闽南地区TT病毒的变异及经输血传播的初步证据
作者：张军 杨海杰 罗文新 苏智军 庄立琳 夏宁邵
单位：张军 杨海杰 罗文新 夏宁邵 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室，福建 厦门 361005；苏智军 泉州市第一医院，福建 泉州 362000；庄立琳 中国人民解放军漳州175医院，福建樟州 363000)
关键词：TT病毒；肝炎；输血传播；变异
病毒学报990410 中国分类号：R373.2+1 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)-04-0360-04
VARIATION OF TT VIRUSES IN MINNAN AREA AND EVIDENCE FOR TRANSFUSION TRANSMISSION
ZHANG Jun1, YANG Hai-jie1, LUO Wen-xin1, SU Zhi-jun2, ZHUANG Li-lin3,XIA Ning-shao1
, http://www.100md.com
(1. The State Lab for Tumor Cell Engineering, Xiamen University, Fujian, Shamen 361005, China; 2. Quanzhou First Hospital, Fujian, Quanzhou 362000, China; 3. 175th Hospital of People's Liberation Army, Fujian, Zhangzhou 363000, China)
Abstract: TT virus(TTV)DNA was tested by nested-PCR from sera of hepatitis patients and volunteer blood donors in Minnan area. The amplified segment was a 189 base pair region in TTV ORF2. A total of six sequences were obtained from three non-A to G hepatits patients and two from volunteer blood donors. The sequences were found to be with 82.9% to 99.3% homology to TTV Japanese strain and Chinese strain. The divergence of sequence in these six segments varied from 0.7% to 17.1%, which indicated that the TTV had been existing for a long time in this area. In the serum of a non-A to G hepatitis patient who was negative for TTV DNA in the 14th day of disease course turned to be positive in the 30th day, two TTV sequences were obtained which showed 92.1% nucleotide homology. It indicated that different TTV strains can co-exist in the same person. This patient's blood had been transfused ten times between the collection of his TTV negative sample and his positive serum sample. Seven of the blood donors were traced and sampled for sera, of which three were positive for TTV. For all 161 patients tested, the history of exposure to blood products was associated with an increased risk of TTV infection(relative risk, 3.0; 95% confidence intervals, 1.89～4.81).
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Key words: TT virus； Hepatitis; Transfusion transmission； Variation
TT病毒(TT virus，TTV)是新近发现的被认为与输血后肝炎及其它急、慢性肝炎有关的一种新型单链DNA病毒〔1，2〕。1997年底，日本Mayumi研究小组用代表性差异显示分析法(RDA)，首先从一例非甲-庚型输血后肝炎患者血清中克隆到TTV的部分序列〔1〕，随后又用半巢式PCR获得了78株TTV ORF1的1段356bp的序列进行进化分析，将这78株序列分为2个组4个亚组〔2〕。我们曾根据所报道的TTV序列，在TTV ORF2设计了两对特异性引物，建立了检测血清中TTV样DNA的巢式PCR方法，从福建省泉州市1例非甲一庚型肝炎患者血清中扩增出了一条199bp的特异片段(TS1)，经测序证实，与TTV的同源性为87%，从而证实了TTV样序列在我国非甲-庚型肝炎病人血清中的存在〔3〕。为了解TTV在我国的变异情况，并进一步探讨输血与TTV传播的关系，我们在福建闽南地区对部分TTV阳性肝炎患者及义务献血员血清中的TTV DNA序列进行了测定，并对患者输血史与TTV间的关系进行了初步分析。
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161例肝炎病例分别来自中国人民解放军175医院(漳州)传染科的住院肝炎患者(124例)和福建泉州市第一医院住院肝炎患者(37例)。7份义务献血员血清来自泉州市第一医院。巢式PCR采用本室与厦门泰伦生物工程有限公司联合研制的TTV-DNA巢式PCR检测试剂盒，按产品说明书进行。引物为根据TTV ORF2序列设计的2对特异性PCR引物，外侧引物对TTVF1：5＇-TGCTACGTCACTAACCAC-3＇(nt5～22)，TTVR1：5＇-CTCCTCTGCGGCGTCTCCTTA-3＇(nt733～713)，预计扩增片段长度为729bp；内侧引物对TTVF2：5＇-GTGCACTTCCGAATGGC-3＇(nt95～111)，TTVR2：5＇-GTAATGCCTGCCAATAAAC-3＇(nt283～265)，预计扩增片段长度为189bp。
将PCR扩增产物经PAGE胶回收纯化，在PAGE胶上显示为一条清晰窄带，作为PCR产物直接测序的模板；或将PCR扩增片段用WizardR PCR Preps DNA纯化系统(Promega公司)回收纯化，克隆入GEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α株。采用双链模板测序。双链模板提取采用碱裂解，RNaseA消化，氯仿2次抽提，异丙醇第一次沉淀， PEG-8000第二次沉淀提取。提取的双链模板，1/5量经0.75%琼脂糖凝胶电泳分析，可见超螺旋DNA占80%以上。采用双脱氧链终止法，用T7启动子引物(5＇-TAATACGACTCACTATAGGG-3＇)在ABI PRISMTM377型DNA测序仪上进行Dye Terminator反应，测序所用成套试剂为美国ABI公司产品。
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将所获序列输入计算机，用CLUSTAL X(Julie Thompson and Francois Jeanmougin，CLUSTAL X Multiple Sequence Alignment Program，version 1.5b 1997)和DNASIS软件(Hitachi Software Engineering Co.1992)进行同源性比较。
从161例肝炎患者中共检出43例TTV-DNA阳性。我们对其中两例非甲-庚型肝炎患者的阳性PCR产物进行了克隆测序(TS1、NR2)，结果与该区域仅有的两株序列(TA278和TTVCHN1，分别来自日本和中国，Genbank号分别为AB008394和AF079173)比较，同源性约为92%(表1，图1)。
表1 闽南地区TTV与TTV日本株及中国株部分序列的同源性比较
Table 1 Comparison of nucleotide homology of TT viruses in Minnan area with TTV Japanese strain and TTV Chinese strain
, 百拇医药
TA278
TTVCHN1
S396
S397
TS1
NR2
TT6392
TT6393
TA278
-
99.3
98.6
95.0
, http://www.100md.com
92.3
92.1
86.5
83.7
TTVCHN1
-
99.3
95.7
92.3
92.1
86.5
83.7
S396
, http://www.100md.com
-
95.0
91.5
91.4
85.8
83.0
S397
-
93.0
90.7
85.8
84.4
TS1
, 百拇医药
-
89.3
87.2
87.2
NR2
-
85.7
82.9
TT6392
-
92.1
注：TA278：TTV日本株，Genbank收录号AB008394；TTVCHN1：TTV中国株，Genbank收录号AF079173；S396、S397：来自闽南地区义务献血员，Genbank收录号AF109897(S396)、AF109808(S397)；TS1、NR2、TT6392、TT6393：来自闽南地区非甲-庚型肝炎患者，其中TT6392、TT6393来自同一病人，Genbank收录号AF109810(TS1)、AF109806(NR2)、AF109811(TT6392)，AF109812(TT6393)。
, 百拇医药
Note: TA278: TTV Japanese strain, Genbank accession number: AB008394; TTVCHN1: TTV Chinese strain, Genbank accession number: AF079173; S396, S397: Derived from volunteer blood donors in Minnan area, Genbank accession number: AF109897(S396), AF109808(S397); TS1, NR2, TT6392, TT6393: Derived from non-A to G hepatitis cases, TT6392 and TT6393 were derived from the same serum, Genbank accession number: AF109810(TS1), AF109806(NR2), AF109811(TT6392), AF109812(TT6393).
, 百拇医药
图1 闽南地区TTV与TTV日本株及中国株部分序列的同源性比较
Figure 1 Comparison of homology of partial nucleotide sequcnce of TT viruses in Minnan area with TTV Japanese strain and TTV Chinese strain
＃：缺失Deletion.
另外，有一例非甲-庚型亚急性重症肝炎患者(患者A)，病期第14天时所采第一次血清为TTV DNA阴性，但1月时转为阳性。在第一次采血前已给该患者先后输过10次血，在第一、二次采血间又输过10次血。我们查到了患者A的TTV由阴转阳期间10次所输血的10名供血员中的7名(均为闽南地区的义务献血员)，并采血检测TTV-DNA，结果3例阳性。对其中2份血清(S396、S397)及患者A的第二次血清(S18)巢式PCR产物直接进行测序，结果S396、S397的测序结果十分清晰，但S18的测序结果较混乱，许多位置同时出现数种较强测序峰，提示S18血清中很可能同时存在多种TTV模板，可能分别来自不同的献血员。对S18的PCR产物进行了克隆，挑选了其中两个克隆(TT6392、TT6393)进行了测序，结果与现有序列间的同源性为82%～87%，这两个克隆间的同源性为92.1%(表1，图1)，提示该患者体内可能确实同时存在多株TTV，分别来源于不同的献血员。我们尚未能从该患者的几株TTV序列中发现与该患者献血员的两株序列完全相同的序列，可能与我们正好没能挑到相应的克隆有关，也可能因为该患者体内多种TTV中有部分已获得了较明显的生长优势，从而使其他TTV毒株难以持续存在或是难以检出，目前我们还无法确切地阐明其原因。
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对来自同一地区的这些序列及与来自日本、北京的两株序列的同源性分析表明，地理距离相对遥远的不同地区的TTV之间的同源性可高达98%以上，而同一地区也可同时有同源性较低的不同毒株存在。最近英国两个研究小组通过对TTV ORF1区域部分片段进行的同源性研究也有类似的结果〔4，5〕。目前在日本、中国、英国、北美都已有检出TTV的报道〔1～6〕，而且在各地区都发现毒株间既可有较大的变异，又可与其他地区的毒株间有很高的同源性存在，从而提示TTV很可能是一种分布广泛的、在各地区早已存在的病毒。
最近，Simmonds等〔5〕在义务献血员中，商品化的凝血因子Ⅷ、Ⅸ中都检出了TTV DNA，而且发现血友病人的TTV DNA阳性率明显高于其他人群，而且其阳性率与输血制品的量有明显相关。提示TTV可经输血或血制品而传播，而且现有的血制品制备程序只能部分消除TTV DNA。Charlton等〔6〕的研究同样发现了TTV经血液传播的初步流行病学证据，他们的数据显示，输血对TTV传播的相对危险度为4.5。我们对漳州和泉州161例肝炎病例进行了输血史调查，结果共有13例患者过去有过输血史，他们的TTV的阳性率高达69.23%(9/13)，明显高于无输血史的22.97%(34/148，P<0.001)，相对危险度(RR)为3.01(1.89～4.81)。这一结果以及上述患者A的研究结果都提示，输血是TTV传播的一种重要危险因素。
, http://www.100md.com
*责任作者：夏宁邵
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241: 92-97.
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res 1998, 10: 1-16.
, 百拇医药
3 张军，杨海杰，苏智军，等.从中国非甲-庚型肝炎病人中克隆到TT病毒样DNA序列[J].厦门大学学报(自然科学版),1998，37：315-317.
4 Naoumov N, Petrova E, Thomas M, et al. Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J]. Lancet, 1998, 352: 195-97.
5 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus(TT virus)in blood donors and blood products[J]. Lancet, 1998, 352: 191-95.
6 Charlton M, Adjei P, Poteracha J, et al. TT-virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology, 1998, 28: 839-42.
收稿日期：1998-10-22；修回日期：1998-12-26, 百拇医药
单位：张军 杨海杰 罗文新 夏宁邵 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室，福建 厦门 361005；苏智军 泉州市第一医院，福建 泉州 362000；庄立琳 中国人民解放军漳州175医院，福建樟州 363000)
关键词：TT病毒；肝炎；输血传播；变异
病毒学报990410 中国分类号：R373.2+1 文献标识码：A 文章编号：1000-8721(1999)-04-0360-04
VARIATION OF TT VIRUSES IN MINNAN AREA AND EVIDENCE FOR TRANSFUSION TRANSMISSION
ZHANG Jun1, YANG Hai-jie1, LUO Wen-xin1, SU Zhi-jun2, ZHUANG Li-lin3,XIA Ning-shao1
, http://www.100md.com
(1. The State Lab for Tumor Cell Engineering, Xiamen University, Fujian, Shamen 361005, China; 2. Quanzhou First Hospital, Fujian, Quanzhou 362000, China; 3. 175th Hospital of People's Liberation Army, Fujian, Zhangzhou 363000, China)
Abstract: TT virus(TTV)DNA was tested by nested-PCR from sera of hepatitis patients and volunteer blood donors in Minnan area. The amplified segment was a 189 base pair region in TTV ORF2. A total of six sequences were obtained from three non-A to G hepatits patients and two from volunteer blood donors. The sequences were found to be with 82.9% to 99.3% homology to TTV Japanese strain and Chinese strain. The divergence of sequence in these six segments varied from 0.7% to 17.1%, which indicated that the TTV had been existing for a long time in this area. In the serum of a non-A to G hepatitis patient who was negative for TTV DNA in the 14th day of disease course turned to be positive in the 30th day, two TTV sequences were obtained which showed 92.1% nucleotide homology. It indicated that different TTV strains can co-exist in the same person. This patient's blood had been transfused ten times between the collection of his TTV negative sample and his positive serum sample. Seven of the blood donors were traced and sampled for sera, of which three were positive for TTV. For all 161 patients tested, the history of exposure to blood products was associated with an increased risk of TTV infection(relative risk, 3.0; 95% confidence intervals, 1.89～4.81).
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Key words: TT virus； Hepatitis; Transfusion transmission； Variation
TT病毒(TT virus，TTV)是新近发现的被认为与输血后肝炎及其它急、慢性肝炎有关的一种新型单链DNA病毒〔1，2〕。1997年底，日本Mayumi研究小组用代表性差异显示分析法(RDA)，首先从一例非甲-庚型输血后肝炎患者血清中克隆到TTV的部分序列〔1〕，随后又用半巢式PCR获得了78株TTV ORF1的1段356bp的序列进行进化分析，将这78株序列分为2个组4个亚组〔2〕。我们曾根据所报道的TTV序列，在TTV ORF2设计了两对特异性引物，建立了检测血清中TTV样DNA的巢式PCR方法，从福建省泉州市1例非甲一庚型肝炎患者血清中扩增出了一条199bp的特异片段(TS1)，经测序证实，与TTV的同源性为87%，从而证实了TTV样序列在我国非甲-庚型肝炎病人血清中的存在〔3〕。为了解TTV在我国的变异情况，并进一步探讨输血与TTV传播的关系，我们在福建闽南地区对部分TTV阳性肝炎患者及义务献血员血清中的TTV DNA序列进行了测定，并对患者输血史与TTV间的关系进行了初步分析。
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161例肝炎病例分别来自中国人民解放军175医院(漳州)传染科的住院肝炎患者(124例)和福建泉州市第一医院住院肝炎患者(37例)。7份义务献血员血清来自泉州市第一医院。巢式PCR采用本室与厦门泰伦生物工程有限公司联合研制的TTV-DNA巢式PCR检测试剂盒，按产品说明书进行。引物为根据TTV ORF2序列设计的2对特异性PCR引物，外侧引物对TTVF1：5＇-TGCTACGTCACTAACCAC-3＇(nt5～22)，TTVR1：5＇-CTCCTCTGCGGCGTCTCCTTA-3＇(nt733～713)，预计扩增片段长度为729bp；内侧引物对TTVF2：5＇-GTGCACTTCCGAATGGC-3＇(nt95～111)，TTVR2：5＇-GTAATGCCTGCCAATAAAC-3＇(nt283～265)，预计扩增片段长度为189bp。
将PCR扩增产物经PAGE胶回收纯化，在PAGE胶上显示为一条清晰窄带，作为PCR产物直接测序的模板；或将PCR扩增片段用WizardR PCR Preps DNA纯化系统(Promega公司)回收纯化，克隆入GEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α株。采用双链模板测序。双链模板提取采用碱裂解，RNaseA消化，氯仿2次抽提，异丙醇第一次沉淀， PEG-8000第二次沉淀提取。提取的双链模板，1/5量经0.75%琼脂糖凝胶电泳分析，可见超螺旋DNA占80%以上。采用双脱氧链终止法，用T7启动子引物(5＇-TAATACGACTCACTATAGGG-3＇)在ABI PRISMTM377型DNA测序仪上进行Dye Terminator反应，测序所用成套试剂为美国ABI公司产品。
, http://www.100md.com
将所获序列输入计算机，用CLUSTAL X(Julie Thompson and Francois Jeanmougin，CLUSTAL X Multiple Sequence Alignment Program，version 1.5b 1997)和DNASIS软件(Hitachi Software Engineering Co.1992)进行同源性比较。
从161例肝炎患者中共检出43例TTV-DNA阳性。我们对其中两例非甲-庚型肝炎患者的阳性PCR产物进行了克隆测序(TS1、NR2)，结果与该区域仅有的两株序列(TA278和TTVCHN1，分别来自日本和中国，Genbank号分别为AB008394和AF079173)比较，同源性约为92%(表1，图1)。
表1 闽南地区TTV与TTV日本株及中国株部分序列的同源性比较
Table 1 Comparison of nucleotide homology of TT viruses in Minnan area with TTV Japanese strain and TTV Chinese strain
, 百拇医药
TA278
TTVCHN1
S396
S397
TS1
NR2
TT6392
TT6393
TA278
-
99.3
98.6
95.0
, http://www.100md.com
92.3
92.1
86.5
83.7
TTVCHN1
-
99.3
95.7
92.3
92.1
86.5
83.7
S396
, http://www.100md.com
-
95.0
91.5
91.4
85.8
83.0
S397
-
93.0
90.7
85.8
84.4
TS1
, 百拇医药
-
89.3
87.2
87.2
NR2
-
85.7
82.9
TT6392
-
92.1
注：TA278：TTV日本株，Genbank收录号AB008394；TTVCHN1：TTV中国株，Genbank收录号AF079173；S396、S397：来自闽南地区义务献血员，Genbank收录号AF109897(S396)、AF109808(S397)；TS1、NR2、TT6392、TT6393：来自闽南地区非甲-庚型肝炎患者，其中TT6392、TT6393来自同一病人，Genbank收录号AF109810(TS1)、AF109806(NR2)、AF109811(TT6392)，AF109812(TT6393)。
, 百拇医药
Note: TA278: TTV Japanese strain, Genbank accession number: AB008394; TTVCHN1: TTV Chinese strain, Genbank accession number: AF079173; S396, S397: Derived from volunteer blood donors in Minnan area, Genbank accession number: AF109897(S396), AF109808(S397); TS1, NR2, TT6392, TT6393: Derived from non-A to G hepatitis cases, TT6392 and TT6393 were derived from the same serum, Genbank accession number: AF109810(TS1), AF109806(NR2), AF109811(TT6392), AF109812(TT6393).
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图1 闽南地区TTV与TTV日本株及中国株部分序列的同源性比较
Figure 1 Comparison of homology of partial nucleotide sequcnce of TT viruses in Minnan area with TTV Japanese strain and TTV Chinese strain
＃：缺失Deletion.
另外，有一例非甲-庚型亚急性重症肝炎患者(患者A)，病期第14天时所采第一次血清为TTV DNA阴性，但1月时转为阳性。在第一次采血前已给该患者先后输过10次血，在第一、二次采血间又输过10次血。我们查到了患者A的TTV由阴转阳期间10次所输血的10名供血员中的7名(均为闽南地区的义务献血员)，并采血检测TTV-DNA，结果3例阳性。对其中2份血清(S396、S397)及患者A的第二次血清(S18)巢式PCR产物直接进行测序，结果S396、S397的测序结果十分清晰，但S18的测序结果较混乱，许多位置同时出现数种较强测序峰，提示S18血清中很可能同时存在多种TTV模板，可能分别来自不同的献血员。对S18的PCR产物进行了克隆，挑选了其中两个克隆(TT6392、TT6393)进行了测序，结果与现有序列间的同源性为82%～87%，这两个克隆间的同源性为92.1%(表1，图1)，提示该患者体内可能确实同时存在多株TTV，分别来源于不同的献血员。我们尚未能从该患者的几株TTV序列中发现与该患者献血员的两株序列完全相同的序列，可能与我们正好没能挑到相应的克隆有关，也可能因为该患者体内多种TTV中有部分已获得了较明显的生长优势，从而使其他TTV毒株难以持续存在或是难以检出，目前我们还无法确切地阐明其原因。
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对来自同一地区的这些序列及与来自日本、北京的两株序列的同源性分析表明，地理距离相对遥远的不同地区的TTV之间的同源性可高达98%以上，而同一地区也可同时有同源性较低的不同毒株存在。最近英国两个研究小组通过对TTV ORF1区域部分片段进行的同源性研究也有类似的结果〔4，5〕。目前在日本、中国、英国、北美都已有检出TTV的报道〔1～6〕，而且在各地区都发现毒株间既可有较大的变异，又可与其他地区的毒株间有很高的同源性存在，从而提示TTV很可能是一种分布广泛的、在各地区早已存在的病毒。
最近，Simmonds等〔5〕在义务献血员中，商品化的凝血因子Ⅷ、Ⅸ中都检出了TTV DNA，而且发现血友病人的TTV DNA阳性率明显高于其他人群，而且其阳性率与输血制品的量有明显相关。提示TTV可经输血或血制品而传播，而且现有的血制品制备程序只能部分消除TTV DNA。Charlton等〔6〕的研究同样发现了TTV经血液传播的初步流行病学证据，他们的数据显示，输血对TTV传播的相对危险度为4.5。我们对漳州和泉州161例肝炎病例进行了输血史调查，结果共有13例患者过去有过输血史，他们的TTV的阳性率高达69.23%(9/13)，明显高于无输血史的22.97%(34/148，P<0.001)，相对危险度(RR)为3.01(1.89～4.81)。这一结果以及上述患者A的研究结果都提示，输血是TTV传播的一种重要危险因素。
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*责任作者：夏宁邵
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241: 92-97.
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res 1998, 10: 1-16.
, 百拇医药
3 张军，杨海杰，苏智军，等.从中国非甲-庚型肝炎病人中克隆到TT病毒样DNA序列[J].厦门大学学报(自然科学版),1998，37：315-317.
4 Naoumov N, Petrova E, Thomas M, et al. Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J]. Lancet, 1998, 352: 195-97.
5 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus(TT virus)in blood donors and blood products[J]. Lancet, 1998, 352: 191-95.
6 Charlton M, Adjei P, Poteracha J, et al. TT-virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology, 1998, 28: 839-42.
收稿日期：1998-10-22；修回日期：1998-12-26, 百拇医药