柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达
作者：彭天庆 杨英珍 李光地 孔玉英
单位：彭天庆 杨英珍 卫生部病毒性心脏病重点实验室，上海医科大学中山医院，上海 200032；李光地 孔玉英 中国科学院上海生化所，上海 200031
关键词：柯萨奇B3病毒(CVB3)；衣壳蛋白；重组痘苗病毒
病毒学报990405 摘要：将编码柯萨奇B3病毒(CVB3)衣壳蛋白VP1和VP2的基因，分别克隆到具有7.5k启动子的痘苗病毒表达载体pGJP5上；将CVB3衣壳蛋白全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上，并筛选到相应的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP/4/2/3/1。VVP1和VVP2稳定表达产物为CVB3衣壳蛋白VP1和VP2，而VVP/4/2/3/1的产物VP4/2/3/1为一无分泌性的多聚蛋白，且这三种表达产物均属无分泌性蛋白。为了表达成熟的CVB3衣壳蛋白，将去除5′端非编码区的CVB3全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上，利用重组痘苗病毒VT7所提供的T7RNA聚合酶，在哺乳动物细胞中进行了暂时表达研究。Western blot分析提示，VP1、VP2和VP3蛋白得到成熟表达，且发现表达产物具有分泌性。本研究将为今后研究CVB免疫性打下基础。
, http://www.100md.com
中图分类号：R373.2+3；Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0323-07
EXPRESSION OF COXSACKIEVIRUS B3 CODING GENE IN MAMMALIAN CELLS BY RECOMBINANT VACCINIA VIRUS
PENG Tian-qing1, YANG Ying-zhen1, LI Guang-di2, KONG Yu-ying2
(1. Key Laboratory of Viral Heart Diseases, Ministry of Health, Zhong Shan Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China; 2. Shanghai Institute of Biochemistry, Academia Sinica, Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
Abstract: The DNA fragments coding CVB3 capsid protein VP1 and VP2 were put under the control of 7.5k promoter in a vaccinia virus plasmid pGJP5, which were used to screen the recombinant vaccinia viruses VVP1 carrying CVB3 VP1 gene and the VVP2 carrying CVB3 VP2 gene through homology recombination respectively. The VP1 or VP2 protein was able to be observed in Vero cells infected with VVP1 or VVP2 by Western blot, though they were not secreted into the media. Then CVB3 capsid protein VP4/2/3/1 gene was inserted into the vaccinia virus expression plasmid pTM1 on the downstream side of the promoter T7, and the recombinant vaccinia virus VVP4/2/3/1 was constructed through homology recombination. The CVB3 VP4/2/3/1 ploypeptide in Vero cells was found on Western blot using the T7 RNA polymerase encoded by vT7. The results suggest that the mature expression of CVB3 capsid proteins has a strict requirement of the nonstructural region downstream. Thus, the entire coding region of CVB3 genome was introduced into a vaccinia virus expression plasmid pTM1 with the 5' untranslated region totally excluded, under the control of a T7 promoter. The transient expression in mammalian cells was studied using the T7 RNA polymerase encoded by vT7. The CVB3 proteins were able to be detected by ELISA both in the media and in the cells, and the proteins CVB3 VP1, VP2, VP3 in mature forms were all observed on Western blot using antisera against CVB3, CVB3 VP1 protein and CVB3 VP4/2/3 protein respectively. The work will provide basis for future study on the purification and immunological analysis of CVB proteins.
, http://www.100md.com
Key words: Coxsackievirus B3; Capsid proteins; Recombinant vaccinia virus
柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus group B，CVB)属细小RNA病毒，内含单股正链RNA，全长约7 400个核苷酸，含一个阅读框架。CVB病毒基因首先表达分子量为200kD以上的多聚蛋白。最后加工成为病毒颗粒则有赖于病毒自身合成的蛋白裂解酶，而非结构基因的同时表达使多聚蛋白得以最后加工成为颗粒并包入病毒RNA。构成病毒颗粒的蛋白为外壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。目前已有报道将CVB3外壳蛋白基因和非结构蛋白基因在原核细胞表达体系中进行表达[1～3]。但是，迄今为止很少有报道应用真核细胞表达体系研究CVB基因的表达。
以痘苗病毒为载体已成功地表达了许多外源基因[4]，并能对外源基因表达产物正确加工，如能构建成表达外源基因的重组痘苗病毒，则能稳定表达外原基因蛋白，且表达产物不需纯化可直接用于研究其免疫原性等。
, 百拇医药
本文研究CVB3结构蛋白基因和去5′端非编码区CVB3全基因的表达。
材料与方法
1 菌株、病毒株、哺乳动物细胞和质粒 大肠杆菌TG-1、重组痘苗病毒vTT7和痘苗病毒天坛株，pTM1和pGJP5痘苗病毒表达载体，CV-1、HumTK-和Vero细胞，均由中国科学院上海生化所李光地教授提供。pCVB-M1含CVB3全长cDNA的质粒，由德国R.Kandolf教授提供。
2 工具酶 DNA限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶等有关基因操作的酶均为Amersham、Promega或Boehringer产品。
3 主要试剂 测序试剂盒为Pharmacia产品。随机引物、非放射性同位素异羟基洋地黄毒甙配基(DIG)标记核酸探针试剂盒、DNA扩增试剂盒和硝酸纤维素膜(NC膜),均为Boehringer产品。质粒大量提取和纯化试剂盒为QIAGEN产品。
, http://www.100md.com
4 引物 第一组：用于扩增CVB3VP1基因的引物，其序列为上游引物P1：5′GCAAAACAGATCTATGGGTCCAGTGG3′；下游引物P2：5′ATTGTTTCTAGAATGCGCCCGTATTTG3′。第二组：用于扩增CVB3VP2基因的引物，其序列为上游引物P3：5′CCAGGATCCATGTCCCCCACAGTAG3′；下游引物P4：5′GGTGAATTCTCACTGGTGCCCTGC3′。第三组：用于扩增CVB3VP1-4基因的引物，其序列为上游引物P5：5′GACGGATCCATGGGAGCTCAAGTATC3′；下游引物P6：5′ATTGTTTCTAGAATGCGCCCGTATTTG3′。
5 人工合成DNA接头 GCCATGGGAGCT ACGTCGGTACCC含有用于连接的PstⅠ位点、NcoⅠ位点和CVB3第一个翻译起始密码(碱基741)到SacⅠ位点。
6 DNA重组 按“分子克隆”[5]中的方法进行。
, http://www.100md.com
7 哺乳动物细胞的转染 细胞经痘苗病毒天坛株以MOI为0.1(筛选重组痘苗病毒株)或经重组痘苗病毒株vTT7以MOI为10(暂时表达)感染1小时后，用磷酸钙沉淀法进行。
8 病毒DNA抽提、斑点杂交、Southern杂交和表达产物的SDS-PAGE电泳、Western blot检测 参考文献[5]。PCR反应具体操作参考试剂盒说明书。
结果
1 痘苗病毒表达质粒的构建
1.1 pGJP5/VP1和pGJP5/VP2的构建 以含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M1为模板(图1-A)，先后用第一组和第二组两对引物，通过PCR法分别扩增得到了CVB3-VP1和VP2基因片段。VP1基因片段的5′内测端含有BglⅡ位点，3′端含有XbaⅠ位点，将此片段补平并经BglⅡ酶切后克隆入痘苗病毒表达栽体pGJP5中7.5k启动子的下游BamHI和EcoRI酶切点处(EcoRI位点先补平)，组成重组表达质粒pGJP5/VP1(图1-B)。VP2基因片段的5′端含有BamHI位点，3′端含有EcoRI位点，将此片段经BamHI和EcoRI双酶切后克隆入痘苗病毒表达载体pGJP5中7.5k启动子的下游BamHI和EcoRI酶切点处，组成重组表达质粒pGJP5/VP2(图1-C)。所用痘苗表达载体pGJP5含有用于体内重组两段痘苗TK基因片段。
, 百拇医药
图1 含CVB3基因的重组痘苗表达质粒的构建图
(A)-(E)为CVB3基因和各重组表达质粒。
Figure 1 Construction of recombinant vaccinia virus expressing plasmid containing CVB3 gene
(A)-(E): CVB3 gene fragment and vaccinia virus expressing plasmids.
1.2 pTM1/cvb和pTM1/P1的构建 为了获得完成切除5′端非编码区后的CVB3病毒全基因，我们将含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M1利用共有的限制性内切酶位点进行重新拼接(图1-E)。pCVB3-M1经PstI和BglⅡ双酶切得到的CVB 3 590-2 041片段(S1)插入pUC9中的PstI和BamHI位点，成为pUC9/1。将人工合成的12个核苷酸双链的接头通过PstI和SacI位点定向插入质粒pUC9/1，成为pUC9/2，并经核苷酸测序验证。此合成接头包含了NcoI位点和CVB3第一个翻译起始密码(碱基741)到SacI位点(碱基745)。pUC9/2上的CVB3片段通过NcoI和XhoI双酶解，同时定向插入已经NcoI和XhoI双酶解打开的pTM1上，得到含完成切除5′端非编码区后CVB3基因片段S1的质粒pTM1/S1。将pCVB3-M1的EcoRI位点打开并补平后，在XhoI位点处解开，并分离得到0.7kb长的CVB3基因(S2)。将此片段定向插入经XhoI和StuI双酶解打开的pTM1/S1上，成为pTM1/S2。然后，在pCVB3-M1上分离得到两端含EcoRI位点的CVB3片段S3(2 700-7 400)，并定向插入到经EcoRI打开的pTM1/S2上，最后得到的pTM1/cvb为包含有完成切除5′端非编码区后的CVB3完整的开放阅读框架。
, 百拇医药
以含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M为模板，用第三组引物通过PCR法扩增得到了CVB3-VP1-4基因片段。将该VP4/2/3/1基因片段两端补平后用XhoI进行酶切分离得到小片段，并将其定向插入到经XhoI和StuI双酶解打开的pTM1/S1上，得到含CVB3衣壳蛋白全基因的表达质粒pTM1/P1(图1-D)。所用痘苗表达载体pTM1含有T7启动子和转录终止密码，以及用于体内重组的两段痘苗TK基因片段。
2 带有CVB3基因重组痘苗病毒的构建
CV-1细胞经天坛株痘苗病毒感染后，按磷酸钙沉淀法转染重组痘苗表达质粒。培养48小时后，收集细胞并进行空斑法筛选[7]。筛选到含CVB3VP1基因的重组痘苗病毒VVP1、含CVB3VP2基因的重组痘苗病毒VVP2和含CVB3VP4/2/3/1基因的重组痘苗病毒VVP4/2/3/1。重组痘苗病毒的PCR和Southern杂交鉴定结果如图2所示。VVP1DNA、VVP2DNA、VVP4/2/3/1分别在0.85kb、0.80kb、2.5kb位置附近有阳性信号出现，而对照天坛株痘苗病毒DNA无任何阳性信号。这些均证明：CVB3VP1基因、CVB3VP2基因和CVB3VP4/2/3/1基因已被正确地整合到各自的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP4/2/3/1的基因组中。
, 百拇医药
图2 VVP1、VVP2和VVP4/2/3/1的PCR和Southern blot鉴定
A和C为PCR产物凝胶电泳；B和D为PCR产物的Southern blot结果；a为Marker，λDNA/HindⅢ+EcoRI；b为痘苗病毒天坛株DNA；c为VVP1 DNA；d为VVP2 DNA；e为VVP4/2/3/1 DNA；f为痘苗病毒天坛株DNA。
Figure 2 Identification of recombinant vaccinia viruses VVP1, VVP2 and VVP4/2/3/1 by PCR and Southern blot
A and C: Electrophoresis of PCR products; B and D: Southern blot of PCR products；a. DNA marker; b. Vaccinia virus Tian Tan strain DNA;c. VVP1 DNA; d. VVP2 DNA; e. VVP4/2/3/1 DNA;f. Vaccinia virus Tian Tan strain DNA.
, 百拇医药
3 重组痘苗病毒的稳定表达和分析
VVP1或VVP2以MOI为2感染Vero细胞，vT7重组痘苗病毒以MOI为10和VVP4/2/3/1重组痘苗病毒以MOI为1双重感染Vero细胞，48小时后收获细胞。对细胞裂解液进行Western blot检测，以天坛痘苗病毒感染细胞作阴性对照。结果如图3所示：VVP1感染Vero细胞在35kD附近处有一特异条带；VVP2感染Vero细胞在34kD附近处有一特异条带；vTT7和VVP4/2/3/1双感染Vero细胞在100kD附近处有一特异条带，此条带相当于CVB3VP4/2/3/1蛋白质分子量。所有细胞培养上清液均未见特异条带。
图3 重组痘苗病毒稳定表达产物的Western blot分析
A.用抗CVB3抗血清检测VVP4/2/3/1的表达产物；B.用抗CVB3VP1抗血清检测VVP1的表达产物；C.用抗CVB3 VP4/2/3抗血清检测VVP2的表达产物；a.为重组痘苗病毒感染的Vero细胞；b.为痘苗病毒天坛株感染的Vero细胞。
, http://www.100md.com
Figure 3 Western blot analysis of stably expressed products of recombinant vaccinia viruses
A. Detection of VVP4/2/3/1 expressed products using specific antisera against CVB3;B. Detection of VVP1 expressed products using specific antisera against CVB3 VP1 protein;C. Detection of VVP2 expressed products using specific antisera against CVB3 VP4/2/3；a. Recombinant vaccinia virus infected Vero cells;b. Vaccinia virus Tian Tan strain infected Vero cells.
, 百拇医药
4 重组表达质粒pTM1/cvb的暂时表达及分析
vTT7重组痘苗病毒能提供T7启动子工作所必需的T7RNA聚合酶。CV-1细胞经vTT7重组痘苗病毒感染1小时后，重组质粒按磷酸钙沉淀法转染哺乳动物细胞，48小时培养后，收获上清液和细胞供以下检测。
4.1 ELISA法检测 用双抗体夹心ELISA检测上清液和细胞裂解液中CVB3抗原(马抗CVB3抗血清包板，小鼠抗CVB3抗血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗)的OD值，以P/N值大于2.1为阳性标准。以培养的CVB3病毒作正对照，为0.58；pTM1转染vTT7感染后的细胞作负对照，分别为0.025和0.036。在共转染后的CV-1上清液和细胞裂解液中均检测到CVB3抗原，分别为0.154和0.247。
4.2 细胞裂解液的Western blot检测 结果如图4所示：在27kD、35kD(小鼠抗CVB3抗血清作一抗)处，在35kD(兔抗CVB3 VP1抗血清作一抗)处，在27kD、34kD和40kD处(兔抗CVB3 VP2/3/4抗血清作一抗)，都出现明显的特异条带。27kD左右条带与CVB3 VP3蛋白相符，34kD条带与CVB3 VP2蛋白相符，35kD左右条带与CVB3 VP1蛋白相符，40kD左右的条带与CVB3 VP0大小相符。
, 百拇医药
图4 重组质粒pTM1/cvb暂时表达的Western blot分析
1.蛋白质标准物；2.用抗CVB3 VP1抗血清检测；3.用抗CVB3抗血清检测；4.用抗CVB3 VP4/2/3抗血清检测。
Figure 4 Analysis of transient expressed products of recombinant plasmid pTM1/cvb by Western blot
1. Protein marker;2. Detection by using specific antisera against CVB3 VP1 protein;3. Detection by using specific antisera against CVB3;4. Detection by using specific antisera against CVB3 VP4/2/3.
, 百拇医药
讨论
本文研究了CVB3结构蛋白基因和去5′端非编码区CVB3全基因的表达，结果发现：CVB3衣壳蛋白全基因能够在痘苗病毒表达体系中得到表达，但产物为一多聚蛋白前体。可见要使衣壳蛋白全基因在哺乳动物细胞中正常表达，合适的加工序列是必不可少的，哺乳动物细胞本身不具备将CVB3衣壳蛋白多聚蛋白前体加工成成熟的衣壳蛋白。去除5′非编码区的CVB3全编码基因在痘苗病毒表达体系中有效表达，以及表达产物的分析结果表明：CVB3非结构蛋白的同时表达对衣壳多聚蛋白加工是必不可少的，而5′非编码区的去除，对CVB3全编码基因各衣壳蛋白的成熟后加工没有影响。今后可以应用该系统方法进一步研究CVB非结构蛋白对CVB成熟颗粒的加工规律。由于同属于细小RNA病毒的脊髓灰质炎病毒和甲肝病毒，它们的全部开放阅读框架分别在重组昆虫病毒系统和重组痘苗病毒系统中表达，已获得了有良好的免疫原性和无感染性的空壳颗粒[6，7]。本研究结果也提示我们，构建的重组痘苗病毒VT7cvb可能会表达成熟的CVB3空壳颗粒，如能进一步研究证实，那么这种重组痘苗病毒产生的空壳颗粒或亚病毒颗粒，经过一定的分离纯化后，无论是作为抗原应用于诊断试剂，还是作为免疫原研制成基因工程CVB疫苗，在免疫原性及安全性方面将显示其优势。有关的研究正在进行之中。
, http://www.100md.com
对重组痘苗病毒VVP1和VVP2表达产物的分析发现，表达的衣壳蛋白VP1或VP2主要存在于细胞中，而不分泌到胞外。研究表明，尽管重组痘苗病毒所表达的产物不分泌，仍可能引起免疫反应[8]。因此，可以应用构建的表达CVB3衣壳蛋白VP1和VP2的重组痘苗病毒直接免疫动物来研究CVB3 VP1和VP2蛋白的免疫原性，并纯化这些衣壳蛋白进行更细的研究。
基金项目：国家自然科学基金
作者简介：彭天庆(1965年-)，浙江乐清人，助理研究员，现为卫生部病毒性心脏病重点实验室主要研究人员、副主任。主要从事病毒性心肌疾病的病原学分子水平诊断、发病机理和治疗等的研究工作，近来致力于CVB基因表达、用重组痘苗病毒制备CVB无毒颗粒和CVB核酸疫苗研究。
参考文献
1 Werner S, Klump W M, Schonke H, et al. Expression of coxsackievirus B3 capsid proteins in Escherichia coli and generation of virus-specific antisera [J] . DNA, 1988, 7: 307-316.
, http://www.100md.com
2 Hohenadl C, Klingel K, and Rieger P, et al. Investigation of the coxsackievirus B3 nonstructural proteins 2B, 2C, and 3AB: generation of specific polyclonal antisera and detection of replicating virus in infected tissue [J] . J Virol Methods, 1994, 47 (3) : 279-295.
3 Miyashita K, Kusumi M, Utsumi R. Expression and purification of recombinant 3C proteinase of CVB [J] . Biosci-Biotechnol-Biochem, 1992 56 (5) : 746-750.
4 杨洁，罗超权.痘苗病毒的结构特点及应用[J].国外医学病毒学分册，1996，3(2)：40-43.
, 百拇医药
5 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual [M] , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989.
6 Urakawa T. Synthesis of immunogenic but noninfectious poliovirus particles in insect cells by a baculovirus expression vector [J] . J Gen Virol, 1989, 70: 1453.
7 李光地，朱浓了，孔玉英，等.完全切除5′非编码区的甲肝全编码区在重组痘苗中的表达[J].生物化学与生物物理学报.1993，25(1)：71-76.
8 Cheng K C, et al. Hepatitis B large surface protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus [J] . J Virol, 1986, 60 (2): 337-344.
收稿日期：1998-11-10；修回日期：1999-02-14, 百拇医药
单位：彭天庆 杨英珍 卫生部病毒性心脏病重点实验室，上海医科大学中山医院，上海 200032；李光地 孔玉英 中国科学院上海生化所，上海 200031
关键词：柯萨奇B3病毒(CVB3)；衣壳蛋白；重组痘苗病毒
病毒学报990405 摘要：将编码柯萨奇B3病毒(CVB3)衣壳蛋白VP1和VP2的基因，分别克隆到具有7.5k启动子的痘苗病毒表达载体pGJP5上；将CVB3衣壳蛋白全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上，并筛选到相应的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP/4/2/3/1。VVP1和VVP2稳定表达产物为CVB3衣壳蛋白VP1和VP2，而VVP/4/2/3/1的产物VP4/2/3/1为一无分泌性的多聚蛋白，且这三种表达产物均属无分泌性蛋白。为了表达成熟的CVB3衣壳蛋白，将去除5′端非编码区的CVB3全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上，利用重组痘苗病毒VT7所提供的T7RNA聚合酶，在哺乳动物细胞中进行了暂时表达研究。Western blot分析提示，VP1、VP2和VP3蛋白得到成熟表达，且发现表达产物具有分泌性。本研究将为今后研究CVB免疫性打下基础。
, http://www.100md.com
中图分类号：R373.2+3；Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0323-07
EXPRESSION OF COXSACKIEVIRUS B3 CODING GENE IN MAMMALIAN CELLS BY RECOMBINANT VACCINIA VIRUS
PENG Tian-qing1, YANG Ying-zhen1, LI Guang-di2, KONG Yu-ying2
(1. Key Laboratory of Viral Heart Diseases, Ministry of Health, Zhong Shan Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China; 2. Shanghai Institute of Biochemistry, Academia Sinica, Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
Abstract: The DNA fragments coding CVB3 capsid protein VP1 and VP2 were put under the control of 7.5k promoter in a vaccinia virus plasmid pGJP5, which were used to screen the recombinant vaccinia viruses VVP1 carrying CVB3 VP1 gene and the VVP2 carrying CVB3 VP2 gene through homology recombination respectively. The VP1 or VP2 protein was able to be observed in Vero cells infected with VVP1 or VVP2 by Western blot, though they were not secreted into the media. Then CVB3 capsid protein VP4/2/3/1 gene was inserted into the vaccinia virus expression plasmid pTM1 on the downstream side of the promoter T7, and the recombinant vaccinia virus VVP4/2/3/1 was constructed through homology recombination. The CVB3 VP4/2/3/1 ploypeptide in Vero cells was found on Western blot using the T7 RNA polymerase encoded by vT7. The results suggest that the mature expression of CVB3 capsid proteins has a strict requirement of the nonstructural region downstream. Thus, the entire coding region of CVB3 genome was introduced into a vaccinia virus expression plasmid pTM1 with the 5' untranslated region totally excluded, under the control of a T7 promoter. The transient expression in mammalian cells was studied using the T7 RNA polymerase encoded by vT7. The CVB3 proteins were able to be detected by ELISA both in the media and in the cells, and the proteins CVB3 VP1, VP2, VP3 in mature forms were all observed on Western blot using antisera against CVB3, CVB3 VP1 protein and CVB3 VP4/2/3 protein respectively. The work will provide basis for future study on the purification and immunological analysis of CVB proteins.
, http://www.100md.com
Key words: Coxsackievirus B3; Capsid proteins; Recombinant vaccinia virus
柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus group B，CVB)属细小RNA病毒，内含单股正链RNA，全长约7 400个核苷酸，含一个阅读框架。CVB病毒基因首先表达分子量为200kD以上的多聚蛋白。最后加工成为病毒颗粒则有赖于病毒自身合成的蛋白裂解酶，而非结构基因的同时表达使多聚蛋白得以最后加工成为颗粒并包入病毒RNA。构成病毒颗粒的蛋白为外壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。目前已有报道将CVB3外壳蛋白基因和非结构蛋白基因在原核细胞表达体系中进行表达[1～3]。但是，迄今为止很少有报道应用真核细胞表达体系研究CVB基因的表达。
以痘苗病毒为载体已成功地表达了许多外源基因[4]，并能对外源基因表达产物正确加工，如能构建成表达外源基因的重组痘苗病毒，则能稳定表达外原基因蛋白，且表达产物不需纯化可直接用于研究其免疫原性等。
, 百拇医药
本文研究CVB3结构蛋白基因和去5′端非编码区CVB3全基因的表达。
材料与方法
1 菌株、病毒株、哺乳动物细胞和质粒 大肠杆菌TG-1、重组痘苗病毒vTT7和痘苗病毒天坛株，pTM1和pGJP5痘苗病毒表达载体，CV-1、HumTK-和Vero细胞，均由中国科学院上海生化所李光地教授提供。pCVB-M1含CVB3全长cDNA的质粒，由德国R.Kandolf教授提供。
2 工具酶 DNA限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶等有关基因操作的酶均为Amersham、Promega或Boehringer产品。
3 主要试剂 测序试剂盒为Pharmacia产品。随机引物、非放射性同位素异羟基洋地黄毒甙配基(DIG)标记核酸探针试剂盒、DNA扩增试剂盒和硝酸纤维素膜(NC膜),均为Boehringer产品。质粒大量提取和纯化试剂盒为QIAGEN产品。
, http://www.100md.com
4 引物 第一组：用于扩增CVB3VP1基因的引物，其序列为上游引物P1：5′GCAAAACAGATCTATGGGTCCAGTGG3′；下游引物P2：5′ATTGTTTCTAGAATGCGCCCGTATTTG3′。第二组：用于扩增CVB3VP2基因的引物，其序列为上游引物P3：5′CCAGGATCCATGTCCCCCACAGTAG3′；下游引物P4：5′GGTGAATTCTCACTGGTGCCCTGC3′。第三组：用于扩增CVB3VP1-4基因的引物，其序列为上游引物P5：5′GACGGATCCATGGGAGCTCAAGTATC3′；下游引物P6：5′ATTGTTTCTAGAATGCGCCCGTATTTG3′。
5 人工合成DNA接头 GCCATGGGAGCT ACGTCGGTACCC含有用于连接的PstⅠ位点、NcoⅠ位点和CVB3第一个翻译起始密码(碱基741)到SacⅠ位点。
6 DNA重组 按“分子克隆”[5]中的方法进行。
, http://www.100md.com
7 哺乳动物细胞的转染 细胞经痘苗病毒天坛株以MOI为0.1(筛选重组痘苗病毒株)或经重组痘苗病毒株vTT7以MOI为10(暂时表达)感染1小时后，用磷酸钙沉淀法进行。
8 病毒DNA抽提、斑点杂交、Southern杂交和表达产物的SDS-PAGE电泳、Western blot检测 参考文献[5]。PCR反应具体操作参考试剂盒说明书。
结果
1 痘苗病毒表达质粒的构建
1.1 pGJP5/VP1和pGJP5/VP2的构建 以含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M1为模板(图1-A)，先后用第一组和第二组两对引物，通过PCR法分别扩增得到了CVB3-VP1和VP2基因片段。VP1基因片段的5′内测端含有BglⅡ位点，3′端含有XbaⅠ位点，将此片段补平并经BglⅡ酶切后克隆入痘苗病毒表达栽体pGJP5中7.5k启动子的下游BamHI和EcoRI酶切点处(EcoRI位点先补平)，组成重组表达质粒pGJP5/VP1(图1-B)。VP2基因片段的5′端含有BamHI位点，3′端含有EcoRI位点，将此片段经BamHI和EcoRI双酶切后克隆入痘苗病毒表达载体pGJP5中7.5k启动子的下游BamHI和EcoRI酶切点处，组成重组表达质粒pGJP5/VP2(图1-C)。所用痘苗表达载体pGJP5含有用于体内重组两段痘苗TK基因片段。
, 百拇医药
图1 含CVB3基因的重组痘苗表达质粒的构建图
(A)-(E)为CVB3基因和各重组表达质粒。
Figure 1 Construction of recombinant vaccinia virus expressing plasmid containing CVB3 gene
(A)-(E): CVB3 gene fragment and vaccinia virus expressing plasmids.
1.2 pTM1/cvb和pTM1/P1的构建 为了获得完成切除5′端非编码区后的CVB3病毒全基因，我们将含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M1利用共有的限制性内切酶位点进行重新拼接(图1-E)。pCVB3-M1经PstI和BglⅡ双酶切得到的CVB 3 590-2 041片段(S1)插入pUC9中的PstI和BamHI位点，成为pUC9/1。将人工合成的12个核苷酸双链的接头通过PstI和SacI位点定向插入质粒pUC9/1，成为pUC9/2，并经核苷酸测序验证。此合成接头包含了NcoI位点和CVB3第一个翻译起始密码(碱基741)到SacI位点(碱基745)。pUC9/2上的CVB3片段通过NcoI和XhoI双酶解，同时定向插入已经NcoI和XhoI双酶解打开的pTM1上，得到含完成切除5′端非编码区后CVB3基因片段S1的质粒pTM1/S1。将pCVB3-M1的EcoRI位点打开并补平后，在XhoI位点处解开，并分离得到0.7kb长的CVB3基因(S2)。将此片段定向插入经XhoI和StuI双酶解打开的pTM1/S1上，成为pTM1/S2。然后，在pCVB3-M1上分离得到两端含EcoRI位点的CVB3片段S3(2 700-7 400)，并定向插入到经EcoRI打开的pTM1/S2上，最后得到的pTM1/cvb为包含有完成切除5′端非编码区后的CVB3完整的开放阅读框架。
, 百拇医药
以含有CVB3全基因的质粒pCVB3-M为模板，用第三组引物通过PCR法扩增得到了CVB3-VP1-4基因片段。将该VP4/2/3/1基因片段两端补平后用XhoI进行酶切分离得到小片段，并将其定向插入到经XhoI和StuI双酶解打开的pTM1/S1上，得到含CVB3衣壳蛋白全基因的表达质粒pTM1/P1(图1-D)。所用痘苗表达载体pTM1含有T7启动子和转录终止密码，以及用于体内重组的两段痘苗TK基因片段。
2 带有CVB3基因重组痘苗病毒的构建
CV-1细胞经天坛株痘苗病毒感染后，按磷酸钙沉淀法转染重组痘苗表达质粒。培养48小时后，收集细胞并进行空斑法筛选[7]。筛选到含CVB3VP1基因的重组痘苗病毒VVP1、含CVB3VP2基因的重组痘苗病毒VVP2和含CVB3VP4/2/3/1基因的重组痘苗病毒VVP4/2/3/1。重组痘苗病毒的PCR和Southern杂交鉴定结果如图2所示。VVP1DNA、VVP2DNA、VVP4/2/3/1分别在0.85kb、0.80kb、2.5kb位置附近有阳性信号出现，而对照天坛株痘苗病毒DNA无任何阳性信号。这些均证明：CVB3VP1基因、CVB3VP2基因和CVB3VP4/2/3/1基因已被正确地整合到各自的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP4/2/3/1的基因组中。
, 百拇医药
图2 VVP1、VVP2和VVP4/2/3/1的PCR和Southern blot鉴定
A和C为PCR产物凝胶电泳；B和D为PCR产物的Southern blot结果；a为Marker，λDNA/HindⅢ+EcoRI；b为痘苗病毒天坛株DNA；c为VVP1 DNA；d为VVP2 DNA；e为VVP4/2/3/1 DNA；f为痘苗病毒天坛株DNA。
Figure 2 Identification of recombinant vaccinia viruses VVP1, VVP2 and VVP4/2/3/1 by PCR and Southern blot
A and C: Electrophoresis of PCR products; B and D: Southern blot of PCR products；a. DNA marker; b. Vaccinia virus Tian Tan strain DNA;c. VVP1 DNA; d. VVP2 DNA; e. VVP4/2/3/1 DNA;f. Vaccinia virus Tian Tan strain DNA.
, 百拇医药
3 重组痘苗病毒的稳定表达和分析
VVP1或VVP2以MOI为2感染Vero细胞，vT7重组痘苗病毒以MOI为10和VVP4/2/3/1重组痘苗病毒以MOI为1双重感染Vero细胞，48小时后收获细胞。对细胞裂解液进行Western blot检测，以天坛痘苗病毒感染细胞作阴性对照。结果如图3所示：VVP1感染Vero细胞在35kD附近处有一特异条带；VVP2感染Vero细胞在34kD附近处有一特异条带；vTT7和VVP4/2/3/1双感染Vero细胞在100kD附近处有一特异条带，此条带相当于CVB3VP4/2/3/1蛋白质分子量。所有细胞培养上清液均未见特异条带。
图3 重组痘苗病毒稳定表达产物的Western blot分析
A.用抗CVB3抗血清检测VVP4/2/3/1的表达产物；B.用抗CVB3VP1抗血清检测VVP1的表达产物；C.用抗CVB3 VP4/2/3抗血清检测VVP2的表达产物；a.为重组痘苗病毒感染的Vero细胞；b.为痘苗病毒天坛株感染的Vero细胞。
, http://www.100md.com
Figure 3 Western blot analysis of stably expressed products of recombinant vaccinia viruses
A. Detection of VVP4/2/3/1 expressed products using specific antisera against CVB3;B. Detection of VVP1 expressed products using specific antisera against CVB3 VP1 protein;C. Detection of VVP2 expressed products using specific antisera against CVB3 VP4/2/3；a. Recombinant vaccinia virus infected Vero cells;b. Vaccinia virus Tian Tan strain infected Vero cells.
, 百拇医药
4 重组表达质粒pTM1/cvb的暂时表达及分析
vTT7重组痘苗病毒能提供T7启动子工作所必需的T7RNA聚合酶。CV-1细胞经vTT7重组痘苗病毒感染1小时后，重组质粒按磷酸钙沉淀法转染哺乳动物细胞，48小时培养后，收获上清液和细胞供以下检测。
4.1 ELISA法检测 用双抗体夹心ELISA检测上清液和细胞裂解液中CVB3抗原(马抗CVB3抗血清包板，小鼠抗CVB3抗血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗)的OD值，以P/N值大于2.1为阳性标准。以培养的CVB3病毒作正对照，为0.58；pTM1转染vTT7感染后的细胞作负对照，分别为0.025和0.036。在共转染后的CV-1上清液和细胞裂解液中均检测到CVB3抗原，分别为0.154和0.247。
4.2 细胞裂解液的Western blot检测 结果如图4所示：在27kD、35kD(小鼠抗CVB3抗血清作一抗)处，在35kD(兔抗CVB3 VP1抗血清作一抗)处，在27kD、34kD和40kD处(兔抗CVB3 VP2/3/4抗血清作一抗)，都出现明显的特异条带。27kD左右条带与CVB3 VP3蛋白相符，34kD条带与CVB3 VP2蛋白相符，35kD左右条带与CVB3 VP1蛋白相符，40kD左右的条带与CVB3 VP0大小相符。
, 百拇医药
图4 重组质粒pTM1/cvb暂时表达的Western blot分析
1.蛋白质标准物；2.用抗CVB3 VP1抗血清检测；3.用抗CVB3抗血清检测；4.用抗CVB3 VP4/2/3抗血清检测。
Figure 4 Analysis of transient expressed products of recombinant plasmid pTM1/cvb by Western blot
1. Protein marker;2. Detection by using specific antisera against CVB3 VP1 protein;3. Detection by using specific antisera against CVB3;4. Detection by using specific antisera against CVB3 VP4/2/3.
, 百拇医药
讨论
本文研究了CVB3结构蛋白基因和去5′端非编码区CVB3全基因的表达，结果发现：CVB3衣壳蛋白全基因能够在痘苗病毒表达体系中得到表达，但产物为一多聚蛋白前体。可见要使衣壳蛋白全基因在哺乳动物细胞中正常表达，合适的加工序列是必不可少的，哺乳动物细胞本身不具备将CVB3衣壳蛋白多聚蛋白前体加工成成熟的衣壳蛋白。去除5′非编码区的CVB3全编码基因在痘苗病毒表达体系中有效表达，以及表达产物的分析结果表明：CVB3非结构蛋白的同时表达对衣壳多聚蛋白加工是必不可少的，而5′非编码区的去除，对CVB3全编码基因各衣壳蛋白的成熟后加工没有影响。今后可以应用该系统方法进一步研究CVB非结构蛋白对CVB成熟颗粒的加工规律。由于同属于细小RNA病毒的脊髓灰质炎病毒和甲肝病毒，它们的全部开放阅读框架分别在重组昆虫病毒系统和重组痘苗病毒系统中表达，已获得了有良好的免疫原性和无感染性的空壳颗粒[6，7]。本研究结果也提示我们，构建的重组痘苗病毒VT7cvb可能会表达成熟的CVB3空壳颗粒，如能进一步研究证实，那么这种重组痘苗病毒产生的空壳颗粒或亚病毒颗粒，经过一定的分离纯化后，无论是作为抗原应用于诊断试剂，还是作为免疫原研制成基因工程CVB疫苗，在免疫原性及安全性方面将显示其优势。有关的研究正在进行之中。
, http://www.100md.com
对重组痘苗病毒VVP1和VVP2表达产物的分析发现，表达的衣壳蛋白VP1或VP2主要存在于细胞中，而不分泌到胞外。研究表明，尽管重组痘苗病毒所表达的产物不分泌，仍可能引起免疫反应[8]。因此，可以应用构建的表达CVB3衣壳蛋白VP1和VP2的重组痘苗病毒直接免疫动物来研究CVB3 VP1和VP2蛋白的免疫原性，并纯化这些衣壳蛋白进行更细的研究。
基金项目：国家自然科学基金
作者简介：彭天庆(1965年-)，浙江乐清人，助理研究员，现为卫生部病毒性心脏病重点实验室主要研究人员、副主任。主要从事病毒性心肌疾病的病原学分子水平诊断、发病机理和治疗等的研究工作，近来致力于CVB基因表达、用重组痘苗病毒制备CVB无毒颗粒和CVB核酸疫苗研究。
参考文献
1 Werner S, Klump W M, Schonke H, et al. Expression of coxsackievirus B3 capsid proteins in Escherichia coli and generation of virus-specific antisera [J] . DNA, 1988, 7: 307-316.
, http://www.100md.com
2 Hohenadl C, Klingel K, and Rieger P, et al. Investigation of the coxsackievirus B3 nonstructural proteins 2B, 2C, and 3AB: generation of specific polyclonal antisera and detection of replicating virus in infected tissue [J] . J Virol Methods, 1994, 47 (3) : 279-295.
3 Miyashita K, Kusumi M, Utsumi R. Expression and purification of recombinant 3C proteinase of CVB [J] . Biosci-Biotechnol-Biochem, 1992 56 (5) : 746-750.
4 杨洁，罗超权.痘苗病毒的结构特点及应用[J].国外医学病毒学分册，1996，3(2)：40-43.
, 百拇医药
5 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual [M] , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989.
6 Urakawa T. Synthesis of immunogenic but noninfectious poliovirus particles in insect cells by a baculovirus expression vector [J] . J Gen Virol, 1989, 70: 1453.
7 李光地，朱浓了，孔玉英，等.完全切除5′非编码区的甲肝全编码区在重组痘苗中的表达[J].生物化学与生物物理学报.1993，25(1)：71-76.
8 Cheng K C, et al. Hepatitis B large surface protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus [J] . J Virol, 1986, 60 (2): 337-344.
收稿日期：1998-11-10；修回日期：1999-02-14, 百拇医药