硝酸纤维素膜微粒ELISA方法的建立
作者：邹 静;, http://www.100md.com
单位：白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科，中国人民解放军耳鼻咽喉病中心头颈肿瘤分子生物学实验室 石家庄 050082;, http://www.100md.com
关键词：;, http://www.100md.com
免疫学杂志990223ESTABLISH OF NITROCELLULOSE MICRO-;, http://www.100md.com
PARTICLES ELISA METHOD;, http://www.100md.com
本文报道硝酸纤维素膜微粒ELISA(nitrocellulosemicroparticle ELISA ，NCMPE)方法，该法可用含表面活性剂的混合抗原定量测试针对其中某一组分的抗体，具体如下。;, http://www.100md.com
1 方法;, http://www.100md.com
1.1 混合抗原直接测试 按文献报导方法[1]，将1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10%丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h条件下大鼠血清蛋白电泳吸附于NC膜，用蒸馏水漂洗后，切一10×100mm小条装入10ml试管备用。对照组将同样面积空白NC膜用蒸馏水漂洗后备用。在上述装有NC膜的试管中加入10ml DMSO，充分摇匀，室温1h；加入等体积0.1mol/L pH9.0碳酸氢钠溶液，充分混匀。3000r/min离心3～5min，收集沉淀，即为含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0.01mol/L pH7.4 PBS-T洗涤离心3×5min；用含0.3%的1：50正常羊血清封闭、阻断37°C30min或4°C冰箱过夜；同上离心后用PBS将微粒体积调至5ml、用0.5ml离心管分装，每管加入100μl微粒悬浊液；在各管中分别加入100μl倍比稀释的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗涤离心3次，加入100μl含0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠、双氧水、邻苯二胺底物溶液，于37°C暗环境反应120min；每管加入1滴2mol/L硫酸终止反应，同上离心，收集上清并加入96孔酶联板，用酶标仪测试波长490nm处OD值。重复测试3次。;, http://www.100md.com
1.2 电泳分离抗原测试 首先免疫转印鉴定抗原，再根据免疫转印结果进行定位，将特定抗原带裁下，测量NC膜面积，同上将NC膜微粒化处理并进行定量免疫测试。;, http://www.100md.com
2 结果
用混合抗原直接测试和用电泳分离抗原进行测试，抗体浓度与OD值间均有较好线性关系，当抗体浓度为0.25～1.0ng/ml时线性最好，且阳性组和阴性对照组OD值落在最佳范围(见表1)，即阴性对照组OD值为0.3左右，阳性对照组为1.0左右。3次重复结果一致。an22+w3, 百拇医药
表1 NC膜微粒ELISA法测试羊抗鼠IgG抗体浓度(ng/ml)与OD值(
±s)结果an22+w3, 百拇医药
Tab 1 Concentration of goat anti-mouse IgG antibody test withan22+w3, 百拇医药
micro-particles ELISA method(±s)and OD vsan22+w3, 百拇医药
Concentration of goatan22+w3, 百拇医药
anti-mouseIgG antibobyan22+w3, 百拇医药
OD vs concentration of antibody in each Gan22+w3, 百拇医药
Negative Gan22+w3, 百拇医药
Direct absorb G*an22+w3, 百拇医药
Western blot G＃an22+w3, 百拇医药
0.0625an22+w3, 百拇医药
0.004±0.000an22+w3, 百拇医药
0.070±0.015an22+w3, 百拇医药
0.060±0.012an22+w3, 百拇医药
0.1250an22+w3, 百拇医药
0.067±0.009
0.349±0.055#, 百拇医药
0.317±0.040#, 百拇医药
0.2500#, 百拇医药
0.179±0.026#, 百拇医药
0.752±0.162#, 百拇医药
0.700±0.152#, 百拇医药
0.5000#, 百拇医药
0.334±0.045#, 百拇医药
1.173±0.563#, 百拇医药
1.170±0.504#, 百拇医药
1.0000#, 百拇医药
0.492±0.048#, 百拇医药
1.697±0.220#, 百拇医药
1.597±0.220#, 百拇医药
2.0000#, 百拇医药
0.682±0.075#, 百拇医药
2.493±0.325#, 百拇医药
2.294±0.301#, 百拇医药
*tested with complex antigen；＃tested with electrophoresis isolated antigen 3 讨论#, 百拇医药
用ELISA法进行测试时，包被条件非常关键，对用于包被的抗原或抗体要求较高，其应用范围受限制。NC膜具有很强的吸附能力，从而出现了以该材料为基础的斑点免疫检测法[2～4]。其对被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于检测，但吸附时间长、费时，被吸附抗原如果含有表面活性剂便不能用于检测。为了克服上述缺点，我们曾建立了一种电泳吸附斑点免疫法[1]，但该法需要将NC膜逐一截成小圆片放入酶联板中，操作也不方便，定量不够准确。NCMPE法将电泳吸附抗原的NC膜变成微颗粒，分装方便，能保证其均一性，定量准确，由于在离心管中操作、洗涤等处理极为方便。免疫转印技术是抗原抗体检测方面的重大突破，但应用该方法难以将抗体定量。NCMPE法将免疫转印识别的特定抗原带处理成微颗粒，然后用ELISA法定量测试抗体水平，充分发挥了免疫转印技术的高分辨率和ELISA定量法的高度精确性与高度灵敏性，可极为方便而准确地将某种未知抗体定量。#, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，32岁，博士，副主任医师#, 百拇医药
参考文献#, 百拇医药
1 邹 静，翟所强，姜泗长，等.豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析.中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30(1)：13#, 百拇医药
2 Hakwes R， Nidy E， Gordon J. A dot-immunobinding assay for monclonal and other antibody. Anal Biochem，1982，119：142#, 百拇医药
3 Hakwes R. The dot immunobinding assay. Methods Enzymol，1986，121：484#, 百拇医药
4 Steinitz M， Rosen A， Klein G. An improved dot immunobinding assay for screening hybridoma supernatants： non-purified antigen immobilized on nitrocellilose paper discs. J Immunol Methods，1991，136：119#, 百拇医药
(1998-03-16收稿；1998-08-23修回)(邹 静)
单位：白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科，中国人民解放军耳鼻咽喉病中心头颈肿瘤分子生物学实验室 石家庄 050082;, http://www.100md.com
关键词：;, http://www.100md.com
免疫学杂志990223ESTABLISH OF NITROCELLULOSE MICRO-;, http://www.100md.com
PARTICLES ELISA METHOD;, http://www.100md.com
本文报道硝酸纤维素膜微粒ELISA(nitrocellulosemicroparticle ELISA ，NCMPE)方法，该法可用含表面活性剂的混合抗原定量测试针对其中某一组分的抗体，具体如下。;, http://www.100md.com
1 方法;, http://www.100md.com
1.1 混合抗原直接测试 按文献报导方法[1]，将1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10%丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h条件下大鼠血清蛋白电泳吸附于NC膜，用蒸馏水漂洗后，切一10×100mm小条装入10ml试管备用。对照组将同样面积空白NC膜用蒸馏水漂洗后备用。在上述装有NC膜的试管中加入10ml DMSO，充分摇匀，室温1h；加入等体积0.1mol/L pH9.0碳酸氢钠溶液，充分混匀。3000r/min离心3～5min，收集沉淀，即为含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0.01mol/L pH7.4 PBS-T洗涤离心3×5min；用含0.3%的1：50正常羊血清封闭、阻断37°C30min或4°C冰箱过夜；同上离心后用PBS将微粒体积调至5ml、用0.5ml离心管分装，每管加入100μl微粒悬浊液；在各管中分别加入100μl倍比稀释的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗涤离心3次，加入100μl含0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠、双氧水、邻苯二胺底物溶液，于37°C暗环境反应120min；每管加入1滴2mol/L硫酸终止反应，同上离心，收集上清并加入96孔酶联板，用酶标仪测试波长490nm处OD值。重复测试3次。;, http://www.100md.com
1.2 电泳分离抗原测试 首先免疫转印鉴定抗原，再根据免疫转印结果进行定位，将特定抗原带裁下，测量NC膜面积，同上将NC膜微粒化处理并进行定量免疫测试。;, http://www.100md.com
2 结果
用混合抗原直接测试和用电泳分离抗原进行测试，抗体浓度与OD值间均有较好线性关系，当抗体浓度为0.25～1.0ng/ml时线性最好，且阳性组和阴性对照组OD值落在最佳范围(见表1)，即阴性对照组OD值为0.3左右，阳性对照组为1.0左右。3次重复结果一致。an22+w3, 百拇医药
表1 NC膜微粒ELISA法测试羊抗鼠IgG抗体浓度(ng/ml)与OD值(
±s)结果an22+w3, 百拇医药Tab 1 Concentration of goat anti-mouse IgG antibody test withan22+w3, 百拇医药
micro-particles ELISA method(
±s)and OD vsan22+w3, 百拇医药Concentration of goatan22+w3, 百拇医药
anti-mouseIgG antibobyan22+w3, 百拇医药
OD vs concentration of antibody in each Gan22+w3, 百拇医药
Negative Gan22+w3, 百拇医药
Direct absorb G*an22+w3, 百拇医药
Western blot G＃an22+w3, 百拇医药
0.0625an22+w3, 百拇医药
0.004±0.000an22+w3, 百拇医药
0.070±0.015an22+w3, 百拇医药
0.060±0.012an22+w3, 百拇医药
0.1250an22+w3, 百拇医药
0.067±0.009
0.349±0.055#, 百拇医药
0.317±0.040#, 百拇医药
0.2500#, 百拇医药
0.179±0.026#, 百拇医药
0.752±0.162#, 百拇医药
0.700±0.152#, 百拇医药
0.5000#, 百拇医药
0.334±0.045#, 百拇医药
1.173±0.563#, 百拇医药
1.170±0.504#, 百拇医药
1.0000#, 百拇医药
0.492±0.048#, 百拇医药
1.697±0.220#, 百拇医药
1.597±0.220#, 百拇医药
2.0000#, 百拇医药
0.682±0.075#, 百拇医药
2.493±0.325#, 百拇医药
2.294±0.301#, 百拇医药
*tested with complex antigen；＃tested with electrophoresis isolated antigen 3 讨论#, 百拇医药
用ELISA法进行测试时，包被条件非常关键，对用于包被的抗原或抗体要求较高，其应用范围受限制。NC膜具有很强的吸附能力，从而出现了以该材料为基础的斑点免疫检测法[2～4]。其对被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于检测，但吸附时间长、费时，被吸附抗原如果含有表面活性剂便不能用于检测。为了克服上述缺点，我们曾建立了一种电泳吸附斑点免疫法[1]，但该法需要将NC膜逐一截成小圆片放入酶联板中，操作也不方便，定量不够准确。NCMPE法将电泳吸附抗原的NC膜变成微颗粒，分装方便，能保证其均一性，定量准确，由于在离心管中操作、洗涤等处理极为方便。免疫转印技术是抗原抗体检测方面的重大突破，但应用该方法难以将抗体定量。NCMPE法将免疫转印识别的特定抗原带处理成微颗粒，然后用ELISA法定量测试抗体水平，充分发挥了免疫转印技术的高分辨率和ELISA定量法的高度精确性与高度灵敏性，可极为方便而准确地将某种未知抗体定量。#, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，32岁，博士，副主任医师#, 百拇医药
参考文献#, 百拇医药
1 邹 静，翟所强，姜泗长，等.豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析.中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30(1)：13#, 百拇医药
2 Hakwes R， Nidy E， Gordon J. A dot-immunobinding assay for monclonal and other antibody. Anal Biochem，1982，119：142#, 百拇医药
3 Hakwes R. The dot immunobinding assay. Methods Enzymol，1986，121：484#, 百拇医药
4 Steinitz M， Rosen A， Klein G. An improved dot immunobinding assay for screening hybridoma supernatants： non-purified antigen immobilized on nitrocellilose paper discs. J Immunol Methods，1991，136：119#, 百拇医药
(1998-03-16收稿；1998-08-23修回)(邹 静)