抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析*
作者：朱志刚 沈关心 王晓林^4?*]a:, 百拇医药
单位：同济医科大学免疫学教研室 武汉 430032^4?*]a:, 百拇医药
关键词：^4?*]a:, 百拇医药
免疫学杂志990222CLONING AND CHARACTERIZATION OF VARIABLE^4?*]a:, 百拇医药
REGION GENES FROM AN ANTI-CD4^4?*]a:, 百拇医药
MONOCLONAL ANTIBODY SECRETING HYBRIDOMA^4?*]a:, 百拇医药
抗CD4单抗可延长灵长类动物模型同种器官移植物的存活时间和改善实验性自身免疫疾病的病情[1]。在人类，抗CD4单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎[2]、系统性红斑狼疮[3]等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应[4]。本文对抗CD4单克隆抗体VH和VL基因进行了克隆和序列分析，为其嵌合抗体的构建、表达奠定了基础。^4?*]a:, 百拇医药
1 材料与方法^4?*]a:, 百拇医药
1.1 RNA提取 参照TRIzol Reagent Kit说明书，从分泌抗人CD4McAb的杂交瘤细胞系中提取总RNA。^4?*]a:, 百拇医药
1.2 RT-PCR 参照Super SCRIP cDNA合成试剂说明书，合成cDNA第一条链：分别以VHback(Sal I)和VHfor(EcoR I)为引物扩增出VH基因，以VLback(Sal I)和VLfor(Not I)为引物扩增出VL基因。^4?*]a:, 百拇医药
1.3 VH和VL DNA的克隆 选择pGEM-T作为克隆载体，分别将VH和VL与pGEM-T连接后，各取2μl用来转化JM109感受态细菌，挑选白色菌落用菌落PCR进一步鉴定。^4?*]a:, 百拇医药
1.4 VH和VLDNA序列测定与分析 分别取阳性菌落PCR产物，在PE373型全自动DNA序列分析仪上进行序列测定。通过Internet网进入美国NCBI，使用BLAST分别将VH或VL DNA序列与GenBank和EMBL数据库已收录序列进行碱基局部同源性比较。然后，在IBM-PC机上使用DNASIS 7.0进行测序结果分析。最后以推导的VH和VL氨基酸序列与Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序列分类进行对比。
2 结果:iw, 百拇医药
2.1 VH和VL基因的扩增 分别取5～10μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。通过与DNA标准分子量对比，可初步认定430bp左右的条带VH和410bp左右的条带VL。:iw, 百拇医药
2.2 VH和VL基因的核苷酸序列分析 对VH和VL核苷酸序列进行互相比较发现，6个VH阳性克隆序列一致，7个VL阳性克隆序列一致、另1个克隆为非Ig序列。VH和VLDNA序列均符合小鼠Ig可变区框架结构：VHDNA由408bp组成，其中信号肽57bp，编码区351bp、编码117aa残基，隶属小鼠Ig重链可变区Ⅱ(A)亚组；VLDNA由393bp组成，其中信号肽60bp，编码区333bp、编码111aa残基，隶属小鼠IgK链可变区Ⅲ亚组。:iw, 百拇医药
3 讨论:iw, 百拇医药
本研究通过从分泌抗CD4单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用家族特异通用引物，通过RT-PCR分别成功地扩增出VH和VL基因。作者选 用pGRM-T作为克隆载体，可直接与PCR产物在T4DNA连接酶作用下相连接，并采用菌落PCR筛选阳性克隆，提高了鉴定效率。经过DNASIS7.0软件与另一抗CD4单抗M-T310[5]进行序列对比发现：VH同源性为75%(336/443)，VL同源性为88%(351/397)，其中信号肽和骨架区基本相同。抗CD4单克隆抗体VH和VL基因的克隆成功和序列分析为构建和表达抗CD4嵌合抗体奠定了基础。:iw, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(393870628):iw, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，31岁，硕士，主治医师(现在广州市第一人民医院血液科工作 广州 510180):iw, 百拇医药
参考文献:iw, 百拇医药
1 Van Lanbalgen R，Jonker M.Experimental allergic encepa-lompelitis in rhesus monkeys. Treatment of EAE with anti-T lymphocyte subset monoclonal antibodies.Clin Exp Immunol，1987，68：305:iw, 百拇医药
2 Reiter C，Kakavand B，Rieber EP，et al.Treatment of reheumatoid arthritis with monoclonal CD4 antibody M-T151.Clinical results and immunopharmacologic effects in an open study，including repeared administration.Arthrith Rheum，1991，34：525:iw, 百拇医药
3 Hiepe F，Volk HD，Apostoloff HD，et al.Treatment of severe systemic lupus erythematosus with anti-CD4 mo-noclonal antibody.Lancet，1991，338：1529:iw, 百拇医药
4 Mousson C，Tanter Y，Racadot E，et al.CD4 and CD25 monoclnal antibody cocktail in kidney transplant rejection prophylaxis：clinical resilts of a pilot study.Transplantation Proc，1995，27：1727:iw, 百拇医药
5 Weissenhorn W，Scheuer W，Kaluza B，et al.Combinatorial functions of two chimeric antibodies directed to human CD4 and one directed to the alpha-chain of the human interleukin-2 receptor.Gene，1992，121：271:iw, 百拇医药
(1998-03-23收稿；1998-07-31修回)(朱志刚 沈关心 王晓林)
单位：同济医科大学免疫学教研室 武汉 430032^4?*]a:, 百拇医药
关键词：^4?*]a:, 百拇医药
免疫学杂志990222CLONING AND CHARACTERIZATION OF VARIABLE^4?*]a:, 百拇医药
REGION GENES FROM AN ANTI-CD4^4?*]a:, 百拇医药
MONOCLONAL ANTIBODY SECRETING HYBRIDOMA^4?*]a:, 百拇医药
抗CD4单抗可延长灵长类动物模型同种器官移植物的存活时间和改善实验性自身免疫疾病的病情[1]。在人类，抗CD4单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎[2]、系统性红斑狼疮[3]等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应[4]。本文对抗CD4单克隆抗体VH和VL基因进行了克隆和序列分析，为其嵌合抗体的构建、表达奠定了基础。^4?*]a:, 百拇医药
1 材料与方法^4?*]a:, 百拇医药
1.1 RNA提取 参照TRIzol Reagent Kit说明书，从分泌抗人CD4McAb的杂交瘤细胞系中提取总RNA。^4?*]a:, 百拇医药
1.2 RT-PCR 参照Super SCRIP cDNA合成试剂说明书，合成cDNA第一条链：分别以VHback(Sal I)和VHfor(EcoR I)为引物扩增出VH基因，以VLback(Sal I)和VLfor(Not I)为引物扩增出VL基因。^4?*]a:, 百拇医药
1.3 VH和VL DNA的克隆 选择pGEM-T作为克隆载体，分别将VH和VL与pGEM-T连接后，各取2μl用来转化JM109感受态细菌，挑选白色菌落用菌落PCR进一步鉴定。^4?*]a:, 百拇医药
1.4 VH和VLDNA序列测定与分析 分别取阳性菌落PCR产物，在PE373型全自动DNA序列分析仪上进行序列测定。通过Internet网进入美国NCBI，使用BLAST分别将VH或VL DNA序列与GenBank和EMBL数据库已收录序列进行碱基局部同源性比较。然后，在IBM-PC机上使用DNASIS 7.0进行测序结果分析。最后以推导的VH和VL氨基酸序列与Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序列分类进行对比。
2 结果:iw, 百拇医药
2.1 VH和VL基因的扩增 分别取5～10μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。通过与DNA标准分子量对比，可初步认定430bp左右的条带VH和410bp左右的条带VL。:iw, 百拇医药
2.2 VH和VL基因的核苷酸序列分析 对VH和VL核苷酸序列进行互相比较发现，6个VH阳性克隆序列一致，7个VL阳性克隆序列一致、另1个克隆为非Ig序列。VH和VLDNA序列均符合小鼠Ig可变区框架结构：VHDNA由408bp组成，其中信号肽57bp，编码区351bp、编码117aa残基，隶属小鼠Ig重链可变区Ⅱ(A)亚组；VLDNA由393bp组成，其中信号肽60bp，编码区333bp、编码111aa残基，隶属小鼠IgK链可变区Ⅲ亚组。:iw, 百拇医药
3 讨论:iw, 百拇医药
本研究通过从分泌抗CD4单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用家族特异通用引物，通过RT-PCR分别成功地扩增出VH和VL基因。作者选 用pGRM-T作为克隆载体，可直接与PCR产物在T4DNA连接酶作用下相连接，并采用菌落PCR筛选阳性克隆，提高了鉴定效率。经过DNASIS7.0软件与另一抗CD4单抗M-T310[5]进行序列对比发现：VH同源性为75%(336/443)，VL同源性为88%(351/397)，其中信号肽和骨架区基本相同。抗CD4单克隆抗体VH和VL基因的克隆成功和序列分析为构建和表达抗CD4嵌合抗体奠定了基础。:iw, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(393870628):iw, 百拇医药
作者简介 第一作者：男，31岁，硕士，主治医师(现在广州市第一人民医院血液科工作 广州 510180):iw, 百拇医药
参考文献:iw, 百拇医药
1 Van Lanbalgen R，Jonker M.Experimental allergic encepa-lompelitis in rhesus monkeys. Treatment of EAE with anti-T lymphocyte subset monoclonal antibodies.Clin Exp Immunol，1987，68：305:iw, 百拇医药
2 Reiter C，Kakavand B，Rieber EP，et al.Treatment of reheumatoid arthritis with monoclonal CD4 antibody M-T151.Clinical results and immunopharmacologic effects in an open study，including repeared administration.Arthrith Rheum，1991，34：525:iw, 百拇医药
3 Hiepe F，Volk HD，Apostoloff HD，et al.Treatment of severe systemic lupus erythematosus with anti-CD4 mo-noclonal antibody.Lancet，1991，338：1529:iw, 百拇医药
4 Mousson C，Tanter Y，Racadot E，et al.CD4 and CD25 monoclnal antibody cocktail in kidney transplant rejection prophylaxis：clinical resilts of a pilot study.Transplantation Proc，1995，27：1727:iw, 百拇医药
5 Weissenhorn W，Scheuer W，Kaluza B，et al.Combinatorial functions of two chimeric antibodies directed to human CD4 and one directed to the alpha-chain of the human interleukin-2 receptor.Gene，1992，121：271:iw, 百拇医药
(1998-03-23收稿；1998-07-31修回)(朱志刚 沈关心 王晓林)