介绍一种无菌分离和体外培养旋毛虫成虫的简便方法
作者：申丽洁 朱声华 罗仲金
单位：华西医科大学寄生虫学教研室 成都 610041
关键词：
实用寄生虫病杂志990206 现有研究表明，旋毛虫成虫、新生蚴和肌肉幼虫，在形态和免疫反应等方面既有共同性，又有很大的不同。分别研究它们的抗原成份，进而分离、纯化具有保护作用的抗原组份，在旋毛虫免疫研究中具有重要意义。若要进行这方面的研究，首先就要有无菌分离和培养虫体的好方法。鉴于现有无菌分离、培养旋毛虫虫体的方法较繁杂，且容易被污染。我们在工作中摸索出一种更为简便、经济的无菌分离和培养旋毛虫成虫的方法，现介绍如下：
1 材料和方法
1.1 动物感染及成虫的收集 处死旋毛虫保种的SD大鼠，用1%HCl—1%胃蛋白酶的人工消化液消化大鼠肌肉，经过滤、反复水洗沉淀可得到纯净的脱囊幼虫。每只成年SD大鼠经口灌服10000条旋毛虫脱囊幼虫，感染后第5天禁食，第6天在已乙醚麻醉下解剖大鼠，取出并纵行剖开小肠，再将小肠剪成2—3cm的肠段。在无菌生理盐水中轻轻荡洗小肠段3次，去除剩余的肠内容物。然后将小肠段平铺于线虫幼虫分离器[1]分离筛滤布上(以约95目/口 寸的的确凉布作为滤布)，加入37℃预温的无菌生理盐水至刚好浸没小肠为宜。将其置于37℃恒温水浴箱内3—4小时，这期间大部分成虫主动从小肠上皮细胞内钻出并穿过滤布到生理盐水中，从而得到较纯净的成虫。
, 百拇医药
1.2 成虫的培养 将线虫幼虫分离器从37℃恒温水浴箱内取出，移去分离筛，用自然沉淀法收集分离器外套生理盐水中的成虫并计数。将纯净的成虫在含青、链霉素各800u/ml的无菌生理盐水中离心洗涤3次(按500r/min离心10分钟)，然后再用含青、链霉素各100u/ml的不含小牛血清的RPMI—1640培养液(美国Sigma公司产品，按说明书配制，抽滤除菌)离心洗涤1次。采用上述RPMI—1640培养液，按100条成虫/ml稀释，每管4ml分装于培养管内。将培养管插入转数为7.5转/小时的旋转培养装置上(XS602旋转培养装置，北京西城医疗器械三厂，1979年出厂)，置37℃隔水式电热恒温培养箱内(上海市跃进医疗器械一厂，1986年出厂)旋转培养，共培养7天。每天取培养管在倒置显微镜下观察成虫存活及产新生蚴情况，并按文献[2]的方法分离成虫和新生蚴，成虫继续培养，收集的培养液按1000r/min离心10分钟，吸取上清液，-20℃保存。
2 结果与讨论 我们曾选择8只成年SD大鼠，每只大鼠感染10000条旋毛虫脱囊幼虫。采用线虫幼虫分离器获得纯净的成虫共47000条，成虫回收率为58*75%。成虫分离时，肉眼观察可见分离器外套生理盐水中旋毛虫成虫呈絮状或小团块状聚集，倒置显微镜下观察脱落的肠粘膜碎片较少，由此可减少成虫洗涤次数及虫体在洗涤过程中丢失的机会，得到较纯净的成虫。结果表明：用线虫幼虫分离器分离旋毛虫成虫效果好。采用旋转培养装置时，培养液中的成虫运动活泼，死亡虫体极少。培养开始后4天内，培养液中可见到少量的新生蚴，新生蚴活动欠佳，多呈僵硬状态，并且数量明显逐天减少趋势，培养第5天后已基本无新生蚴产出。分析原因可能是：①普通恒温培养箱内不能维持一定浓度的CO2，导致雌虫产虫量降低[3]。②石磊等(1993)[4]在5%CO2条件下，用M199中培养新生蚴存活5天，在添加20%小牛血清的M199中培养7天，新生蚴的死亡率在10%以下，之后死亡率迅速升高，到14天全部死亡。本次培养是为了收集成虫排泄分泌物，所用的培养液中未加入小牛血清，加之CO2浓度低，影响了新生蚴的生存，所以成虫产新生蚴量少且存活时间短，减少了新生蚴对成虫排泄分泌物抗原成分的影响。
, 百拇医药
与Despommier(1973)[5]的热移动装置(Thermal Migration Device)和史晓红等(1993)[6]应用贝尔曼氏法原理设计的装置比较，我们采用线虫幼虫分离器分离旋毛虫成虫具有操作简便，易于消毒灭菌，对分离 虫体的活力无明显影响等优点。恒温培养箱内旋转装置培养成虫，有利于虫体对培养液中有效成分的充分利用，保持虫体活力，且较经济。
3 注意事项 ①分离成虫时间不宜超过4小时，否则肠管易变质，分离器外套中生理盐水变浑浊，增加了细菌污染的机会。②因为青霉素水溶液易分解，分解后杀菌能力降低，故最好使用时新配制。③为防止细菌污染，在成虫清洗过程中，青、链霉素可用到800u/ml，对虫体活力无明显影响。
4 参考文献
1 罗仲金，等.犬弓首线虫幼虫培养、排泄分泌抗原的制备和分析.中国人兽共患病杂志 1991；7(2)∶60-62.
, http://www.100md.com
2 薛里，等.一种大量收集旋毛虫新生幼虫的简便方法.中国寄生虫病防治杂志 1993；6(1)∶15.
3 许汴利，等.一种体外培养旋毛虫成虫收集新生幼虫的改进方法.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1991；9(3)∶230.
4 石磊，等.旋毛虫新生幼虫的体外培养.中国兽医科技1993；23(9)∶23-24.
5 Despommier,DD. A circular thermal migration device for the rapid collection of large numbers of intestinal helminths. J Parasitol 1973;59(5)∶933-935.
6 史晓红，等.旋毛虫成虫、新生幼虫和肌幼虫的收集方法.中国兽医科技1993；23(12)∶26-27., 百拇医药
单位：华西医科大学寄生虫学教研室 成都 610041
关键词：
实用寄生虫病杂志990206 现有研究表明，旋毛虫成虫、新生蚴和肌肉幼虫，在形态和免疫反应等方面既有共同性，又有很大的不同。分别研究它们的抗原成份，进而分离、纯化具有保护作用的抗原组份，在旋毛虫免疫研究中具有重要意义。若要进行这方面的研究，首先就要有无菌分离和培养虫体的好方法。鉴于现有无菌分离、培养旋毛虫虫体的方法较繁杂，且容易被污染。我们在工作中摸索出一种更为简便、经济的无菌分离和培养旋毛虫成虫的方法，现介绍如下：
1 材料和方法
1.1 动物感染及成虫的收集 处死旋毛虫保种的SD大鼠，用1%HCl—1%胃蛋白酶的人工消化液消化大鼠肌肉，经过滤、反复水洗沉淀可得到纯净的脱囊幼虫。每只成年SD大鼠经口灌服10000条旋毛虫脱囊幼虫，感染后第5天禁食，第6天在已乙醚麻醉下解剖大鼠，取出并纵行剖开小肠，再将小肠剪成2—3cm的肠段。在无菌生理盐水中轻轻荡洗小肠段3次，去除剩余的肠内容物。然后将小肠段平铺于线虫幼虫分离器[1]分离筛滤布上(以约95目/口 寸的的确凉布作为滤布)，加入37℃预温的无菌生理盐水至刚好浸没小肠为宜。将其置于37℃恒温水浴箱内3—4小时，这期间大部分成虫主动从小肠上皮细胞内钻出并穿过滤布到生理盐水中，从而得到较纯净的成虫。
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1.2 成虫的培养 将线虫幼虫分离器从37℃恒温水浴箱内取出，移去分离筛，用自然沉淀法收集分离器外套生理盐水中的成虫并计数。将纯净的成虫在含青、链霉素各800u/ml的无菌生理盐水中离心洗涤3次(按500r/min离心10分钟)，然后再用含青、链霉素各100u/ml的不含小牛血清的RPMI—1640培养液(美国Sigma公司产品，按说明书配制，抽滤除菌)离心洗涤1次。采用上述RPMI—1640培养液，按100条成虫/ml稀释，每管4ml分装于培养管内。将培养管插入转数为7.5转/小时的旋转培养装置上(XS602旋转培养装置，北京西城医疗器械三厂，1979年出厂)，置37℃隔水式电热恒温培养箱内(上海市跃进医疗器械一厂，1986年出厂)旋转培养，共培养7天。每天取培养管在倒置显微镜下观察成虫存活及产新生蚴情况，并按文献[2]的方法分离成虫和新生蚴，成虫继续培养，收集的培养液按1000r/min离心10分钟，吸取上清液，-20℃保存。
2 结果与讨论 我们曾选择8只成年SD大鼠，每只大鼠感染10000条旋毛虫脱囊幼虫。采用线虫幼虫分离器获得纯净的成虫共47000条，成虫回收率为58*75%。成虫分离时，肉眼观察可见分离器外套生理盐水中旋毛虫成虫呈絮状或小团块状聚集，倒置显微镜下观察脱落的肠粘膜碎片较少，由此可减少成虫洗涤次数及虫体在洗涤过程中丢失的机会，得到较纯净的成虫。结果表明：用线虫幼虫分离器分离旋毛虫成虫效果好。采用旋转培养装置时，培养液中的成虫运动活泼，死亡虫体极少。培养开始后4天内，培养液中可见到少量的新生蚴，新生蚴活动欠佳，多呈僵硬状态，并且数量明显逐天减少趋势，培养第5天后已基本无新生蚴产出。分析原因可能是：①普通恒温培养箱内不能维持一定浓度的CO2，导致雌虫产虫量降低[3]。②石磊等(1993)[4]在5%CO2条件下，用M199中培养新生蚴存活5天，在添加20%小牛血清的M199中培养7天，新生蚴的死亡率在10%以下，之后死亡率迅速升高，到14天全部死亡。本次培养是为了收集成虫排泄分泌物，所用的培养液中未加入小牛血清，加之CO2浓度低，影响了新生蚴的生存，所以成虫产新生蚴量少且存活时间短，减少了新生蚴对成虫排泄分泌物抗原成分的影响。
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与Despommier(1973)[5]的热移动装置(Thermal Migration Device)和史晓红等(1993)[6]应用贝尔曼氏法原理设计的装置比较，我们采用线虫幼虫分离器分离旋毛虫成虫具有操作简便，易于消毒灭菌，对分离 虫体的活力无明显影响等优点。恒温培养箱内旋转装置培养成虫，有利于虫体对培养液中有效成分的充分利用，保持虫体活力，且较经济。
3 注意事项 ①分离成虫时间不宜超过4小时，否则肠管易变质，分离器外套中生理盐水变浑浊，增加了细菌污染的机会。②因为青霉素水溶液易分解，分解后杀菌能力降低，故最好使用时新配制。③为防止细菌污染，在成虫清洗过程中，青、链霉素可用到800u/ml，对虫体活力无明显影响。
4 参考文献
1 罗仲金，等.犬弓首线虫幼虫培养、排泄分泌抗原的制备和分析.中国人兽共患病杂志 1991；7(2)∶60-62.
, http://www.100md.com
2 薛里，等.一种大量收集旋毛虫新生幼虫的简便方法.中国寄生虫病防治杂志 1993；6(1)∶15.
3 许汴利，等.一种体外培养旋毛虫成虫收集新生幼虫的改进方法.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1991；9(3)∶230.
4 石磊，等.旋毛虫新生幼虫的体外培养.中国兽医科技1993；23(9)∶23-24.
5 Despommier,DD. A circular thermal migration device for the rapid collection of large numbers of intestinal helminths. J Parasitol 1973;59(5)∶933-935.
6 史晓红，等.旋毛虫成虫、新生幼虫和肌幼虫的收集方法.中国兽医科技1993；23(12)∶26-27., 百拇医药