowel disease. Pharm World Sci，1997，19(2)：55xv@k, http://www.100md.com
8 Pini A，Spreafico A，Botti R，et al.Hierarchical affinity maturation of a phage library derived antibody for selective removal of cytomegalovirus from plasma. J Immunol Methods，1997，206：171182xv@k, http://www.100md.com
(1998-04-15收稿；1998-07-13修回)(王 琰 刘群英 化 冰 陈宇萍 朱迎春 陈晓穗)
单位：解放军海军总医院 北京 100037g%ti, 百拇医药
关键词：噬菌体抗体库 TNF-α 人单链抗体g%ti, 百拇医药
免疫学杂志990204摘 要 通过噬菌体抗体库技术，不经免疫克隆抗TNF-α人单链抗体，用固相化的人重组TNF-α抗原对半合成噬菌体抗体库进行了4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，可见到明显富集，从第3轮和第4轮洗脱下来的克隆中获得两株可特异结合TNF-α的克隆，其可变区分别属于VH1、VH3和Vλ1亚群。g%ti, 百拇医药
中图号 R371-33g%ti, 百拇医药
CLONING OF HUMAN ScFv AGAINST TNF-α FROM Ag%ti, 百拇医药
SEMI-SYNTHETIC PHAGE ANTIBODY LIBRARYg%ti, 百拇医药
Wang Yan，Liu Qunying，Hua Bing，Chen Yuping，Zhu Yingchun，Chen Xiaosuig%ti, 百拇医药
(Navy General Hospital， Beijing 100037)g%ti, 百拇医药
Abstract Anti-TNF-α antibody has potential uses as a therapeutic reagent.A human semi-synthetic phage antibody library was used to clone anti-TNF α ScFvs by-passing immunization.During the four rounds of panning against TNF-α the enrichment of the eluted phage particles was observed.Screening of the clones obtained after the third and fourth round panning yielded two clones that could bind to TNF-α specifically.
Key words Phage antibody library， TNF-α， Human ScFvqa'r, 百拇医药
噬菌体抗体库技术的发展使单克隆抗体的制备发生了根本改观，尤其通过该技术可不经免疫制备抗体[1]，促进了人单抗技术的发展。本文报道用半合成抗体库尝试不经免疫克隆抗TNF-α的人单链抗体。qa'r, 百拇医药
1 材料和方法qa'r, 百拇医药
1.1 实验材料 半合成噬菌体抗体库来自英国MRC中心，在Griffiths的Fab半合成噬菌体抗体库[2]的基础上改建成为单链抗体(ScFv)半合成噬菌体抗体库。人重组TNF-α为军科院沈倍奋教授所赠。9E10单抗为本室保存，HRP-抗M13购自Pharmacia， HRP-羊抗小鼠IgG购自Sigma。大肠杆菌TG-1及辅助病毒VCSM13为本室保存，无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151来自英国MRC中心。用于检测ScFv基因完整性的PCR引物为：5′引物CAGTCCATATGAAATACCTATTGCCTAC；3′引物TCATTCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTT。它们分别与ScFv基因两侧的序列互补。qa'r, 百拇医药
1.2 抗体库的筛选 重组TNF-α以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释到50μg/ml，取1ml包被Immunetube(丹麦NUNC公司)，4°C过夜，次日以3%BSA封闭后加入1ml噬菌体抗体库液(约1013cfu)，37°C孵育2h后以0.05% Tween 20-PBS洗涤20次，加入1ml 0.1mol/L三乙胺室温10min进行洗脱，然后加入0.5ml 1mol/L pH7.4 Tris-HCl中和，取0.75ml感染10ml新鲜培养的TG1菌，37°C30min，取少许铺盘测定回收率，其余细菌全部铺于含1%葡萄糖的Amp-2TY琼脂盘，30°C培养过夜，次日将盘上菌落刮下取1/100接种50ml Amp-2TY中，生长至A600≈0.5时加入辅助病毒，30°C培养过夜，次日收集上清制备次级库进行下一轮筛选。qa'r, 百拇医药
1.3 噬菌体抗体的制备 挑取单个含有噬菌体抗体表达载体的TG1菌落，接种到2ml Amp-2TY中，37°C培养过夜，吸取30μl过夜菌液转种到2ml Amp-2TY中，37°C培养1h后加入30μl辅助病毒，30°C培养过夜，离心收取上清。
1.4 可溶性ScFv的制备 用含有噬菌体抗体的上清感染新鲜培养的HB2151，辅Amp-2TY盘，37°C培养过夜，挑取单个菌落，接种到2mlAmp-2TY中，培养至A600≈0.3左右时加IPTG至1mmol/L，30°C培养过夜，离心收取上清。2m5, http://www.100md.com
1.5 ELISA2m5, http://www.100md.com
1.5.1 测定噬菌体抗体：TNF-α以1μg/ml包被ELISA板，50μl/孔，1%BSA封闭后加入经等量1%BSA稀释的待测噬菌体抗体液，孵育洗涤后以HRP-抗M13着染，OPD底物显色，测A490。2m5, http://www.100md.com
1.5.2 检测ScFv：同上包被ELISA板，1%BSA封闭后加入待测上清，孵育洗涤后加入9E10单抗，再孵育洗涤后以HRP-羊抗鼠IgG着染，OPD底物显色，测定A490。2m5, http://www.100md.com
1.6 DNA指纹测定 选用适当的5′和3′端引物扩增待测的ScFv基因，将所扩增的约700bp的DNA经电泳及电洗脱纯化后以识别4个碱基的限制性内切酶HaeⅢ消化，用4%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，比较其带型以推测其是否为相同的基因。2m5, http://www.100md.com
1.7 DNA序列测定 使用GIBCO-BRL公司双链DNA循环测序系统或Pharmacia的T7测序套盒，按产品说明书操作测定DNA序列。2m5, http://www.100md.com
2 结果2m5, http://www.100md.com
2.1 半合成抗体库的筛选 将半合成抗体库对固相化的TNF-α进行了4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，测定每轮吸附前抗体库滴度和洗脱回收的滴度，计算回收率，发现回收率逐轮增高，显示噬菌体抗体的富集(见表1)。2m5, http://www.100md.com
表 1 筛选过程中噬菌体抗体的富集及与Ag结合的测定2m5, http://www.100md.com
Tab 1 Enrichment of phage antibodies and binding to Ag during panning Round of panning2m5, http://www.100md.com
Imput(cfu)2m5, http://www.100md.com
Elute(cfu)g8t, 百拇医药
Yieldg8t, 百拇医药
Binding to TNF(A490)△g8t, 百拇医药
1g8t, 百拇医药
1.5×1013g8t, 百拇医药
4.4×106g8t, 百拇医药
2.9×10-7g8t, 百拇医药
1.00±0.02g8t, 百拇医药
2g8t, 百拇医药
4.9×1013g8t, 百拇医药
3.4×107g8t, 百拇医药
6.9×10-7g8t, 百拇医药
1.05±0.03g8t, 百拇医药
3g8t, 百拇医药
2.9×1013g8t, 百拇医药
8.0×108g8t, 百拇医药
2.9×10-5g8t, 百拇医药
1.21±0.07g8t, 百拇医药
4g8t, 百拇医药
1.2×1013g8t, 百拇医药
4.4×108g8t, 百拇医药
3.7×10-5g8t, 百拇医药
1.68±0.03g8t, 百拇医药
△：A490 for original library was 0.34±0.03， for helper phage was 0.08±0.01
将原库和每轮洗脱回收后扩增的库用ELISA检测与TNF-α的结合，发现A值呈上升趋势(见表1)，提示特异性富集。-;|, http://www.100md.com
2.2 所获克隆鉴定 挑取第3轮和第4轮所获单克隆集落制备噬菌体抗体进行如下方面检测：共选取了145个克隆，先用ELISA测定其与TNF-α的结合，共得到61个阳性克隆；再用HBsAg、人IgG、胃蛋白酶等无关的抗原检查其特异性，有29个克隆特异性结合TNF-α；然后用单链抗体基因3′端和5′端的引物通过PCR法检测是否含有完整的ScFv基因，发现有24个克隆含有完整的ScFv基因，而有5个克隆仅含有一个V基因；进一步用HB2151菌株表达可溶性ScFv，检测其与TNF-α的结合，有10个克隆不能表达可与TNF-α结合的可溶性ScFv；最后检测DNA指纹发现最后筛出的14个克隆只有2种DNA指纹图谱，提示只获得了2个可特异结合TNF-α的ScFv基因。表2为最终所获2个克隆与不同抗原的ELISA结果。图1为用HaeⅢ消化的DNA指纹分析的一个例图。可见第1、4、5、6、9、10、11和14道图形一样，第2、3、8道一样。-;|, http://www.100md.com
表 2 所获2个克隆与不同抗原的ELISA结果-;|, http://www.100md.com
Tab 2 ELISA results of the two selected clones against different Ags-;|, http://www.100md.com
TNF-α-;|, http://www.100md.com
HBsAg-;|, http://www.100md.com
Pepsin-;|, http://www.100md.com
HuIgG-;|, http://www.100md.com
Clone 1-;|, http://www.100md.com
0.65±0.02-;|, http://www.100md.com
0.04±0.01-;|, http://www.100md.com
0.10±0.01-;|, http://www.100md.com
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Control+/], http://www.100md.com
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Control：Helper phages
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2.3 DNA序列测定 将所获2个可特异性结合TNF-α的克隆进行DNA测定(见图2)，发现克隆1的VH属VH3亚群，与人生殖细胞基因组中VH基因段DP-32有98.6%的同源性[3]，其CDR3有6个氨基酸残基，VL为λ链，属VλI亚群，与基因组中Vλ基因段DPL3序列完全相同[4]，其CDR3有11个氨基酸。克隆2的VH属VH5亚群，与生殖细胞基因组中VH基因段DP-73有98.6%的同源性[3]，CDR3有8个氨基酸，Vλ也是λ链，与克隆1的Vλ序列相同，但CDR3有10个氨基酸，其中前7个氨基酸也与克隆1相同。
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Fig 2 DNA and deduced amino acid sequences of the two selected clones Underlined are CDRs.
3 讨论}j&4}, 百拇医药
TNF-α是炎症反应的主要介质，在许多疾病的病理过程中起着重要作用，因此抗TNF-α的抗体对多种疾病可有治疗效果，如：类风湿关节炎[5]、感染及创伤引起的休克[6]、炎症性肠病[7]等等。但获得可用于人体的抗TNF-α人单抗存在着一定难度，噬菌体抗体库技术的发展使不经免疫制备抗体成为可能，无疑也为制备抗TNF-α人单抗提供了一个可能途径，如何有效地绕过免疫用基因工程手段有效地制备人单抗现仍在不断摸索完善之中。半合成抗体库是这一技术中最主要的方法，我们在本研究中成功地克隆出抗TNF-α人ScFv，提示这样方法的可行性。在对半合成抗体库的筛选过程中我们发现所获克隆中有非特异结合倾向的克隆较多，而且在这些克隆中大部分只含有一个V基因，可能因缺少另一个V基因，不能组合成Fv而暴露出疏水面增加了“粘性”有关。因此在后来的筛选鉴定过程中，我们先用PCR直接从菌落鉴定有完整ScFv的克隆，再用ELISA检测其结合活性，可简化操作程序。在可结合TNF-α的噬菌体抗体克隆中，当进行可溶性表达后，有一部分丧失了与TNF-α结合的活性，其可能原因是有些克隆不能进行有效的可溶性表达，或有些克隆亲和力较低，当在噬菌体表面表达时因可能存在的多价显示而产生的“螯合”效应及HPR-抗M13的较强的信号放大作用才能测出，关于这一点国外也有类似的报道[8]。经过多种分析鉴定最后得到2株抗TNF-α的克隆，对其基因进行序列分析发现它们VH基因不同而VL同为DPL3 Vλ基因，2个轻链基因的序列仅在CDR3有3～4个氨基酸的差异，克隆1的CDR3较克隆2多一个氨基酸，此序列差异恰是人工引入CDR3的随机化序列部位[2]。}j&4}, 百拇医药
本研究证实利用半合成抗体库可绕过免疫制备TNF-α抗体，但还需进一步分析鉴定，并可能需通过体外亲和力成熟过程改善其性能。}j&4}, 百拇医药
* 国家863计划(863-102-09-02-01)和国家自然科学基金(39670679)资助项目}j&4}, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，53岁，硕士，教授}j&4}, 百拇医药
参考文献}j&4}, 百拇医药
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(1998-04-15收稿；1998-07-13修回)(王 琰 刘群英 化 冰 陈宇萍 朱迎春 陈晓穗)