酵母双杂合系统在丙型肝炎病毒NS5A研究中的应用
作者：屠红 Deborah Taylor 闻玉梅 Michael M.C.Lai
单位：屠红 Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；上海医科大学卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032
关键词：酵母双杂合系统；丙型肝炎病毒；人核小体组装蛋白相关蛋白；载脂蛋白A-I
病毒学报990401 摘要：酵母双杂合系统是在酵母细胞中研究蛋白-蛋白相互作用的新技术。应用该技术，以丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)为“诱饵”，筛检了人肝癌细胞HepG2来源的cDNA文库，获得了7个NS5A结合蛋白的基因克隆。报道了其中两个阳性克隆(＃2、＃16)的结果，并对“人核小体组装蛋白相关蛋白”(Human nucleosome assembly protein-related protein，hNRP)和“载脂蛋白A-I”(Apolipoprotein A-I)与NS5A结合的生物学意义进行了讨论。
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中图分类号：R373.2+1；Q785 文献标识码；A 文章编号：1000-8721(1999)04-0289-07
IDENTIFICATION OF THE NOVEL HEPATITIS C VIRUS NS5A-INTERACTING PROTEINS IN YEAST TWO-HYBRID SYSTEM
TU Hong2, 3, Deborah Taylor2, WEN Yu-mei3, Lai MC Michael1, 2
(1. Howard Hughes Medical Institute, 2. Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, School of Medicine, Los Angeles, CA90033, 3. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
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Abstract: The yeast two-hybrid system is a novel and sensitive technique to detect protein-protein interactions in vivo. Using hepatitis C virus NS5A as a bait, we screened a human hepatocyte derived cDNA library and isolated 7 novel proteins that can interact with NS5A in yeast. Human nucleosome assembly protein-related protein and human apolipopreins A-I are two of the cellular NS5A-binding proteins. The possible functions of the binding between NS5A and these two proteins are discussed.
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Key words: Yeast two-hybrid system; Hepatitis C virus; Human nucleosome assembly protein-related protein; Human apolipoproteins A-I
酵母双杂合系统(Yeast two-hybrid system)系由Fields等发明的一种在酵母细胞中检测蛋白-蛋白相互作用的实验方法[1]。其基本原理为：真核细胞的转录因子由DNA结合域(DNA-binding domain，DNA-BD)和转录激活域(Activation domain，AD)两个独立的功能域组成，它们可存在于不同的蛋白分子中，只要空间距离靠近至一定范围就能起反式作用。在酵母双杂合系统中，“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中LacZ和HIS3基因的表达(图1)。该系统自创建以来，因其能快速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的相互作用而受到了日益广泛的应用。
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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起人类丙型肝炎的致病因子。病毒单正链RNA，基因长约9.4kb，有一长开放读码框架(ORF)，编码的蛋白前体经切割后产生C、E1、E2等结构蛋白和P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等非结构蛋白[2]。对非结构蛋白NS5A的研究近年来取得了一定的进展，但其功能还远未完全阐明[3-7]。为了进一步揭示NS5A潜在的生物学功能，我们应用酵母双杂合系统，筛检了人肝细胞来源的cDNA基因文库，获得了在酵母细胞中能与HCV NS5A相互作用的蛋白的基因克隆，为NS5A功能的深入研究提供了方向。
材料与方法
1 质粒的构建 HCV 1a型NS5A全长基因(nt.6258-7601)和NS5A nt.6747-7331基因片段，由EcoR I和Sal I酶切位点克隆至pGBT9载体(Clontech公司)GAL4 DNA-BD下游，构建成pGBT9/NS5A和pGBT9/△NS5A重组体，用以在酵母中表达与GAL4 DNA-BD融合的全长NS5A和NS5A 164-358aa片段。HepG2细胞来源的pGAD10/cDNA基因文库由Clontech公司构建，全库共包含1.6×106个独立克隆。酵母双杂系统筛检HCV NS5A结合蛋白的工作原理和载体构建见图1。
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图1 酵母双杂系统筛检HCV NS5A结合蛋白的工作原理及载体构建
Figure 1 Strategy to detect HCV NS5A-binding protein by yeast two-hybrid system
2 酵母的质粒DNA转化 以氯化锂方法[8]将pGBT9/NS5A质粒转入酿酒酵母Y190。选择数个已获质粒转化的菌落接种至50ml SD-Trp液体培养基中培养过夜，次日转种400ml SD/-Trp培养基中继续培养6小时至OD600达0.8。离心收获细胞，沉淀悬浮于1.5ml 1×TE/LiAc(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，100mmol/LLiAc)溶液中制成感受态酵母，再加入基因库DNA100μg、单链鱼精DNA 750μg以及PEG/LiAc(40% PEG4000，100mmol/L LiAc)溶液9ml，Vortex充分混匀。30℃振荡作用30分钟。加入DMSO 1ml，42℃热休克30分钟。置冰上3分钟。离心收集细胞，沉淀悬浮于10ml H2O中，平均涂布50块直径150mm的SD/-Trp/-Leu/-His/25mM3-AT平板。30℃培养一周观察结果。
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3 β-半乳糖苷酶活性检测 将直径150mm的尼龙膜(Amersham公司)置于生长酵母菌落的平板上，揭膜使菌落附着其上。膜置液氮和室温中交替冻融3次裂解细胞，随后平放于两层浸透Z缓冲液/X-gal(60mmol/L Na2HPO4，40mmol/L NaH2PO4，10mmol/L KCl，1mmol/L MgSO4，0.033%X-gal，0.27% β-巯基乙醇)的滤纸上，30℃渗透反应8小时，观察结果。
4 pGAD10/cDNA质粒的分离纯化 挑选初筛结果阳性的菌落，转种至SD/-Leu培养基中生长，使其自然丢失pGBT9/NS5A质粒。抽提其中pGAD10/cDNA质粒，转化大肠杆菌DH5α，获得含pGAD10/cDNA质粒的细菌克隆。
5 cDNA插入片段的扩增 以pGAD10载体序列为引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增插入的cDNA序列。正向引物P1为：5′-CTATTCGATGAAGATACCC-3′，反向引物P2为：5′-GTGAACTTGCGGGGTTT-TTCAGTATCT-3′。反应条件为94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30次循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
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6 DNA序列测定 DNA测序采用[α-33P]标记的末端终止热循环测序药盒(Amersham公司)，操作按说明书进行。测序引物同PCR正向引物P1。
结果
1 NS5A自身激活作用的检测
Kato等报道，NS5A蛋白中163～359aa部分具有很强的转录激活作用[4]。酵母双杂交系统筛库的前提是“诱饵”自身不能具有转录活性。为此，我们首先将pGBT9/△NS5A(164～358aa)和pGBT9/NS5A质粒分别转化酵母Y190，在SD/-trp/-His平板上培养一周，结果前者在平板上有大量菌落生长，且β-半乳糖苷酶活性检测呈强阳性；后者未见菌落生长。表明全长NS5A不具有反式激活作用，可用作筛库“诱饵”。
2 以NS5A为“诱饵”的筛库结果
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在第一轮初筛了2.8×106个独立克隆后，共获124个阳性候选克隆。自阳性酵母中分离pGAD10/cDNA质粒，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒DNA，再次转化含pGBT9/NS5A的Y190酵母，结果仅剩7份标本(编号为＃2、＃8、＃14、＃16、＃38、＃42、＃74)为阳性。将此7份pGAD10/cDNA与pGBT9空载DNA共同转化Y190，结果均为阴性，表明pGAD10/cDNA自身并不编码具有转录激活作用的蛋白。
3 cDNA序列的PCR扩增及序列测定
以载体序列为引物，扩增插入pGAD10中的cDNA片段。结果＃2、＃8、＃14、＃16、＃38、＃42、＃74等7个阳性克隆的插入片段大小分别为950bp±、950bp±、2 000bp±、800bp±、550bp±、1 400bp±和1 100bp±(图2)。经[α-33P]标记的ddNTP热循环末端终止测序后发现，＃38、＃42、＃74克隆cDNA编码同一家族蛋白，另外4个NS5A结合蛋白之间序列无明显同源性。本文报道其中＃2和＃16克隆的cDNA序列(余另文报道)。
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图2 阳性克隆cDNA插入片段的PCR扩增
M1：λDNA/Hind Ⅲ标准分子量对照；M2：φX174 RF DNA/HaeⅢ标准分子量对照。
Figure 2 cDNA insertions of positive clones by PCR amplification
M1：λDNA/Hind Ⅲ molecular weight；M2：φX174 RF DNA/Hae Ⅲ molecular weight.
＃2克隆插入片段长约950bp，根据与其融合的GAL4 AD读码框架推导，其cDNA共编码208个氨基酸残基(图3)。经美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的国际网络BLAST程序检索后发现，N端的203个氨基酸残基与“人核小体组装蛋白相关蛋白”(Human nucleosome assembly protein-related protein，hNRP)161～363aa间序列100%相同，两者仅在C末端有5个氨基酸残基的差别，提示＃2克隆编码蛋白为hNRP的异构体。
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图3 ＃2阳性克隆cDNA序列及推导的氨基酸序列画线部分序列与hNRP相同。
Figure 3 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of ＃2 positive clone The underlined region is identical to hNRP sequence.
＃16克隆插入片段长约800bp，测得400bp序列后，与基因库序列进行同源性比较，发现其100%相同于人载脂蛋白AI(Aplipoprotein A-1，Apo AI)基因序列(图4)。
图4 ＃16克隆cDNA序列及推导的氨基酸序列(部分)画线部分序列与ApoA-I相同。
Figure 4 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of ＃16 clone(partial) The underlined region is identical to Apo A-I sequence.
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讨论
酵母双杂合系统是90年代发展起来的研究蛋白-蛋白之间相互作用的新技术。同传统方法相比，它的主要优点在于蛋白之间的作用是在真核酵母细胞内进行，结果更能反应体内的真实情况。同时该系统还具有很高的敏感性和特异性，在筛库的同时即能获得“诱饵”结合蛋白的基因克隆。因此它在生命科学的各个领域中得到了广泛的应用，迄今，已有上千种蛋白之间的相互作用通过该系统首次被发现。
蛋白-蛋白的特异性结合，是细胞内许多重要生理活动的基础，也是病毒与宿主细胞相互作用的分子基础。应用酵母双杂合系统，细胞内一些病毒结合蛋白相继被发现和证实，由此为起点的生物学意义的研究也取得了一些突破性的进展[9，10，11]。在HCV中，通过筛库发现衣壳蛋白C能与淋巴毒素受体(LT-βR)的胞浆部分结合，进一步研究揭示了C蛋白通过影响LT-βR的信号传导通路而对细胞的凋亡具有调控作用[12，13]。HCV NS5A与干扰素诱生蛋白PKR的结合，也在酵母双杂合系统中首次得到证实，现已阐明这种结合能影响干扰素的抗病毒作用，使病毒逃逸机体的免疫防御[7，14]。因此，了解病毒蛋白与宿主蛋白的特异性结合，有助于揭示病毒蛋白的生物学功能，为阐明病毒的复制与致病机理提供可靠的线索和研究方向。
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以HCV NS5A为“诱饵”进行的酵母双杂合系统筛库，至今国内外尚未见成功报道。除技术因素外，可能还由于NS5A具有潜在的转录激活作用，并非一理想的筛库“诱饵”。NS5A中第163～359aa序列在酵母和哺乳动物细胞中具有很强的转录激活效应，即其自身单独就能激活报告基因的表达[4]。因此尽管以往报道和我们的结果均表明全长NS5A并不具有这种功能，但当与pGAD10/cDNA共转染酵母后，仍出现了许多的假阳性结果。可能因为某些cDNA编码蛋白能非特异性地或短暂地作用于NS5A，使之构型改变后发挥转录潜能造成假阳性。而由cDNA编码蛋白与NS5A特异性结合引起的GAL4 AD的反式作用，则较为稳定和持续。我们最后所获的7个阳性克隆，经反复实验均为阳性，表明编码蛋白与NS5A的结合十分特异和牢固。这种特异性的结合，在＃14、＃42和＃74克隆中已经GST pull-down、免疫共沉淀等其它体内外实验所证实。
核小体组装蛋白-I(Nucleosome assembly protein，NAP-I)为一具有核小体组装功能的蛋白[15]。NAP-I家族基因在动物、植物和酵母中都已被克隆，相互间有35%左右的同源性。hNRP在人低分化细胞中的表达水平显著高于正常分化细胞，提示其在细胞分化中的作用。Simon等发现在细胞中过量表达hNAP后，能促进有丝分裂原对外周血单核细胞及T淋巴细胞的增殖作用[16]。因此，NS5A与hVNP的结合在HCV致癌中是否具有意义，有待于进一步研究证实。此外，hNAP为一存在于细胞核中的蛋白，其与NS5A的结合，提示后者也可能定位于细胞核内。显然NS5A中存在着一段核定位信号序列(NLS)，能携带外源性报告基因进入核内[5]，但转染细胞的免疫荧光染色结果却显示NS5A仅存在于细浆中。NS5A在细胞内的定位，是长期以来人们一直关注和争论的问题。本实验中NS5A能与核蛋白hNAP结合的发现，进一步支持了NS5A在核内存在的可能性。
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载脂蛋白与HCV核心蛋白C的关系，近年已有报道。Barba等发现，在稳定表达C蛋白的细胞以及HCV慢性感染的黑猩猩肝穿刺标本中，C蛋白集中堆积在胞浆内脂肪颗粒的表面。等电聚焦显微镜结果也显示C蛋白与apo A-Ⅱ在细胞中复合存在。C蛋白可能通过载脂蛋白的介导连接于脂肪颗粒表面，影响细胞的脂肪代谢途径，造成丙肝病人的肝脏脂肪化[17]。Soardo等还报道，慢性丙肝患者血中apo A-I及高密度脂蛋白的水平，与病人对α-干扰素的反应有关[18]。本实验发现了HCV非结构蛋白与载脂蛋白的结合，再次提示了HCV感染可能对细胞内脂肪代谢通路有一定的影响。
作者简介：屠红(1966-)，女，江苏常州，讲师，博士，研究方向为肝炎病毒的分子生物学。
Michael M.C.Lai 通讯作者。屠红 联合培养博士生。
作者单位：Deborah Taylor Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；闻玉梅 上海医科大学卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032；Michael M.C.Lai Howard Hughes Medical Institute; Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；
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参考文献
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收稿日期：1999-03-26；修回日期：1999-07-06, http://www.100md.com
单位：屠红 Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；上海医科大学卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032
关键词：酵母双杂合系统；丙型肝炎病毒；人核小体组装蛋白相关蛋白；载脂蛋白A-I
病毒学报990401 摘要：酵母双杂合系统是在酵母细胞中研究蛋白-蛋白相互作用的新技术。应用该技术，以丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)为“诱饵”，筛检了人肝癌细胞HepG2来源的cDNA文库，获得了7个NS5A结合蛋白的基因克隆。报道了其中两个阳性克隆(＃2、＃16)的结果，并对“人核小体组装蛋白相关蛋白”(Human nucleosome assembly protein-related protein，hNRP)和“载脂蛋白A-I”(Apolipoprotein A-I)与NS5A结合的生物学意义进行了讨论。
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中图分类号：R373.2+1；Q785 文献标识码；A 文章编号：1000-8721(1999)04-0289-07
IDENTIFICATION OF THE NOVEL HEPATITIS C VIRUS NS5A-INTERACTING PROTEINS IN YEAST TWO-HYBRID SYSTEM
TU Hong2, 3, Deborah Taylor2, WEN Yu-mei3, Lai MC Michael1, 2
(1. Howard Hughes Medical Institute, 2. Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, School of Medicine, Los Angeles, CA90033, 3. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
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Abstract: The yeast two-hybrid system is a novel and sensitive technique to detect protein-protein interactions in vivo. Using hepatitis C virus NS5A as a bait, we screened a human hepatocyte derived cDNA library and isolated 7 novel proteins that can interact with NS5A in yeast. Human nucleosome assembly protein-related protein and human apolipopreins A-I are two of the cellular NS5A-binding proteins. The possible functions of the binding between NS5A and these two proteins are discussed.
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酵母双杂合系统(Yeast two-hybrid system)系由Fields等发明的一种在酵母细胞中检测蛋白-蛋白相互作用的实验方法[1]。其基本原理为：真核细胞的转录因子由DNA结合域(DNA-binding domain，DNA-BD)和转录激活域(Activation domain，AD)两个独立的功能域组成，它们可存在于不同的蛋白分子中，只要空间距离靠近至一定范围就能起反式作用。在酵母双杂合系统中，“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中LacZ和HIS3基因的表达(图1)。该系统自创建以来，因其能快速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的相互作用而受到了日益广泛的应用。
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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起人类丙型肝炎的致病因子。病毒单正链RNA，基因长约9.4kb，有一长开放读码框架(ORF)，编码的蛋白前体经切割后产生C、E1、E2等结构蛋白和P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等非结构蛋白[2]。对非结构蛋白NS5A的研究近年来取得了一定的进展，但其功能还远未完全阐明[3-7]。为了进一步揭示NS5A潜在的生物学功能，我们应用酵母双杂合系统，筛检了人肝细胞来源的cDNA基因文库，获得了在酵母细胞中能与HCV NS5A相互作用的蛋白的基因克隆，为NS5A功能的深入研究提供了方向。
材料与方法
1 质粒的构建 HCV 1a型NS5A全长基因(nt.6258-7601)和NS5A nt.6747-7331基因片段，由EcoR I和Sal I酶切位点克隆至pGBT9载体(Clontech公司)GAL4 DNA-BD下游，构建成pGBT9/NS5A和pGBT9/△NS5A重组体，用以在酵母中表达与GAL4 DNA-BD融合的全长NS5A和NS5A 164-358aa片段。HepG2细胞来源的pGAD10/cDNA基因文库由Clontech公司构建，全库共包含1.6×106个独立克隆。酵母双杂系统筛检HCV NS5A结合蛋白的工作原理和载体构建见图1。
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图1 酵母双杂系统筛检HCV NS5A结合蛋白的工作原理及载体构建
Figure 1 Strategy to detect HCV NS5A-binding protein by yeast two-hybrid system
2 酵母的质粒DNA转化 以氯化锂方法[8]将pGBT9/NS5A质粒转入酿酒酵母Y190。选择数个已获质粒转化的菌落接种至50ml SD-Trp液体培养基中培养过夜，次日转种400ml SD/-Trp培养基中继续培养6小时至OD600达0.8。离心收获细胞，沉淀悬浮于1.5ml 1×TE/LiAc(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，100mmol/LLiAc)溶液中制成感受态酵母，再加入基因库DNA100μg、单链鱼精DNA 750μg以及PEG/LiAc(40% PEG4000，100mmol/L LiAc)溶液9ml，Vortex充分混匀。30℃振荡作用30分钟。加入DMSO 1ml，42℃热休克30分钟。置冰上3分钟。离心收集细胞，沉淀悬浮于10ml H2O中，平均涂布50块直径150mm的SD/-Trp/-Leu/-His/25mM3-AT平板。30℃培养一周观察结果。
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3 β-半乳糖苷酶活性检测 将直径150mm的尼龙膜(Amersham公司)置于生长酵母菌落的平板上，揭膜使菌落附着其上。膜置液氮和室温中交替冻融3次裂解细胞，随后平放于两层浸透Z缓冲液/X-gal(60mmol/L Na2HPO4，40mmol/L NaH2PO4，10mmol/L KCl，1mmol/L MgSO4，0.033%X-gal，0.27% β-巯基乙醇)的滤纸上，30℃渗透反应8小时，观察结果。
4 pGAD10/cDNA质粒的分离纯化 挑选初筛结果阳性的菌落，转种至SD/-Leu培养基中生长，使其自然丢失pGBT9/NS5A质粒。抽提其中pGAD10/cDNA质粒，转化大肠杆菌DH5α，获得含pGAD10/cDNA质粒的细菌克隆。
5 cDNA插入片段的扩增 以pGAD10载体序列为引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增插入的cDNA序列。正向引物P1为：5′-CTATTCGATGAAGATACCC-3′，反向引物P2为：5′-GTGAACTTGCGGGGTTT-TTCAGTATCT-3′。反应条件为94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30次循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
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结果
1 NS5A自身激活作用的检测
Kato等报道，NS5A蛋白中163～359aa部分具有很强的转录激活作用[4]。酵母双杂交系统筛库的前提是“诱饵”自身不能具有转录活性。为此，我们首先将pGBT9/△NS5A(164～358aa)和pGBT9/NS5A质粒分别转化酵母Y190，在SD/-trp/-His平板上培养一周，结果前者在平板上有大量菌落生长，且β-半乳糖苷酶活性检测呈强阳性；后者未见菌落生长。表明全长NS5A不具有反式激活作用，可用作筛库“诱饵”。
2 以NS5A为“诱饵”的筛库结果
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在第一轮初筛了2.8×106个独立克隆后，共获124个阳性候选克隆。自阳性酵母中分离pGAD10/cDNA质粒，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒DNA，再次转化含pGBT9/NS5A的Y190酵母，结果仅剩7份标本(编号为＃2、＃8、＃14、＃16、＃38、＃42、＃74)为阳性。将此7份pGAD10/cDNA与pGBT9空载DNA共同转化Y190，结果均为阴性，表明pGAD10/cDNA自身并不编码具有转录激活作用的蛋白。
3 cDNA序列的PCR扩增及序列测定
以载体序列为引物，扩增插入pGAD10中的cDNA片段。结果＃2、＃8、＃14、＃16、＃38、＃42、＃74等7个阳性克隆的插入片段大小分别为950bp±、950bp±、2 000bp±、800bp±、550bp±、1 400bp±和1 100bp±(图2)。经[α-33P]标记的ddNTP热循环末端终止测序后发现，＃38、＃42、＃74克隆cDNA编码同一家族蛋白，另外4个NS5A结合蛋白之间序列无明显同源性。本文报道其中＃2和＃16克隆的cDNA序列(余另文报道)。
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图2 阳性克隆cDNA插入片段的PCR扩增
M1：λDNA/Hind Ⅲ标准分子量对照；M2：φX174 RF DNA/HaeⅢ标准分子量对照。
Figure 2 cDNA insertions of positive clones by PCR amplification
M1：λDNA/Hind Ⅲ molecular weight；M2：φX174 RF DNA/Hae Ⅲ molecular weight.
＃2克隆插入片段长约950bp，根据与其融合的GAL4 AD读码框架推导，其cDNA共编码208个氨基酸残基(图3)。经美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的国际网络BLAST程序检索后发现，N端的203个氨基酸残基与“人核小体组装蛋白相关蛋白”(Human nucleosome assembly protein-related protein，hNRP)161～363aa间序列100%相同，两者仅在C末端有5个氨基酸残基的差别，提示＃2克隆编码蛋白为hNRP的异构体。
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图3 ＃2阳性克隆cDNA序列及推导的氨基酸序列画线部分序列与hNRP相同。
Figure 3 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of ＃2 positive clone The underlined region is identical to hNRP sequence.
＃16克隆插入片段长约800bp，测得400bp序列后，与基因库序列进行同源性比较，发现其100%相同于人载脂蛋白AI(Aplipoprotein A-1，Apo AI)基因序列(图4)。
图4 ＃16克隆cDNA序列及推导的氨基酸序列(部分)画线部分序列与ApoA-I相同。
Figure 4 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of ＃16 clone(partial) The underlined region is identical to Apo A-I sequence.
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讨论
酵母双杂合系统是90年代发展起来的研究蛋白-蛋白之间相互作用的新技术。同传统方法相比，它的主要优点在于蛋白之间的作用是在真核酵母细胞内进行，结果更能反应体内的真实情况。同时该系统还具有很高的敏感性和特异性，在筛库的同时即能获得“诱饵”结合蛋白的基因克隆。因此它在生命科学的各个领域中得到了广泛的应用，迄今，已有上千种蛋白之间的相互作用通过该系统首次被发现。
蛋白-蛋白的特异性结合，是细胞内许多重要生理活动的基础，也是病毒与宿主细胞相互作用的分子基础。应用酵母双杂合系统，细胞内一些病毒结合蛋白相继被发现和证实，由此为起点的生物学意义的研究也取得了一些突破性的进展[9，10，11]。在HCV中，通过筛库发现衣壳蛋白C能与淋巴毒素受体(LT-βR)的胞浆部分结合，进一步研究揭示了C蛋白通过影响LT-βR的信号传导通路而对细胞的凋亡具有调控作用[12，13]。HCV NS5A与干扰素诱生蛋白PKR的结合，也在酵母双杂合系统中首次得到证实，现已阐明这种结合能影响干扰素的抗病毒作用，使病毒逃逸机体的免疫防御[7，14]。因此，了解病毒蛋白与宿主蛋白的特异性结合，有助于揭示病毒蛋白的生物学功能，为阐明病毒的复制与致病机理提供可靠的线索和研究方向。
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以HCV NS5A为“诱饵”进行的酵母双杂合系统筛库，至今国内外尚未见成功报道。除技术因素外，可能还由于NS5A具有潜在的转录激活作用，并非一理想的筛库“诱饵”。NS5A中第163～359aa序列在酵母和哺乳动物细胞中具有很强的转录激活效应，即其自身单独就能激活报告基因的表达[4]。因此尽管以往报道和我们的结果均表明全长NS5A并不具有这种功能，但当与pGAD10/cDNA共转染酵母后，仍出现了许多的假阳性结果。可能因为某些cDNA编码蛋白能非特异性地或短暂地作用于NS5A，使之构型改变后发挥转录潜能造成假阳性。而由cDNA编码蛋白与NS5A特异性结合引起的GAL4 AD的反式作用，则较为稳定和持续。我们最后所获的7个阳性克隆，经反复实验均为阳性，表明编码蛋白与NS5A的结合十分特异和牢固。这种特异性的结合，在＃14、＃42和＃74克隆中已经GST pull-down、免疫共沉淀等其它体内外实验所证实。
核小体组装蛋白-I(Nucleosome assembly protein，NAP-I)为一具有核小体组装功能的蛋白[15]。NAP-I家族基因在动物、植物和酵母中都已被克隆，相互间有35%左右的同源性。hNRP在人低分化细胞中的表达水平显著高于正常分化细胞，提示其在细胞分化中的作用。Simon等发现在细胞中过量表达hNAP后，能促进有丝分裂原对外周血单核细胞及T淋巴细胞的增殖作用[16]。因此，NS5A与hVNP的结合在HCV致癌中是否具有意义，有待于进一步研究证实。此外，hNAP为一存在于细胞核中的蛋白，其与NS5A的结合，提示后者也可能定位于细胞核内。显然NS5A中存在着一段核定位信号序列(NLS)，能携带外源性报告基因进入核内[5]，但转染细胞的免疫荧光染色结果却显示NS5A仅存在于细浆中。NS5A在细胞内的定位，是长期以来人们一直关注和争论的问题。本实验中NS5A能与核蛋白hNAP结合的发现，进一步支持了NS5A在核内存在的可能性。
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载脂蛋白与HCV核心蛋白C的关系，近年已有报道。Barba等发现，在稳定表达C蛋白的细胞以及HCV慢性感染的黑猩猩肝穿刺标本中，C蛋白集中堆积在胞浆内脂肪颗粒的表面。等电聚焦显微镜结果也显示C蛋白与apo A-Ⅱ在细胞中复合存在。C蛋白可能通过载脂蛋白的介导连接于脂肪颗粒表面，影响细胞的脂肪代谢途径，造成丙肝病人的肝脏脂肪化[17]。Soardo等还报道，慢性丙肝患者血中apo A-I及高密度脂蛋白的水平，与病人对α-干扰素的反应有关[18]。本实验发现了HCV非结构蛋白与载脂蛋白的结合，再次提示了HCV感染可能对细胞内脂肪代谢通路有一定的影响。
作者简介：屠红(1966-)，女，江苏常州，讲师，博士，研究方向为肝炎病毒的分子生物学。
Michael M.C.Lai 通讯作者。屠红 联合培养博士生。
作者单位：Deborah Taylor Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；闻玉梅 上海医科大学卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032；Michael M.C.Lai Howard Hughes Medical Institute; Department of Molecular Microbiology and Immunology，University of Southern California，School of Medicine，Los Angeles，CA90033；
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收稿日期：1999-03-26；修回日期：1999-07-06, http://www.100md.com