应用异源双链泳动分析法快速确定(HIV-1)基因亚型
作者：姚均 潘品良 邢辉 赵全壁 张峰 苏玲 陈秀珠 邵一鸣
单位：姚均 潘品良 邢辉 赵全壁 苏玲 邵一鸣 卫生部艾滋病预防与控制中心艾滋病参比实验室，北京 100050；张峰 新疆自治区卫生防疫站，新疆乌鲁木齐830001；陈秀珠 同济医科大学微生物学教研室，湖北 武汉 430030)
关键词：HIV-1；亚型；HMA；序列测定；系统树
病毒学报990402 摘要：应用异源双链泳动分析法(Heterouduplex mobility assay，HMA)，对来自我国云南、四川、新疆、浙江、广东、福建、天津7省市73份HIV感染者样品，进行了HIV-1膜蛋白(env)基因片段亚型分析。通过HMA能确定亚型的有70份，占样品总数的95.89%(70/73)。其中A亚型2.86%(2/70)，F亚型2.86%(2/70),泰国B亚型18.58%(13/70)，欧美B亚型8.56%(6/70),C亚型38.57%(27/70)，E亚型28.57%(20/70)。为了检验结果的准确性和探讨3份样品不能用HMA分型的原因，进一步对样品进行序列测定和系统树分析，并将两者结果的相互比较，两者对HIV-1分型显示出高度的一致性，其亚型一致率达95.89%(70/73)。而3份样品不能确定亚型的原因主要是，其env基因区段与相应的参考亚型质粒毒株相比变异太大。这提示，为了提高HMA分型的敏感性，应不断地选择代表性好的毒株构建参考亚型质粒。
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中图分类号：R512.91；Q78 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0296-09
RAPID GENETIC SUBTYPING OF HIV-1 USING A HETERODUPLEX MOBILITY ASSAY (HMA)
YAO Jun1, PAN Pin-liang1, XING Hui1, ZHAO Quan-bi, ZHANG Feng2,SUN Ling1 CHEN Xiu-zhu3, SHAO Yi-ming
(1. National AIDS Reference Laboratory, Center for AIDS Prevention and Control, Ministry of Health, Beijing 100050, China; 2. Epidemic Prevention Station of Xinjiang Autonomous Region, Xinjiang, Wulumuqi 830030, China; 3. Department of Microbiology, Tongji Medical University, Hubei, Wuhan 430030, China)
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Abstract: We investigated the DNA fragment diversity of HIV-1 env gene by means of heteroduplex mobility assay (HMA) genotyping. Samples of 73 HIV-1 infected individuals from Yunnan, Sichuan, Xinjiang, Zhejiang, Guangdong, Fujian and Tianjing of our country were studied. The HMA had successfully genotyped 95.89% (70/73) of these samples as follows: 2.86% (2/70) subtype A, 2.86% (2/70) subtype F, 18.58% (13/70) subtype Thailand B, 8.56% (6/70) subtype USA B, 38.57% (27/70) subtype C and 28.57% (20/70) subtype E. In order to test the reliability of these results and analyse the reason of failure to genotyping three samples by HMA, these strains were sequenced and phylogenetically analysed, and the results showed a perfect concordance with the HMA, the concordance rate was 95.89% (70/73). Reason of being unable to genotype three samples by HMA is that they were highly divergent subtype as compared to related reference strains. It suggests that, to improve reliability of HMA, the representative reference subtype plasmid selection must be continuously revised to cover viral diversification.
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Key words: Human immunodeficiency virus type 1; Subtype; Heleroduplex mobility assay (HMA); Sequencing; Phylogenetic tree
人类免疫缺损病毒(HIV)最显著的生物学特点之一就是其基因的高度变异性。此一源于其复制的生物学特点，使HIV在传播过程中产生出许多具有相对独立的基因序列特性的亚型(subtype)，并在全球范围的流行蔓延过程中形成了一定的地区性分布特点[1]。根据HIV-1基因组中变异性最大、同时也被研究得最多的膜蛋白基因(env)核酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A～H和O至少9种HIV-1亚型。各亚型间基因核苷酸序列的差异较大，A～H 亚型间的差异一般在20%～35%的范围，而O亚型与A～H各亚型间的差异则高达50%以上[2，3]。
HIV-1基因的高度变异性是AIDS疫苗研制的一个较大障碍。因此分离和鉴定感染人群中HIV-1亚型的分布特点并监测其变化过程，是研制有针对性的HIV-1疫苗的必需课题，也是广泛开展HIV-1生物学研究的基础[1]。同时， 对HIV-1基因变异和地区分布的分析，又是分子流行病学研究的重要内容。通过这些研究，使我们有可能追寻其传播的来源、途径和发展趋势，为卫生管理部门制定相应的预防控制措施提供科学依据。
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目前，用于HIV分型的方法主要有DNA直接序列测定法[4]、血清法[5]、核酸探针法[6]及异源双链泳动分析法(Heteroduplex Mobility Assay，HMA)[7]。DNA序列测定法特异、准确，但需要专门测序仪，且技术要求高、费用高。对大量样品进行分析不易普及。血清法分型因不同基因亚型抗体间存在交叉反应，结果与基因分型不完全一致。用它对基因变异进行分析时准确性较低。所以，不能完全反映体内基因变异情况。异源双链泳动分析法是由华盛顿大学Mullins教授在HIV基因变异分析中建立的一种方法，操作简单、省时，适用于大规模样品的分析。此方法自建立以来，已在全球HIV分离鉴定网上广泛用于HIV-1分型。利用这种方法，我们对来自1997和1998年我国云南、四川、新疆、浙江、广东、福建、天津等地的73份HIV-1阳性样品进行分型。然后又进一步进行序列测定和系统树分析，并且将二者的结果进行了比较。
材料与方法
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1 研究对象和样品 所有研究对象的样品均来自上述7省市HIV-1感染者的送检样品，经蛋白印迹法已确证为阳性者。从每位对象采集5ml全血，肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗2遍后，使用Qiagen公司QiAamp Blood试剂，按说明书操作提取细胞DNA，核酸样品冻存于-20℃。
2 PCR 采用套式PCR方法扩增HIV-1 env基因，引物及对照质粒由Mullins教授惠赠(表1和表2)。以ED3/ED14为外侧扩增引物进行第一轮PCR反应，条件为94℃2分钟，55℃1分钟，72℃3分钟，3个循环；94℃30秒，55℃45秒，72℃3分钟，32个循环；72℃延伸5分钟。取2μl PCR产物或1μl对照质粒，以ED5/ED12为内侧引物进行第二轮PCR，条件为94℃2分钟，55℃1分钟，72℃3分钟，3个循环；94℃30秒，55℃45秒，72℃2分钟，32个循环；72℃延伸5分钟。取5μl PCR产物经1%琼脂糖电泳，与Marker及阴性和阳性对照对比，判断结果。未扩增出特异产物的样品用ED5/ED12为外侧引物，ES7/ES8为内侧引物进行扩增，结果如仍然是阴性的话，变更扩增条件如下：开始5个循环采用的复性温度为52℃或45℃，接下来的30个循环仍然采用上述标准扩增条件。
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表1 引物序列及其在HIV-1基因组中的位置
Table 1 Primer sequences and their location in the HIV-1 genome 引物
Primer
序列
Sequence(5′-3′)
在HIV-1基因组中的位置
Location in the HIV-1 genome
扩增片段长度
Length of amplified fragment
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ED3
TTAGGCATCTCCTATGGC-
AGGAAGAAGCGG
5 956～5 985*
ED14
TCTTGCCTGGAGCTGCTT-
GATGCCCCAGAC
7 960～7 931*
2 004bp
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ED5
ATGGGATCAAAGCCTAAA-
GCCATGTC
6 556～6 581
ED12
ATGGCTTCCTGCTGCTCC-
CAAGAACCCAAG
7 822～7 792*
1 266bp
ES7
tgtaaaacgacggccagtC
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TGTTAAATGGCAGTCTAGC
7 001～7 020*
ES8
caggaaacagctatgacc
CACTTCTCCAATTGTCCCTCA
7 667～7 647*
666bp
注：*来自于HIV-1 HXB2基因库。
小写字母表示与M13正向或反向引物的互补序列，用作PCR产物测序引物。
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Notes: * Derived from HIV-1 HXB2 GeneBank.
The small letters denote the complementary seguences to M13 positively and negatively oriented primers.表2 HIV-1包膜参考亚型质粒
Table 2 HIV-1 envelope subtype references 亚型
Subtype
HIV-1株
HIV-1 strain
来源国家
Originated from
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克隆片段
Cloned fragment
质粒载体
Plasmid vector
药物抗性
DrugR
A
RW20
Rwanda
gp160
PCR2
Kan/Amp
, 百拇医药
B1
BR20
Brazil
gp160
PCR2
Kan/Amp
B2
TH14
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
B3
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SF162
USA
6.6Kb3’
PUC19
Amp
C
IN868
India
ED5-ED12
PCR1
Kan
D
UG21
, 百拇医药
Uganda
gp120
PCR2
Kan/Amp
E
TH22
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
E
TH06
Thailand
, 百拇医药
gp160
PCR2
Kan/Amp
F
BZ163
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
G
RU131
Russia
ED5-ED12
, 百拇医药
PUC18
Amp
3 异源双链泳动分析(HMA)
3.1 异源双链的形成 在1个500μl Eppendorf管中加入5μl第二轮PCR产物(约100～250ng DNA)，5μl对照质粒的PCR产物(或H2O)，1.1μl异源双链体杂交液(Heteroduplex annealing buffer，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris pH7.8，2mmol/L EDTA)，94℃水浴2分钟，迅速置于冰浴中10分钟。
加入1/5体积的5×点样缓冲液(25%Ficoll，1%Orange G)，点样至5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(30：0.8 acrylamide：bisacrylamide)，胶厚1.5mm，胶面为17.5×15cm的V16垂直冷凝电泳槽(北京六一厂)，电泳液用1×TBE(88mmol/L Trisorate，89mmol/L borate，2mmol/L EDTA)。电泳条件如下：分析用ED5/ED12扩增的1.25kb片段，采用200V电压，电泳6小时；分析用ES7/ES8扩增的0.7kb片段，采用250V电压，电泳3小时，电泳结束，将凝胶侵入0.5μg/ml溴化乙锭中染色1小时，在紫外灯下观察结果。
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3.2 异源双链体泳动率的测定及亚型的确定 根据样品与某一亚型的对照质粒形成的异源双链体泳动率最快，则可确定该样品为其相应亚型。
4 DNA序列测定及系统树分析
4.1 PCR产物的纯化 第二轮PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。
4.2 DNA序列测定 以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末段终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，样品用量约1μg，引物用量6pmol，反应产物经提纯后用ABI公司377型DNA序列测定仪进行序列测定。
4.3 系统树分析 测得的序列用SedEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区的最终序列的确定是根据两个正向或反向测序引物所测结果重叠校核后而定的。序列的同源性分析及亚型确定是使用Phylip[8]软件包完成。具体包括：用Clustal W程序对样品与国际标准序列进行排列和比较；用DNADIST程序计算一组序列间的基因离散率；用Neighbor-joining程序做系统树(phylogenetic tree)；bootstrap分析选用100来表达Neighbor-joining系统树上各序列之间的关系。
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结果
1 HMA分型结果
到目前为止，在我国流行的HIV-1主要是B、C、E三种亚型，因此，首先把73份样品与TH14、SF162、IN868、TH22及TH06这五种参考亚型的质粒进行比较，66份样品可经HMA确定其亚型。其余7份不能分型的样品，则结合流行病学调查资料(有的曾去过非洲一些国家，有的既有静脉注射毒品史又有性乱史)，将它们与RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163等亚型参考质粒进行比较，结果证实，标本ju01、bj11是A亚型，gd17、gd18为F亚型。而sc12从HMA结果看很难确定它是D亚型或是B1亚型，bj05和fi08则根本不能确定其亚型。图1列出了bj11、sd7、yn03、xj159和fj06标本666bp和gd17标本1 266bp扩增片段的HMA结果。全部73份样品通过HMA能确定亚型的有70份，占样品总数的95.89%(70/73)。其中C亚型占38.57%(27/70)，E亚型占28.57%(20/70)，泰国B亚型占18.58%(13/70)，欧美B亚型占8.56%(6/70)，A、F亚型各为2.86%(2/70)。
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图1 标本bj11、sd7、yn03、xj159、fj06的666bp及gd17的1266bp扩增片段的HMA结果
1.1～6依次为标本bj11与H2O，对照质粒RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163的杂交，结果为A亚型;
2.1～6依次为标本sd7与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为B2亚型;
3.1～6依次为标本yn03与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为B3亚型;
4.1～6依次为标本xj159与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为C亚型;
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5.1～6依次为标本fj06与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为E亚型;
6.1～6依次为标本gd17与H2O，对照质粒RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163的杂交，结果为F亚型;
7. DNA分子量标准(λ/EcoRI/HindⅢ)。
Figure 1 HMA results of 666bp or 1266bp products of specimen bj11，sd7，yn03，xj159，fj06 and gd17
1.1-6 Hybridization results of sample bj11 with H2O, RW20, BR20, UG21, RU131, BZ163 is A subtype;
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2.1-6 Hybridization results of sample sd7 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is B2 subtype;
3.1-6 Hybridization results of sample yn03 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is B3 subtype;
4.1-6 Hybridization results of sample xj159 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is C subtype;
5.1-6 Hybridization results of sample fj06 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06, is E subtype;
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6.1-6 Hybridization results of sample gd17 with H2O, RW20, BR20, UG21, RU131, BZ163 is F subtype;
7 DNA Marker (λ/EcoRI/HindⅢ).
2 测序后用系统树分型结果
如图2系统树所显示，整个73份样品大致可分为6组：第一组2个毒株与A亚型毒株聚集在一起，属A亚型；第二组只有sc12一个样品与D亚型毒株序列聚集在一起，属D亚型；第三组可进一步分为二枝，第一枝的15个样品与B2亚型毒株序列聚集在一起，属泰国B亚型，第二枝的6个样品与B3亚型毒株序列聚集在一起，属欧美B亚型；第四组27个样品与C亚型毒株聚集在一起，属C亚型；第五组gd17、gd18二个样品与F亚型毒株聚集在一起，属F亚型；第六组20个样品与E亚型毒株聚集在一起属E亚型。
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图2 73份样品env基因的C2-V3区306bp核苷酸序列
经Phylip软件包内的Neighbor方法构建成的系统树，加方框的是HMA中各参考亚型毒株
Figure 2 Phylogenetic analysis based on 306bp nucleotide sequences of the C2-V3 region of the env gene in seventy-three specimens
It was created with Neighbor of Phylip.HMA subtype references are enclosed by boxes.
3 比较HMA分型与序列测定结果所做的系统树分析
表2列出了73份标本HMA分型和序列测定分型的比较，两者结果的一致率为95.89%(70/73)，与文献报道的94%、97%相近[9]。各亚型的一致率是：B亚型90.48%(19/21)，A、C、E和F亚型均是100%，但A、F亚型因样品数太少不能说明问题。有3份样品用HMA无法判定结果，标本sc12序列测定结果为D亚型，系统树上也清楚地显示与UG21聚成一组。而用ES7-ES8引物扩增产物所做的HMA均为D/B1亚型。标本bj05与fj08序列测定结果均为B2亚型，而用ES7-ES8物扩增产物所做的HMA因为条带太乱很难判定其亚型。用HMA不能确定其亚型的可能原因有：第一，病毒株本身有较大的差异，基因组结构中存在较大片段的插入和缺失；第二，双重感染或多重感染造成重组毒株[7]。对照系统树看，HMA不能确定亚型的两个样品bj05与fj08，在系统树中的分枝和同型的其它毒株与标准亚型距离比确实更远。这从一个方面反映了这两个毒株内的基因变异较为复杂。对sc12的进一步分析发现，它距B和D的参考亚型BR20和UG21的基因离散率分别为18.72%和18.79%，反映在HMA条带上样品与B1和D所形成的异源双链与各自的同源双链距离相近，因此，很难确定其亚型。
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表3 HMA分型与序列测定分型的比较
Table 3 Comparison of HMA and sequencing for HIV-1 subtyping 序号
Serial
number
样品号
Subject code
PCR
ED5-
ED12
HMA分型结果
HMA subtype
, 百拇医药
ES7-ES8
序列测定亚型
Sequence
subtype
备注
Notes
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
01
fi01
1
E
E
02
fi02
2
E
E
03
fi03
1
C
, 百拇医药
C
04
fi04
1
E*
E
05
fi05
1
E
E
06
fi06
, 百拇医药
2
E
E
07
fi07
2
E
E
08
fi08
2
B2
Can not be subtyped by HMA
, 百拇医药
09
ju01
1
A
A
10
bj01
1
B2
B2
11
bj02
1
B2
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B2
12
bj04
1
B2
B2
13
bj05
2
B2
Can not be subtyped by HMA
14
bj11
, 百拇医药
2
A
A
15
bj12
1
E
E
16
bj19
2
E
E
17
, 百拇医药
tj01
2
B2
B2
18
tj02
2
B2
B2
19
tj03
1
C
C
, 百拇医药
20
sc01
1
C
C
21
sc02
2
E
E
22
sc05
1
B2
, 百拇医药
B2
23
sc06
1
C
C
24
sc08
2
C
C
25
sc12
3*
, 百拇医药
B1/D*
B1/D*
D
Can not be subtyped by HMA
26
sc13
1
B2
B2
27
sc16
1
, 百拇医药
B2
B2
1
2
3
4
5
6
7
28
sc17
1
B3
B3
, 百拇医药
29
sc18
1*
B3*
B3
30
gs02
1
C
C
31
gs04
1
, 百拇医药
C
C
32
gs05
1
C
C
33
qh01
1
C
C
34
qh02
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1
C
C
35
xj159
2
C
C
36
xj160
2
C
C
37
, http://www.100md.com
xj163
2
C
C
38
xj166
2
C
C
39
xj170
2
C
C
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40
xj192
2
C
C
41
xj194
2
C
C
42
sd6
2
B2
, 百拇医药
B2
43
sd7
2
B2
B2
44
sd8
2
B2
B2
45
sd10
1
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B2
B2
46
sd11
2
C
C
47
sd12
1
B2
B2
48
yn01
, 百拇医药
1
C
C
49
yn02
1
B3
B3
50
yn03
2
B3
B3
51
, 百拇医药
yn04
1
B3
B3
52
yn07
1
C
C
53
yn08
1
C
C
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54
yn09
1
B3
B3
55
zhj03
1
C
C
56
zhj06
1
C
, 百拇医药
C
57
zhj07
1
C
C
58
zhj09
1
C
C
59
zhj13
1
, 百拇医药
C
C
60
gd01
2
E
E
61
gd02
1
E
E
62
gd04
, 百拇医药
2
E
E
63
gd07
1
E
E
64
gd08
1
E
E
65
, 百拇医药
gd17
1
F
F
66
gd18
1
F
F
67
sz01
1
E
E
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68
sz02
1
E
E
69
sz05
1
E
E
70
sz15
1
E
, 百拇医药
E
71
sz24
1
E
E
72
sz27
1
C
C
73
sz31
1
, 百拇医药
E
E
备注：1.表示在标准扩增条件下，用ED5-ED12作第二轮PCR引物，成功扩增1 266bp片段。
2.表示在标准扩增条件下，用ES7-ES8作第二轮PCR引物，成功扩增666bp片段。
3.表示在标准扩增条件下，用ED5-ED12和ES7-ES8作第二轮PCR引物，成功扩增出1 266bp及666bp片段。
*表示在标准扩增条件下，扩增失败，而变更扩增条件为开始5个循环采用的复性温度52℃或45℃，接下来的30个循环仍然采用与以上相同的标准扩增条件。
Notes：1. The 1,266bp fragment was amplified by the second round PCR using ED5-ED12 primers under the conditions described.
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2. The 666bp fragment was amplified by the second round PCR using ES7-ES8 primers under the conditions described.
3. The 1,266bp and 666bp fragments were amplified by second round PCR using ED5-ED12 and ES7-ES8 primers under the conditcans described.
The PCR conditions were modified as that described in “methods and materials 2".
讨论
本实验结果进一步证明，异源双链泳动分析是确定HIV基因亚型的一种新的、快速、简便、可靠的方法。HMA用于HIV分型的主要原理是基于DNA分子的变性和复性过程。当双链DNA分子被加热到100℃左右，两条互补链分离，此即变性作用；在适当温度、盐离子浓度作用下，变性的DNA能够通过碱基配对而重新形成双螺旋，此即复性作用。同时，如在溶液中存在二种或二种以上具有一定同源性的核酸分子，在适当的盐离子浓度下，通过上述变性、复性过程，不同来源的两链的同源区域可借碱基配对形成双链，此即异源双链。异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，在链内局部可形成凸起(bulges)或泡(bubble)，分子构象发生改变[10]。而在非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳中，DNA分子相对迁移率不仅与DNA分子大小有关，而且与其构象有关。这样，在PCR反应中采用同一对引物，从不同来源扩增得到的DNA片段，通过变性、复性后，尽管可以形成大小相同的同源双链与异源双链，但由于异源双链中有构象改变，所以，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，与同源双链泳动速率相比，异源双链电泳速度慢，迁移距离较短。异源双链泳动速度与其双链同源性成正比，同源性越高，泳动越快。亚型的确定正是根据样品与某一亚型形成的异源双链体的泳动率最快，确定该样品为其相应的亚型。HMA操作虽相对简单，但为了保证实验的稳定性、重复性和特异性，每次实验应有严格的质量控制，包括设立样品自身杂交作对照，PAGE条件要相对恒定，电泳装置、凝胶浓度及缓冲液、电泳时间、电压都要一致。同时，电泳温度越高，异源双链体的泳动率越慢，因此需要冰浴条件下电泳。
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根据我们的实验结果，在实际对一个地方流行的HIV-1毒株进行分型时，可遵循下列步骤：(1)选用合适的引物和最佳扩增条件(见材料与方法)；(2)结合以前分子流行病学资料，首先选用与本地区流行亚型相应的标准亚型质粒进行实验，若未能分型，则结合现场流行病调查结果选用研究对象曾去过的国家和地区流行的标准亚型质粒作为对照进行分型；若仍不能确定其亚型，则进行(3)DNA序列测定和系统树分析。
另外，由于HIV始终处于一种持续和动态变异过程中[11]，因此为了提高HMA分型的敏感性，用于HMA分型的标准亚型质粒应根据各地区实际情况不断增加[12]。目前，我们已经通过筛选流行于我国境内的与各自亚型共享序列最接近的毒株作为代表株，构建我国HIV-1各亚型的标准质粒用于HIV-1分型[13]。
作者简介：姚均(1964-)，男(苗族)，湖南吉首市人，助理研究员，医学硕士，主要从事艾滋病基础与临床方面的研究。现在工作单位：北京地坛医院艾滋病临床研究中心。
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参考文献
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13 肖瑶，姚均，陈刚，等.克隆中国BCE亚型的HIV-1代表株建立适于我国流行株的异源双链泳动分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，1999，13(1)：33-36.
收稿日期：1999-01-05；修回日期：1999-04-28, 百拇医药
单位：姚均 潘品良 邢辉 赵全壁 苏玲 邵一鸣 卫生部艾滋病预防与控制中心艾滋病参比实验室，北京 100050；张峰 新疆自治区卫生防疫站，新疆乌鲁木齐830001；陈秀珠 同济医科大学微生物学教研室，湖北 武汉 430030)
关键词：HIV-1；亚型；HMA；序列测定；系统树
病毒学报990402 摘要：应用异源双链泳动分析法(Heterouduplex mobility assay，HMA)，对来自我国云南、四川、新疆、浙江、广东、福建、天津7省市73份HIV感染者样品，进行了HIV-1膜蛋白(env)基因片段亚型分析。通过HMA能确定亚型的有70份，占样品总数的95.89%(70/73)。其中A亚型2.86%(2/70)，F亚型2.86%(2/70),泰国B亚型18.58%(13/70)，欧美B亚型8.56%(6/70),C亚型38.57%(27/70)，E亚型28.57%(20/70)。为了检验结果的准确性和探讨3份样品不能用HMA分型的原因，进一步对样品进行序列测定和系统树分析，并将两者结果的相互比较，两者对HIV-1分型显示出高度的一致性，其亚型一致率达95.89%(70/73)。而3份样品不能确定亚型的原因主要是，其env基因区段与相应的参考亚型质粒毒株相比变异太大。这提示，为了提高HMA分型的敏感性，应不断地选择代表性好的毒株构建参考亚型质粒。
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中图分类号：R512.91；Q78 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)04-0296-09
RAPID GENETIC SUBTYPING OF HIV-1 USING A HETERODUPLEX MOBILITY ASSAY (HMA)
YAO Jun1, PAN Pin-liang1, XING Hui1, ZHAO Quan-bi, ZHANG Feng2,SUN Ling1 CHEN Xiu-zhu3, SHAO Yi-ming
(1. National AIDS Reference Laboratory, Center for AIDS Prevention and Control, Ministry of Health, Beijing 100050, China; 2. Epidemic Prevention Station of Xinjiang Autonomous Region, Xinjiang, Wulumuqi 830030, China; 3. Department of Microbiology, Tongji Medical University, Hubei, Wuhan 430030, China)
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Abstract: We investigated the DNA fragment diversity of HIV-1 env gene by means of heteroduplex mobility assay (HMA) genotyping. Samples of 73 HIV-1 infected individuals from Yunnan, Sichuan, Xinjiang, Zhejiang, Guangdong, Fujian and Tianjing of our country were studied. The HMA had successfully genotyped 95.89% (70/73) of these samples as follows: 2.86% (2/70) subtype A, 2.86% (2/70) subtype F, 18.58% (13/70) subtype Thailand B, 8.56% (6/70) subtype USA B, 38.57% (27/70) subtype C and 28.57% (20/70) subtype E. In order to test the reliability of these results and analyse the reason of failure to genotyping three samples by HMA, these strains were sequenced and phylogenetically analysed, and the results showed a perfect concordance with the HMA, the concordance rate was 95.89% (70/73). Reason of being unable to genotype three samples by HMA is that they were highly divergent subtype as compared to related reference strains. It suggests that, to improve reliability of HMA, the representative reference subtype plasmid selection must be continuously revised to cover viral diversification.
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Key words: Human immunodeficiency virus type 1; Subtype; Heleroduplex mobility assay (HMA); Sequencing; Phylogenetic tree
人类免疫缺损病毒(HIV)最显著的生物学特点之一就是其基因的高度变异性。此一源于其复制的生物学特点，使HIV在传播过程中产生出许多具有相对独立的基因序列特性的亚型(subtype)，并在全球范围的流行蔓延过程中形成了一定的地区性分布特点[1]。根据HIV-1基因组中变异性最大、同时也被研究得最多的膜蛋白基因(env)核酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A～H和O至少9种HIV-1亚型。各亚型间基因核苷酸序列的差异较大，A～H 亚型间的差异一般在20%～35%的范围，而O亚型与A～H各亚型间的差异则高达50%以上[2，3]。
HIV-1基因的高度变异性是AIDS疫苗研制的一个较大障碍。因此分离和鉴定感染人群中HIV-1亚型的分布特点并监测其变化过程，是研制有针对性的HIV-1疫苗的必需课题，也是广泛开展HIV-1生物学研究的基础[1]。同时， 对HIV-1基因变异和地区分布的分析，又是分子流行病学研究的重要内容。通过这些研究，使我们有可能追寻其传播的来源、途径和发展趋势，为卫生管理部门制定相应的预防控制措施提供科学依据。
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目前，用于HIV分型的方法主要有DNA直接序列测定法[4]、血清法[5]、核酸探针法[6]及异源双链泳动分析法(Heteroduplex Mobility Assay，HMA)[7]。DNA序列测定法特异、准确，但需要专门测序仪，且技术要求高、费用高。对大量样品进行分析不易普及。血清法分型因不同基因亚型抗体间存在交叉反应，结果与基因分型不完全一致。用它对基因变异进行分析时准确性较低。所以，不能完全反映体内基因变异情况。异源双链泳动分析法是由华盛顿大学Mullins教授在HIV基因变异分析中建立的一种方法，操作简单、省时，适用于大规模样品的分析。此方法自建立以来，已在全球HIV分离鉴定网上广泛用于HIV-1分型。利用这种方法，我们对来自1997和1998年我国云南、四川、新疆、浙江、广东、福建、天津等地的73份HIV-1阳性样品进行分型。然后又进一步进行序列测定和系统树分析，并且将二者的结果进行了比较。
材料与方法
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1 研究对象和样品 所有研究对象的样品均来自上述7省市HIV-1感染者的送检样品，经蛋白印迹法已确证为阳性者。从每位对象采集5ml全血，肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗2遍后，使用Qiagen公司QiAamp Blood试剂，按说明书操作提取细胞DNA，核酸样品冻存于-20℃。
2 PCR 采用套式PCR方法扩增HIV-1 env基因，引物及对照质粒由Mullins教授惠赠(表1和表2)。以ED3/ED14为外侧扩增引物进行第一轮PCR反应，条件为94℃2分钟，55℃1分钟，72℃3分钟，3个循环；94℃30秒，55℃45秒，72℃3分钟，32个循环；72℃延伸5分钟。取2μl PCR产物或1μl对照质粒，以ED5/ED12为内侧引物进行第二轮PCR，条件为94℃2分钟，55℃1分钟，72℃3分钟，3个循环；94℃30秒，55℃45秒，72℃2分钟，32个循环；72℃延伸5分钟。取5μl PCR产物经1%琼脂糖电泳，与Marker及阴性和阳性对照对比，判断结果。未扩增出特异产物的样品用ED5/ED12为外侧引物，ES7/ES8为内侧引物进行扩增，结果如仍然是阴性的话，变更扩增条件如下：开始5个循环采用的复性温度为52℃或45℃，接下来的30个循环仍然采用上述标准扩增条件。
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表1 引物序列及其在HIV-1基因组中的位置
Table 1 Primer sequences and their location in the HIV-1 genome 引物
Primer
序列
Sequence(5′-3′)
在HIV-1基因组中的位置
Location in the HIV-1 genome
扩增片段长度
Length of amplified fragment
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ED3
TTAGGCATCTCCTATGGC-
AGGAAGAAGCGG
5 956～5 985*
ED14
TCTTGCCTGGAGCTGCTT-
GATGCCCCAGAC
7 960～7 931*
2 004bp
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ED5
ATGGGATCAAAGCCTAAA-
GCCATGTC
6 556～6 581
ED12
ATGGCTTCCTGCTGCTCC-
CAAGAACCCAAG
7 822～7 792*
1 266bp
ES7
tgtaaaacgacggccagtC
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TGTTAAATGGCAGTCTAGC
7 001～7 020*
ES8
caggaaacagctatgacc
CACTTCTCCAATTGTCCCTCA
7 667～7 647*
666bp
注：*来自于HIV-1 HXB2基因库。
小写字母表示与M13正向或反向引物的互补序列，用作PCR产物测序引物。
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Notes: * Derived from HIV-1 HXB2 GeneBank.
The small letters denote the complementary seguences to M13 positively and negatively oriented primers.表2 HIV-1包膜参考亚型质粒
Table 2 HIV-1 envelope subtype references 亚型
Subtype
HIV-1株
HIV-1 strain
来源国家
Originated from
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克隆片段
Cloned fragment
质粒载体
Plasmid vector
药物抗性
DrugR
A
RW20
Rwanda
gp160
PCR2
Kan/Amp
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B1
BR20
Brazil
gp160
PCR2
Kan/Amp
B2
TH14
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
B3
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SF162
USA
6.6Kb3’
PUC19
Amp
C
IN868
India
ED5-ED12
PCR1
Kan
D
UG21
, 百拇医药
Uganda
gp120
PCR2
Kan/Amp
E
TH22
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
E
TH06
Thailand
, 百拇医药
gp160
PCR2
Kan/Amp
F
BZ163
Thailand
gp160
PCR2
Kan/Amp
G
RU131
Russia
ED5-ED12
, 百拇医药
PUC18
Amp
3 异源双链泳动分析(HMA)
3.1 异源双链的形成 在1个500μl Eppendorf管中加入5μl第二轮PCR产物(约100～250ng DNA)，5μl对照质粒的PCR产物(或H2O)，1.1μl异源双链体杂交液(Heteroduplex annealing buffer，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris pH7.8，2mmol/L EDTA)，94℃水浴2分钟，迅速置于冰浴中10分钟。
加入1/5体积的5×点样缓冲液(25%Ficoll，1%Orange G)，点样至5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(30：0.8 acrylamide：bisacrylamide)，胶厚1.5mm，胶面为17.5×15cm的V16垂直冷凝电泳槽(北京六一厂)，电泳液用1×TBE(88mmol/L Trisorate，89mmol/L borate，2mmol/L EDTA)。电泳条件如下：分析用ED5/ED12扩增的1.25kb片段，采用200V电压，电泳6小时；分析用ES7/ES8扩增的0.7kb片段，采用250V电压，电泳3小时，电泳结束，将凝胶侵入0.5μg/ml溴化乙锭中染色1小时，在紫外灯下观察结果。
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3.2 异源双链体泳动率的测定及亚型的确定 根据样品与某一亚型的对照质粒形成的异源双链体泳动率最快，则可确定该样品为其相应亚型。
4 DNA序列测定及系统树分析
4.1 PCR产物的纯化 第二轮PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。
4.2 DNA序列测定 以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末段终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，样品用量约1μg，引物用量6pmol，反应产物经提纯后用ABI公司377型DNA序列测定仪进行序列测定。
4.3 系统树分析 测得的序列用SedEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区的最终序列的确定是根据两个正向或反向测序引物所测结果重叠校核后而定的。序列的同源性分析及亚型确定是使用Phylip[8]软件包完成。具体包括：用Clustal W程序对样品与国际标准序列进行排列和比较；用DNADIST程序计算一组序列间的基因离散率；用Neighbor-joining程序做系统树(phylogenetic tree)；bootstrap分析选用100来表达Neighbor-joining系统树上各序列之间的关系。
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结果
1 HMA分型结果
到目前为止，在我国流行的HIV-1主要是B、C、E三种亚型，因此，首先把73份样品与TH14、SF162、IN868、TH22及TH06这五种参考亚型的质粒进行比较，66份样品可经HMA确定其亚型。其余7份不能分型的样品，则结合流行病学调查资料(有的曾去过非洲一些国家，有的既有静脉注射毒品史又有性乱史)，将它们与RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163等亚型参考质粒进行比较，结果证实，标本ju01、bj11是A亚型，gd17、gd18为F亚型。而sc12从HMA结果看很难确定它是D亚型或是B1亚型，bj05和fi08则根本不能确定其亚型。图1列出了bj11、sd7、yn03、xj159和fj06标本666bp和gd17标本1 266bp扩增片段的HMA结果。全部73份样品通过HMA能确定亚型的有70份，占样品总数的95.89%(70/73)。其中C亚型占38.57%(27/70)，E亚型占28.57%(20/70)，泰国B亚型占18.58%(13/70)，欧美B亚型占8.56%(6/70)，A、F亚型各为2.86%(2/70)。
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图1 标本bj11、sd7、yn03、xj159、fj06的666bp及gd17的1266bp扩增片段的HMA结果
1.1～6依次为标本bj11与H2O，对照质粒RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163的杂交，结果为A亚型;
2.1～6依次为标本sd7与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为B2亚型;
3.1～6依次为标本yn03与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为B3亚型;
4.1～6依次为标本xj159与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为C亚型;
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5.1～6依次为标本fj06与H2O，对照质粒TH14、SF162、IN868、TH22、TH06的杂交，结果为E亚型;
6.1～6依次为标本gd17与H2O，对照质粒RW20、BR20、UG21、RU131、BZ163的杂交，结果为F亚型;
7. DNA分子量标准(λ/EcoRI/HindⅢ)。
Figure 1 HMA results of 666bp or 1266bp products of specimen bj11，sd7，yn03，xj159，fj06 and gd17
1.1-6 Hybridization results of sample bj11 with H2O, RW20, BR20, UG21, RU131, BZ163 is A subtype;
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2.1-6 Hybridization results of sample sd7 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is B2 subtype;
3.1-6 Hybridization results of sample yn03 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is B3 subtype;
4.1-6 Hybridization results of sample xj159 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06 is C subtype;
5.1-6 Hybridization results of sample fj06 with H2O, TH14, SF162, IN868, TH22, TH06, is E subtype;
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6.1-6 Hybridization results of sample gd17 with H2O, RW20, BR20, UG21, RU131, BZ163 is F subtype;
7 DNA Marker (λ/EcoRI/HindⅢ).
2 测序后用系统树分型结果
如图2系统树所显示，整个73份样品大致可分为6组：第一组2个毒株与A亚型毒株聚集在一起，属A亚型；第二组只有sc12一个样品与D亚型毒株序列聚集在一起，属D亚型；第三组可进一步分为二枝，第一枝的15个样品与B2亚型毒株序列聚集在一起，属泰国B亚型，第二枝的6个样品与B3亚型毒株序列聚集在一起，属欧美B亚型；第四组27个样品与C亚型毒株聚集在一起，属C亚型；第五组gd17、gd18二个样品与F亚型毒株聚集在一起，属F亚型；第六组20个样品与E亚型毒株聚集在一起属E亚型。
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图2 73份样品env基因的C2-V3区306bp核苷酸序列
经Phylip软件包内的Neighbor方法构建成的系统树，加方框的是HMA中各参考亚型毒株
Figure 2 Phylogenetic analysis based on 306bp nucleotide sequences of the C2-V3 region of the env gene in seventy-three specimens
It was created with Neighbor of Phylip.HMA subtype references are enclosed by boxes.
3 比较HMA分型与序列测定结果所做的系统树分析
表2列出了73份标本HMA分型和序列测定分型的比较，两者结果的一致率为95.89%(70/73)，与文献报道的94%、97%相近[9]。各亚型的一致率是：B亚型90.48%(19/21)，A、C、E和F亚型均是100%，但A、F亚型因样品数太少不能说明问题。有3份样品用HMA无法判定结果，标本sc12序列测定结果为D亚型，系统树上也清楚地显示与UG21聚成一组。而用ES7-ES8引物扩增产物所做的HMA均为D/B1亚型。标本bj05与fj08序列测定结果均为B2亚型，而用ES7-ES8物扩增产物所做的HMA因为条带太乱很难判定其亚型。用HMA不能确定其亚型的可能原因有：第一，病毒株本身有较大的差异，基因组结构中存在较大片段的插入和缺失；第二，双重感染或多重感染造成重组毒株[7]。对照系统树看，HMA不能确定亚型的两个样品bj05与fj08，在系统树中的分枝和同型的其它毒株与标准亚型距离比确实更远。这从一个方面反映了这两个毒株内的基因变异较为复杂。对sc12的进一步分析发现，它距B和D的参考亚型BR20和UG21的基因离散率分别为18.72%和18.79%，反映在HMA条带上样品与B1和D所形成的异源双链与各自的同源双链距离相近，因此，很难确定其亚型。
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表3 HMA分型与序列测定分型的比较
Table 3 Comparison of HMA and sequencing for HIV-1 subtyping 序号
Serial
number
样品号
Subject code
PCR
ED5-
ED12
HMA分型结果
HMA subtype
, 百拇医药
ES7-ES8
序列测定亚型
Sequence
subtype
备注
Notes
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药
01
fi01
1
E
E
02
fi02
2
E
E
03
fi03
1
C
, 百拇医药
C
04
fi04
1
E*
E
05
fi05
1
E
E
06
fi06
, 百拇医药
2
E
E
07
fi07
2
E
E
08
fi08
2
B2
Can not be subtyped by HMA
, 百拇医药
09
ju01
1
A
A
10
bj01
1
B2
B2
11
bj02
1
B2
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B2
12
bj04
1
B2
B2
13
bj05
2
B2
Can not be subtyped by HMA
14
bj11
, 百拇医药
2
A
A
15
bj12
1
E
E
16
bj19
2
E
E
17
, 百拇医药
tj01
2
B2
B2
18
tj02
2
B2
B2
19
tj03
1
C
C
, 百拇医药
20
sc01
1
C
C
21
sc02
2
E
E
22
sc05
1
B2
, 百拇医药
B2
23
sc06
1
C
C
24
sc08
2
C
C
25
sc12
3*
, 百拇医药
B1/D*
B1/D*
D
Can not be subtyped by HMA
26
sc13
1
B2
B2
27
sc16
1
, 百拇医药
B2
B2
1
2
3
4
5
6
7
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备注：1.表示在标准扩增条件下，用ED5-ED12作第二轮PCR引物，成功扩增1 266bp片段。
2.表示在标准扩增条件下，用ES7-ES8作第二轮PCR引物，成功扩增666bp片段。
3.表示在标准扩增条件下，用ED5-ED12和ES7-ES8作第二轮PCR引物，成功扩增出1 266bp及666bp片段。
*表示在标准扩增条件下，扩增失败，而变更扩增条件为开始5个循环采用的复性温度52℃或45℃，接下来的30个循环仍然采用与以上相同的标准扩增条件。
Notes：1. The 1,266bp fragment was amplified by the second round PCR using ED5-ED12 primers under the conditions described.
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2. The 666bp fragment was amplified by the second round PCR using ES7-ES8 primers under the conditions described.
3. The 1,266bp and 666bp fragments were amplified by second round PCR using ED5-ED12 and ES7-ES8 primers under the conditcans described.
The PCR conditions were modified as that described in “methods and materials 2".
讨论
本实验结果进一步证明，异源双链泳动分析是确定HIV基因亚型的一种新的、快速、简便、可靠的方法。HMA用于HIV分型的主要原理是基于DNA分子的变性和复性过程。当双链DNA分子被加热到100℃左右，两条互补链分离，此即变性作用；在适当温度、盐离子浓度作用下，变性的DNA能够通过碱基配对而重新形成双螺旋，此即复性作用。同时，如在溶液中存在二种或二种以上具有一定同源性的核酸分子，在适当的盐离子浓度下，通过上述变性、复性过程，不同来源的两链的同源区域可借碱基配对形成双链，此即异源双链。异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，在链内局部可形成凸起(bulges)或泡(bubble)，分子构象发生改变[10]。而在非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳中，DNA分子相对迁移率不仅与DNA分子大小有关，而且与其构象有关。这样，在PCR反应中采用同一对引物，从不同来源扩增得到的DNA片段，通过变性、复性后，尽管可以形成大小相同的同源双链与异源双链，但由于异源双链中有构象改变，所以，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，与同源双链泳动速率相比，异源双链电泳速度慢，迁移距离较短。异源双链泳动速度与其双链同源性成正比，同源性越高，泳动越快。亚型的确定正是根据样品与某一亚型形成的异源双链体的泳动率最快，确定该样品为其相应的亚型。HMA操作虽相对简单，但为了保证实验的稳定性、重复性和特异性，每次实验应有严格的质量控制，包括设立样品自身杂交作对照，PAGE条件要相对恒定，电泳装置、凝胶浓度及缓冲液、电泳时间、电压都要一致。同时，电泳温度越高，异源双链体的泳动率越慢，因此需要冰浴条件下电泳。
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根据我们的实验结果，在实际对一个地方流行的HIV-1毒株进行分型时，可遵循下列步骤：(1)选用合适的引物和最佳扩增条件(见材料与方法)；(2)结合以前分子流行病学资料，首先选用与本地区流行亚型相应的标准亚型质粒进行实验，若未能分型，则结合现场流行病调查结果选用研究对象曾去过的国家和地区流行的标准亚型质粒作为对照进行分型；若仍不能确定其亚型，则进行(3)DNA序列测定和系统树分析。
另外，由于HIV始终处于一种持续和动态变异过程中[11]，因此为了提高HMA分型的敏感性，用于HMA分型的标准亚型质粒应根据各地区实际情况不断增加[12]。目前，我们已经通过筛选流行于我国境内的与各自亚型共享序列最接近的毒株作为代表株，构建我国HIV-1各亚型的标准质粒用于HIV-1分型[13]。
作者简介：姚均(1964-)，男(苗族)，湖南吉首市人，助理研究员，医学硕士，主要从事艾滋病基础与临床方面的研究。现在工作单位：北京地坛医院艾滋病临床研究中心。
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参考文献
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收稿日期：1999-01-05；修回日期：1999-04-28, 百拇医药