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编号:10279097
阿片μ受体在猫脊髓背角浅层内的超微定位分布*
http://www.100md.com 《解剖学报》 1998年第1期
     作者:王 丹 龚良维 丁玉强 张淼丽 秦秉志 李继硕

    单位:第四军医大学解剖学教研室,梁钅求琚脑研究中心,西安 710032

    关键词:阿片μ受体;脊髓;免疫组织化学;电镜;猫

    解剖学报980106

     摘要 用免疫电镜技术观察了阿片μ受体(MOR)在猫脊髓背角浅层内的超微定位分

    布。电镜下观察发现MOR样免疫反应产物主要位于小树突和无髓纤维内,偶见有阳性

    的胞体。MOR阳性树突多与阴性轴突终末形成对称性突触,个别为非对称性突触。背

    角浅层内分布有一定数量的MOR阳性无髓纤维,但仅观察到少量阳性轴突终末,且其
, 百拇医药
    中大部分并不与其周围结构形成突触连接。本研究结果为MOR在脊髓水平参与阿片类

    物质镇痛过程中存在突触前和突触后两种机制提供了明确的形态学证据。

    药理学的研究表明,阿片受体至少存在μ、δ、κ 3种亚型[1]。其中阿片μ受体

    (μ-opioid receptor, MOR)与吗啡这一临床上常用的镇痛药物的亲和性最强[24],且

    MOR拮抗剂可逆转吗啡对伤害性刺激反应的抑制效应[1],提示MOR在吗啡镇痛效应中

    起着非常重要的作用。免疫组织化学和原位杂交均显示大鼠脊髓背角浅层内和背根节
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    内存在大量MOR阳性神经元[1,58],而且在切断一侧脊髓背根后,同侧脊髓背角浅层

    MOR样免疫反应产物明显减少[9],说明在背角浅层内MOR不仅位于突触后成分内,而

    且部分初级传入纤维的终末内可能也含有MOR。免疫电镜已观察到大鼠脊髓背角浅层

    的部分轴突终末内分布有MOR样免疫反应产物[10,11]。我们先前对MOR在猫脊髓背角分

    布的研究表明,MOR主要出现于背角浅层的神经毯内,但在光镜水平很难判断和推测

    MOR的超微定位分布[12]。因此本研究拟采用免疫电镜技术对猫脊髓背角浅层中MOR的
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    超微定位分布特征进行了观察,以期为研究MOR参与吗啡脊髓水平的镇痛机制提供形

    态学资料。

    材料和方法

    用成年雄性猫4只,在腹腔注射戊巴比妥钠深麻醉状态下(100mg/kg),经心脏先灌

    注500ml生理盐水冲洗血液,再用含0.5%戊二醛、4%多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L

    磷酸缓冲液(PB,pH7.4)1 500ml灌注固定1h,取腰骶段脊髓(L5~S2),在上述固定液中

    后固定3h(4℃)。振动切片机切片(厚50μm),切片收集于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中。按ABC法进行免疫细胞化学染色,具体步骤如下:1.切片首先进入豚鼠抗大
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    鼠MOR的IgG(0.5mg/L,关于此抗体的制备、提纯和鉴定请参照文献[13])室温孵育过夜;

    2.移入结合有生物素的羊抗豚鼠IgG(Vector,1∶200),室温孵育3h;3.ABC复合物(Vector,1∶200),室温孵育2h。一抗和二抗用含0.05% Triton X-100, 0.2%驴血清和0.03%NaN3的0.01 mol/L PBS(pH7.4)稀释,ABC复合物用含0.05% Triton X-100的0.01mol/L PBS

    (pH7.4)稀释。上述每一步之间均用0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗3次,每次5min。最后切

    片在含0.05%DAB和0.003%H2O2的0.05mol/LTris-HCl(pH7.6)缓冲液呈色15~30min。切
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    片呈色后入含1%锇酸的0.1mol/LPB (pH7.4)内固定1h,梯度酒精脱水,Epon812平板包

    埋。在光镜下取脊髓背角浅层,修整后LKB超薄切片机超薄切片,醋酸铀、枸橼酸铅

    染色,PhilipsCM100透射电镜下观察并摄片。

    对照实验:在省去一抗或用正常的豚鼠血清替代一抗的情况下进行,结果均为阴性。

    结 果

    致密的MOR样免疫反应产物分布于猫背角浅层内。免疫电镜观察表明,在背角Ⅰ、Ⅱ层内的MOR样免疫反应产物主要分布于树突和无髓纤维内,少量的胞体亦呈现免疫

    反应。在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层内大量MOR样免疫反应树突中,小树突占绝大多数。阳性
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    树突多与一个阴性轴突终末形成突触连接(图1,2),但有少量阳性树突与多个阴性轴

    突终末形成突触。这些突触多为对称性突触,偶见为非对称性突触者。突触前成分大

    多含多形性囊泡,少数含圆形囊泡。在背角浅层内,同时发现有一定数量的无髓纤维

    内含有免疫反应产物(图1),其数量约占所有MOR阳性结构总数的1/4左右。但是却仅见

    到少量MOR阳性轴突终末,其中多数并未与周围的胞体或树突形成突触连接(图3),仅

    有个别阳性终末与阴性树突形成对称性突触(图4)。在纵断的轴突内发现一种有趣的现

    象,即在开始出现突触小泡,距离突触活性点还有一定距离的轴突内分布有阳性反应
, 百拇医药
    产物,但远侧端的轴突终末为阴性,那里小泡密集分布并与阴性的树突形成突触连接。

    此外,在背角浅层内发现有少量阳性的胞体,免疫反应产物主要分布于胞膜下,胞浆

    内粗面内质网的核糖体亦呈现MOR免疫反应(图5)。

    讨 论

    本研究结果显示猫脊髓背角浅层内MOR主要分布于树突和无髓纤维内,仅有个别

    胞体和轴突终末内含有MOR免疫反应产物。

    免疫电镜研究表明,在大鼠脊髓背角浅层内分布一定数量的MOR阳性无髓纤维和

    少量轴突终末[10,11]。与此结果相一致,本研究发现猫脊髓背角浅层内部分无髓纤维和
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    轴突终末呈现MOR免疫反应。我们先前研究已证实切断猫脊髓背根可引起术侧脊髓背

    角浅层内MOR样免疫反应产物明显脱落(约20%~30%)[12]。因此,推测背角浅层内的

    MOR阳性无髓纤维和终末至少有一部分为来自于外周的初级传入纤维。大量的生理学

    和药理学的研究已经证实,吗啡在脊髓水平的镇痛机制之一是通过调节初级传入纤维

    内的神经递质(P物质和谷氨酸等)的释放实现的[10,14,15],形态学的研究也发现P物质和

    MOR共存于脊髓背角浅层的轴突终末内[10]。综上述,结合以往的文献和本研究结果可

    以认为吗啡镇痛的突触前机制是通过激活初级传入纤维内MOR来调节与传递伤害性信
, 百拇医药
    息的神经递质的释放实现的。

    由于在本实验中仅观察到少量的轴突终末呈现MOR免疫反应,其数量明显低于阳

    性无髓纤维的数量,且在部分纵断的轴突上发现阳性的轴突纤维的终末内并不含MOR

    免疫反应产物,推测吗啡通过激活初级传入纤维内的MOR从而抑制P物质和谷氨酸等的

    释放可能发生在终末前的轴突内。MOR是G蛋白偶联的受体,它可通过G蛋白系统而影

    响轴突膜上的钙和钾通道的活性。众所周知,神经递质的释放是在轴突终末的钙通道

    开放,轴突终末内钙离子浓度升高时才能发生。因此,我们推测终末前轴突上的MOR

    被激活后,可能通过轴浆内的G蛋白系统而抑制轴突终末的钙通道活性,从而阻断P物
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    质和谷氨酸等神经递质的释放。

    需要提出的是,本研究发现背角浅层内MOR阳性树突和胞体多与非标记的轴突多

    形成对称性突触。这一结果提示背角浅层内与MOR阳性神经元形成的突触前成分可能

    含有抑制性神经递质,如γ-氨基丁酸,甘氨酸等。此问题值得进一步深入研究。

    收稿1996-12 修回 1997-03

    本文图1~5见插图第4页

    图 版 说 明

    图1,2 示猫背角浅层内的MOR阳性树突与阴性轴突之间形成的突触,及阳性无髓纤维
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    (图1,大箭头示)。小箭头示突触活性点。标尺示0.30μm

    图3,4 示猫背角浅层内的MOR阳性轴突。图3显示1个MOR阳性轴突,但它并未与树突

    形成突触连接,图4为1个阳性轴突与阴性树突形成的对称性突触。箭头示突触活

    性点。标尺示0.30μm

    图5 示猫背角浅层内的MOR阳性胞体。阳性反应物多位于胞膜下,胞浆内粗面内质网

    上的核糖体亦出现MOR免疫反应。标尺示0.80μm

    Fig.1, 2 Showing dendritic profiles with MOR-LI make synapticcontacts with unlabeled axon
, 百拇医药
    terminals in the superficial layers of thecat spinal cord. Large arrows in Fig.1 indicate

    unmyelinated axons labeled with MOR-LI.Small arrows point to synaptic sites.

    Bars=0.30μm

    Fig.3,4 Showing MOR-LI in axon terminals in the superficiallayers of the cat spinal crod.

    Fig.3 shows an MOR-immunreactive axon terminal which does notform synaptic contact with
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    dendrites or cell bodies.

    Fig.4 shows an MOR-immunoreactive axon terminal forms a symmetricaxodendritic synapse

    with an unlabeled dendrite. Arrowsindicate synptic site. Bar=0.30μm

    Fig.5 Showing MOR-LI in a neuronal cell body in the superficiallayers of the cat spinal cord.

    The immunoreactive products are mainlylocated under membrane, and in ribosomes of
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    the rough endoplasmic reticulum incytoplasm. Bar=0.80μm

    * 国家自然科学基金资助课题(No.39600045)

    参 考 文 献

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    ULTRASTRUCTURALLOCALIZATION OF μ-OPIOID

    RECEPTOR IN THE SUPERFICIAL LAYERS

    OF THE SPINAL CORD IN THE CAT

    Wang Dan,Gong Liangwei, Ding Yuqiang, Zhang Miaoli, Qin Bingzhi, LiJishuo

    (Department ofAnatomy and K.K. Leung Brain Research Centre, Fourth MilitaryMedical University, Xi′an)
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    The ultrastructural localization of μ-opioidreceptor (MOR) in the superficial layers of

    the cat spinal cord was investigated by electron microscopy.Dense MOR-like immunoreac-

    tivity (MOR-LI) was distributed in the superficial layers(laminae Ⅰ and Ⅱ) of the dorsal

    horn. Ultrastructural examination showed that MOR-LI was mainlylocalized in dendritic

    profiles, especially in the small dendritic profiles, whichmainly formed asymmetric synaptic
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    contacts with negative axon terminals. An amount of axonterminals were labeled with MOR-

    LI, but most did not make synaptic contact with dendrites or cellbodies. In addition, MOR-LI

    was occasionally found in neuronal cell bodies; immunoreativeproducts were mainly located

    under membrane. The present results provided evidence forinvolvement of MOR in opioids

    analgesia by both presynaptic and postsynaptic mechanisms in thespinal cord of the cat.
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    KEY WORDS μ-opioid receptor; Spinal cord;Immunohistochemistry; Electron

    microscopy; Cat

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    △Department of Anatomy and K.K.Leung BrainResearch Centre, Fourth Military Medical

    University, Xi′an 710032,China, 百拇医药