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编号:10279088
大鼠颌下腺GnRH及其受体的免疫组织化学双标记和年龄变化
http://www.100md.com 《解剖学报》 1998年第1期
     作者:金花淑* 黄威权 张金山 文永植* 张崇理**

    单位:第四军医大学组织学胚胎学教研室,西安 710032;*延边医学院组织学胚胎学教研室,延吉;**中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室,北京

    关键词:GnRH;GnRH受体;双标记;年龄变化;免疫组织化学;颌下腺

    解剖学报980120

     摘 要 用免疫组织化学法,以邻片双标记技术研究了大鼠颌下腺内GnRH及GnRH受

    体的分布;并对不同发育阶段大鼠颌下腺内GnRH及其受体进行了原位定量分析。结果
, 百拇医药
    表明,雄性成年大鼠颌下腺浆液性腺泡的腺上皮细胞及各级导管上皮细胞既呈GnRH又

    呈GnRH受体免疫反应性。60d龄内,大鼠颌下腺的GnRH及其受体的含量随年龄的增长

    而增多,60d龄~90d龄,其含量相对恒定。以上结果提示,GnRH可能以自分泌的方式

    参与了颌下腺的发育成熟过程及分泌功能的调节。

    促性腺激素释放激素(GnRH)主要分布于下丘脑[1],它对垂体前叶促性腺激素的释放

    起重要的调节作用。但随着研究的深入,人们发现下丘脑以外的许多器官也存在GnRH,而且还证明不同器官的GnRH发挥着不同的功能[2]。我们先前的研究发现大鼠胃、肠、胰能自身合成GnRH[3,4]。新近我们又证明大鼠颌下腺的腺泡上皮细胞和导管上皮细胞不
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    仅含有GnRH免疫反应性物质,而且含有GnRH-mRNA杂交信号[5],说明颌下腺也能自身

    合成GnRH。本实验用免疫组织化学法,研究了大鼠颌下腺GnRH及其受体的共存关系及

    相对含量的年龄变化,为了解GnRH对颌下腺发育成熟过程的可能功能意义及调节方式

    提供形态学依据。

    材料和方法

    1.试剂

    兔抗GnRH抗体由中国科学院动物研究所生殖内分泌研究室制备和提供。GnRH抗独

    特型抗体由本室自制。链霉亲合素-生物素复合物(SABC)试剂盒为武汉博士德生物工程
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    公司产品。

    2.组织材料

    雄性SD大鼠30只分为6组,每组5只;分别为1d龄、5d龄、12d龄、30d龄、60d龄和

    90d龄。动物在戊巴比妥钠麻醉下剪开右心房放血处死,立即取出颌下腺投入Bouin液固

    定12h左右,石蜡包埋后切成2μm厚的切片,贴于涂有铬钒明胶的载玻片上。为便于比

    较,各年龄组的标本均贴于同一张载玻片上进行免疫组织化学染色。

    3.免疫组织化学反应程序

    切片经脱蜡水化后,按免疫组织化学ABC法程序进行染色。兔抗GnRH抗体及GnRH
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    抗独特型抗体稀释度分别为1∶4 000和1∶200;生物素标记的羊抗免lgG抗体稀释度为

    1∶200;SABC复合物的稀释度为1∶100。第1抗体于4℃冰箱孵育过夜,生物素标记的

    羊抗兔lgG抗体于室温孵育1h,SABC复合物室温孵育30min。阴性对照试验包括用正常

    兔血清取代第1抗体和用PBS取代第1抗体,其余步骤同上。

    4.邻片免疫组织化学双标记法

    于90d龄组大鼠颌下腺切片中选相邻切片,分别以GnRH抗体和GnRH抗独特型抗体,按上述免疫组织化学反应程序进行邻片双标记研究。

    5.GnRH及其受体免疫反应性物质的原位定量
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    用Q-500图像分析仪(美国Leica公司)对各年龄组的GnRH及GnRH受体免疫反应性物

    质的相对含量进行定量,每例测10个细胞,每组测50个细胞,用计算机打出每个细胞

    GnRH及其受体相对含量的平均值及标准差,然后进行t检验统计学处理。

    结 果

    GnRH及GnRH受体免疫反应性细胞呈棕色,背底不着色,反差明显,易于识别,两

    种阴性对照试验均呈阴性反应。

    1.邻片的GnRH及GnRH受体的分布

    GnRH及GnRH受体免疫反应性细胞在雄性成年大鼠(90d龄)颌下腺的分布较广泛,浆
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    液性腺泡的腺上皮细胞、闰管、颗粒曲管、分泌管、排泄管的管壁上皮细胞均呈GnRH

    免疫反应性,阳性反应物质定位于胞质内,胞核呈阴性;导管上皮细胞的染色程度较腺

    泡上皮细胞为强(图1)。邻片的同一结构GnRH受体也呈免疫反应性,细胞内阳性物质的

    分布亦与GnRH的相类似(图2)。

    2.不同年龄大鼠颌下腺内GnRH的分布及相对含量的变化

    生后1~5d,大鼠颌下腺内的GnRH免疫反应性细胞仅分布在分泌管和小叶内导管的

    上皮细胞;生后12d,GnRH免疫反应性细胞开始在浆液性腺泡上皮细胞出现;生后30d,阳性细胞数较12d明显增多;生后60d,阳性细胞数进一步增多;生后90d阳性细胞的分
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    布与60d大鼠基本相同(图3~5)。原位定量的结果见表1,GnRH免疫反应性物质在颌下

    腺的相对含量随着年龄的增长而增加,其中1d龄~5d龄组,GnRH的相对含量增加较慢,两组间的相对含量无显著差别(P>0.05),从5~60d龄组其相对含量增加较快,相邻两

    年龄组间GnRH的相对含量有显著差别(P<0.05),而60d龄~90d龄组GnRH的相对含量基

    本恒定,两组间差别无显著性意义(P>0.05)。

    3.不同年龄大鼠颌下腺内GnRH受体的分布及相对含量的变化

    生后1d大鼠的颌下腺基本无GnRH受体免疫反应性;生后5d的大鼠免疫反应性也

, 百拇医药     只限于一些导管的上皮细胞;生后12d,阳性细胞开始在浆液性腺泡上皮出现;生后

    30d,阳性细胞数明显增多;生后60d阳性细胞数进一步增加;生后90d的大鼠,阳性细

    胞的分布与60d的大鼠基本相同(图6~8)。同时GnRH受体在不同年龄的大鼠颌下腺的相

    对含量也不同(表2),从1d龄~12d龄组相对含量增加较慢(P>0.05);从12d龄~60d龄组增

    加较快,相邻两年龄组间GnRH受体的相对含量差别显著(P<0.05);90d龄组GnRH受体

    的含量较60d龄组虽有所增加,但无显著性差别(P>0.05)。

    表1不同年龄大鼠颌下腺GnRH免疫反应性物质的含量
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    Table 1 The contentof GnRH immunoreactive productin submaxillary gland of different

    aged rats

    动物年龄组

    group of

    differentage

    例 数

    number of

    animals

    检测细胞数

    number of
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    examined cells

    相对含量/细胞(x±s)

    relative amount/cell

    P

    90d

    5

    50

    0.0765±0.0586

    60d

    5

    50

    0.0724±0.0524d
, 百拇医药
    <0.05(d vs c)

    30d

    5

    50

    0.0348±0.0122c

    <0.05(c vs b)

    12d

    5

    50

    0.0226±0.0051b

    <0.05(b vs a)

    5d
, 百拇医药
    5

    50

    0.0167±0.0028a

    1d

    5

    50

    0.0151±0.0023

    表2 不同年龄大鼠颌下腺GnRH受体的免疫反应性物质的含量

    Table 2 The contentof GnRH receptor immunoreactiveproduct in submaxillary gland ofdifferent

    aged rats
, 百拇医药
    动物年龄组

    group of

    differentage

    例 数

    number of

    animals

    检测细胞数

    number of

    examined cells

    相对含量/细胞(x±s)

    relative amount/cell

, 百拇医药     P

    90d

    5

    50

    0.0461±0.0107

    60d

    5

    50

    0.0451±0.0102c

    <0.05(c vs b)

    30d

    5

    50
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    0.0311±0.0049b

    <0.05(b vs a)

    12d

    5

    50

    0.0243±0.0030a

    5d

    5

    50

    0.0214±0.0023

    1d

    5
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    50

    0.0202±0.0021

    讨 论

    有资料表明[6],大鼠颌下腺在14d胚龄时即开始发育,至出生时已具备分泌功能,但从出生到出生后两周这段时间内,腺泡和导管结构的成熟变化非常显著,到出生后

    40d左右其腺泡结构才与成鼠相似[7]。颌下腺含有20多种生物活性物质,其中有的已

    被证明随着年龄的增长而增多[8]。本实验发现,在60d龄内大鼠颌下腺GnRH及其受体

    免疫反应性细胞数及细胞内GnRH及其受体免疫反应性产物的相对含量均随年龄的增

, http://www.100md.com     长而逐渐增多。60d龄~90d龄则维持相对恒定。提示GnRH可能参与了颌下腺发育成熟

    过程的调节,GnRH受体介导了这种调节。我们先前的研究发现,颌下腺能自分泌视

    网膜节细胞神经诱向因子(RGNTF)[9]和5-羟色胺(5-HT)[10],本实验用邻片免疫组织化

    学双标记法证明,颌下腺的浆液性腺泡及各级导管的上皮细胞既呈GnRH免疫反应性,又呈GnRH受体免疫反应性;先前的原位杂交组织化学研究亦发现大鼠颌下腺的浆液

    性腺泡及导管上皮细胞可表达GnRH-mRNA[5],这些结果均提示颌下腺能合成和分泌

    GnRH,GnRH可能以自分泌方式对颌下腺的发育成熟过程或分泌功能进行调节;但这
, 百拇医药
    一问题尚需进一步的实验加以证实。

    收稿1997-01 修回 1997-06

    本文图1~8见插图第17页

    图 版 说 明

    图190d龄大鼠颌下腺导管(a)上皮细胞及浆液性腺泡(b)呈GnRH免疫反应性×200(下同)

    图2 90d龄大鼠颌下腺导管(a)上皮细胞及浆液性腺泡(b)呈GnRH受体免疫反应性

    图3 示5d龄大鼠颌下腺GnRH免疫反应性

    图4 示60d龄大鼠颌下腺GnRH免疫反应性
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    图5 示90d龄大鼠颌下腺GnRH免疫反应性

    图6 示5d龄大鼠颌下腺GnRH受体免疫反应性

    图7 示60d龄大鼠颌下腺GnRH受体免疫反应性

    图8 示90d龄大鼠颌下腺GnRH受体免疫反应性

    Explanationof figures

    Fig.1 The epithelialcells of the duct(a) and the serous acinus(b) showed GnRH

    immunreactivity.×200(The same as follows)

    Fig.2 The epithelial cells of the duct(a)and the serous acinus(b)showed GnRHR
, 百拇医药
    immunreactivity.

    Fig.3 Showing GnRH immunoreactivity in the submaxillary gland ofthe 5th day male rat.

    Fig.4 Showing GnRH immunoreactivity in the submaxillary gland ofthe 60th day male rat.

    Fig.5 Showing GnRH immunoreactivity in the submaxillary gland ofthe 90th day male rat.

    Fig.6 Showing GnRH receptor immunoreactivity in the submaxillarygland of the 5th day
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    male rat.

    Fig.7 Showing GnRH receptor immunoreactivity in the submaxillarygland of the 60th day

    male rat.

    Fig.8 Showing GnRH receptor immunoreactivity in the submaxillarygland of the 90th day

    male rat.

    参 考 文 献

    [1] SharpRM.Extra-pituitary actions of LHRH and itsagonists.Nature,1980,286(5768);12
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    [2] Stell WK,Walker SE,Chohan KS,et al.The goldfish nervesterminalis:A luteinizing

    hormonereleasing hormone and molluscancardioexcitatory peptide immunoreactive

    olfactoretinal pathway.Proc Natl Acad sciUSA,1984,81(3):940

    [3] 黄威权,张崇理.GnRH免疫活性细胞和神经在大鼠胃肠胰分布的初步研究.解剖学

    报,1990,21(3):299

    [4] 黄威权,向正华,孟 琳.促性腺激素释放激素mRNA阳性细胞在大鼠胃肠胰系统的分
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    布.解剖学报,1996,27(2);189

    [5] 金花淑,黄威权,张金山等.大鼠下颌下腺GnRH及GnRH\|mRNA的免疫组织化学与原

    位杂交研究.动物学报,1997(待发表)

    [6] Redman RS.Development of salivary gland In:Sreebny LM(ed)Thesalivary system.Boca

    Raton,CRC Press,1987,2-17

    [7] Virta E.TormW,Junsitalo H,et al.Substance P and neurokinin A immunoreactivenerve

    fiberes in the developing salivary glandsof the rat.Histochemisty,1992,98(6):317
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    [8] Hendry IA.Developmental changes in tissue and plasmaconcentration of the biologically

    active species of nerve growth factor inthe mouse,by using a twosites radioimmunoassay.

    Biochem J,1972,128(5):1265

    [9] 黄威权,任 峰,周明华.大鼠下颌下腺自分泌视网膜节细胞神经诱向因子的形态学

    证据,科学通报,1992,37(17):1607

    [10] 王 炜,黄威权,苏慧慈.5-羟色胺及其受体在大鼠颌下腺的免疫组织化学定位.解剖
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    学报,1996,27(2):198

    IMMUNOHISTOCHEMICALDOUBLE-LABEL AND AGED

    CHANGES OF GnRH AND ITS RECEPTOR IN

    SUBMAXILLARY GLAND OF RATS

    JinHuashu,Huang Weiquan,Zhang Jinshan,Wen Yongzhi,ZhangChongli

    (Department ofHistology and Embryology,The Fourth Military MedicalUniversity,Xi′an)
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    By immunohistochemical method,thedouble-label and aged changes of GnRH and its

    receptor in submaxillary gland of male rats were studied.Theresults showed that the glandular

    epithelial cells of serous acinus and epithelial cells in allgland ducts,presented not only GnRH

    but also GnRH receptor immunoreactivity.The relative contents ofGnRH and its receptors in

, http://www.100md.com     rat submaxillary glands increased with the age during postnatal60 day and maintained this

    level from the 60th day to the 90th day after birth.Thesesuggested the GnRH in the submaxillary

    glands may involves in the regulation of its developmental andmature process and its secretion

    function by autocrine way.

     KEY WORDS GnRH;GnRHreceptor;Double-label;Aged change;Immunohistochemistry;

    Submaxillary gland

    ______________________

    △ Department of Histology and Embryology,TheFourth Military Medical University,Xi′an 710032,China, http://www.100md.com(金花淑* 黄威权 张金山 文永植* 张崇理**)