NT-3mRNA分子杂交在胚胎脊髓修复成鼠受损脊髓过程中的变化
作者：李兵仓 王正国 朱佩芳 李应玉 胡 建*廖维宏
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042；* 第三军医大学附属西南医院骨科
关键词：
解剖学报980103
摘 要 为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠14d胚胎脊髓(ESC)植
入急性损伤成鼠脊髓后1、3、5、7、10、15和30d，用原位杂交和斑点杂交技术对ESC
和宿主脊髓(HSC)内NT-3 mRNA的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常
脊髓内，NT-3mRNA以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂
, 百拇医药
交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ESC植入后，除移植
物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果
表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交
反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组
内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后7d，后者为术后10~15d.我们认为，移植的ESC除为自身和HSC提供神经营养外，也诱发了HSC在发生过程中曾经拥有的
合成机制，以增强NF表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提
供合适的营养环境。
, 百拇医药
关键词 脊髓损伤 脊髓移植 神经营养素-3 分子杂交
胚胎脊髓(embryonic spinal cord,ESC)移植不但可以修复成体损伤脊髓(injured spinal
cord,ISC)的组织缺损[1,2]，对恢复ISC功能也有促进作用[3]，并能挽救(rescue)损伤的宿
主神经元[4]。根据神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)不仅对感觉神经元、胆碱能神经
元和多巴胺能神经元发育分化具有维持和促进作用[5,6]，还能挽救脊髓损伤神经元而
免遭变性死亡[7]和促使神经肌肉突触在结构和功能上尽快成熟[8]，我们推测ESC
, http://www.100md.com
移植后的生长、分化以及修复ISC组织缺损和救援损伤神经元等作用可能和NT-3有关。
为此，本研究将ESC植入成鼠ISC后，对NT-3mRNA的变化进行原位和斑点分子杂交观
察，以从神经营养因子(neurotrophic factor,NF)角度探讨移植修复机理。
材料和方法
1.动物处理与取材
按我们以前[2]介绍的方法进行脊髓损伤和脊髓移植。主要方法和步骤：以体重
200g左右的Wistar大鼠脊髓为宿主，以同种妊娠14d(E14)的胎鼠脊髓为受体。移植时先
, 百拇医药
半切宿主脊髓腰膨大(L1)左侧并吸出局部脊髓组织，然后由孕鼠子宫内取出E14胎鼠，于显微镜下仔细剥离颈胸段脊髓，用玻璃针头吸取一段长约3mm的纯净胎鼠脊髓，注
入脊髓损伤处。确认植入后，用8-0的无创缝合线间断缝合硬脊膜。术后1、3、5、7、10、15、30d时，随机取6只宿主鼠做原位分子杂交，另取5只用于斑点杂交。做原位分
子杂交者麻醉后开胸暴露心脏，经左心室\|主动脉系统依次灌注无RNase的PBS 150ml
和4%多聚甲醛200ml。灌注固定后2h取出移植部位脊髓，投入相同固定液继续固定2h，然后转入20%蔗糖(无RNase)中过夜；欲做斑点杂交的动物麻醉后直接取出移植部位脊
髓，迅速投入液氮中保存备用。
除宿主鼠外，在以上各时相点还另用10只单纯脊髓损伤的大鼠做损伤对照。正常
, 百拇医药
对照动物总共11只，其中原位杂交用6只，斑点杂交用5只。本实验共用受体鼠77只，单纯脊髓损伤鼠70只，包括11只正常对照大鼠在内，各种大鼠共计158只。
2.原位分子杂交
人NT-3 cDNA探针(穆援越博士赠送，北京军事医学科学院)片断长0.44kb，连接于
PUC18质粒多克隆位点EcoRⅠ和HindⅢ之间。质粒的扩增、纯化、酶切和基因片段的
回收主要参照文献[9]进行。基因探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒
(德国BoehringerMannheim Biochemica)说明书操作。原位分子杂交的主要步骤[10]为：
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取出蔗糖中过夜标本置冰冻切片机切50μm切片，收集切片于前述固定液中固定10min，依次经浸洗、蛋白酶K(2mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步
处理后，入杂交液(探针浓度500μg/L)于42℃恒温水浴中杂交25h，其后分别经浓度递
减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶1 000)室温中作用
12h，此步完成后分别经0.05mol/L pH7.2 PBS、缓冲液1、缓冲液3漂洗，入新鲜配置的
显色液于室温下黑暗中显色12h，转切片入缓冲液4，并在此液中将切片平铺于涂有粘
附剂的载玻片上，风干切片，1%甲基绿复染15min，然后经系列乙醇脱水、二甲苯透
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明，最后用封固剂DPX封片。
原位分子杂交切片对照采用：(1)杂交前用RNA酶100mg/L于37℃预处理切片30min；
(2)杂交液内去除标记探针；(3)杂交液内加入未标记探针。
3.斑点杂交
将用异硫氰酸瓜-酚-氯仿抽提法[11]提取的脊髓RNA水溶液(浓度约为1.4g/L)与
等体积甲醛变性溶液混匀，然后于60℃水浴中变性30min，取出之置室温中冷却，再
将其点到经过预处理的硝酸纤维素膜上，另取标准品(1∶10倍比稀释)同时点膜以做
, http://www.100md.com
对照。待膜自然晾干后，将其置于两层滤纸中间转入80℃真空烘烤2h。转移杂交膜
于塑料袋中，按0.2ml/cm2杂交膜面积的比例向袋中加入预杂交液，封口后于42℃预
杂交1h。剪开塑料袋，吸除预杂交液，再按1ml/cm2膜面积加入新配杂交液(标记探针
400μg/L)，封膜后42℃杂交24h。取出杂交膜，用2×SSC-0.1%SDS室温下洗涤数次，0.1×SSC-0.1%SDS55℃洗膜2×30min，缓冲液1和缓冲液2各洗2×5min。将杂交膜转
入新配显色液，室温避光过夜显色。
4.结果观察和定量
, 百拇医药 首先将原位杂交切片做光镜定性观察。然后随即选取3只动物的切片标本，在10
×20倍下每标本随机摄取5个视野，如此每组得到105幅光镜组织学图像(正常对照组
15幅)。在计算机图像分析系统下计数每张图像上的阳性反应细胞数，最后推算出每
100μm2中的面数密度；测量细胞反应强度时，用相同图像分析系统随机在每张图像
上测量10个细胞的反应灰度值，以其平均值表示该动物标本中的反应强度。
斑点杂交结果用真彩色扫描仪扫描入计算机系统，在Photostyler 2.0软件支持下测
量标准品各斑点的反应灰度值，然后根据浓度变化梯度与反应强度计算出浓度变化曲
, 百拇医药
线。NT-3在各时相点的反应灰度值也用相同办法测出，再依据它们的反应强度与浓度
变化曲线求出每微克总RNA中mRNA的拷贝数。
5.统计学分析
所有数据均进行t检验分析。
结 果
1.移植物存活情况
将ESC植入ISC后，ESC不仅存活，也呈现了逐渐生长发育过程。术后早期，移植
物的体积小，其内神经元的数目多，但体积小，染色深，形态上类似神经母细胞和神
经上皮细胞(图1)。后期，移植物的体积虽然增大，神经元的形态也显正常，但神经元
, 百拇医药
的数目却减少(图2)。
2.原位分子杂交
2.1 定性观察：在正常动物的脊髓内，深蓝色细颗粒状杂交产物主要存在于前角运
动神经元胞浆(图3)，少数胶质细胞中也可观察到反应颗粒，但由于反应产物的遮蔽，光镜下很难对这些阳性胶质细胞做进一步分类。脊髓损伤后1d，每张切片平均约8个左
右前角运动神经元呈现颗粒稀疏的阳性反应，但阳性杂交的胶质细胞比较少见。此后，除前角运动神经元外，部分中、小神经元也慢慢呈现阳性反应，同时阳性胶质细胞的
数目增多，胞浆内杂交颗粒也逐渐密集，至术后7d各种阳性细胞的数目最多，反应颗
粒也最为密集(图4)。7d后，上述反应逐渐减弱，到术后15d时，单纯ISC内的反应情况
, 百拇医药
基本减弱到正常脊髓的水平。将ESC植入ISC后1d，很多前角运动神经元及不少中、小
型神经元和胶质细胞就呈阳性反应。术后7d这种反应势头有增无减，到术后15d时，很
多上述细胞仍然呈现较强的反应(图5)。
E14 ESC在移植前呈很强的NT-3 mRNA杂交反应(图6)。将其植入到损伤脊髓后
1~7d，由于娇嫩的ESC尚未和宿主脊髓(host spinal cord,HSC)形成完善的组织连接，因
此它们大多被杂交过程中必不可少的蛋白酶K处理消化殆尽。但从残存的组织碎片上，仍然可见移植物呈强阳性反应。术后15d时，移植物已和HSC形成了疏松的组织连接，由此可见，幼稚的胚胎神经元和胶质细胞内有较强的杂交信号(图7)。
, 百拇医药
2.2 定量观察：NT-3 mRNA原位杂交阳性神经元数目和反应灰度值分别列于表1和
表2。可以归纳出，损伤组内阳性神经元的数目和反应灰度值在术后有一个逐渐增高和
回落的过程，峰值在术后7d时出现。除术后1d和30d外，两种数值与正常组的相比均有
显著差异。
移植组的阳性反应神经元数目和灰度值在术后同样有一个逐步增高的过程，但增
加幅度大，持续时间长，数目和灰度的最大值均表现在术后15d。由于术后7d以后损
伤组的相应数值逐步下降，移植组的对应值则在术后10d至30d的各时相点上与损伤组
的相比有显著(P<0.05)或非常显著(P<0.01)的差异。
, 百拇医药
3.斑点杂交
NT-3 mRNA斑点杂交反应图谱呈现在图8。表3是根据图谱所计算的每微克总RNA
中该mRNA的拷贝数，其在各组中的变化趋势和上述原位杂交的大致相同。
表1 各组脊髓NT-3 mRNA原位杂交阳性神经元数量变化(个/100μm2)
Table 1 Number changes of positively reacted neuron of NT-3 mRNAin situ hybridization
of each animal group(number/100μm2)
组别
, 百拇医药
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
1
3
5
7
10
15
30
正常组
, 百拇医药
8.54
-
-
-
-
-
-
-
normal group
±0.74
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
损伤组
8.54
8.57
13.85+
21.19++
30.10++
23.67++
16.33++
8.90
, 百拇医药
injured group
±0.74
±0.58
±1.31
±4.13
±3.48
±3.02
±1.87
±1.23
移植组
8.54
9.84
16.94+
, http://www.100md.com
28.81++
31.89++
40.82++
47.89++
16.35+
transp.group
±0.74
±1.14
±1.97
±2.35±
2.41±
, http://www.100md.com
2.58±
3.13±
1.70
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
表2 各组脊髓神经元NT-3 mRNA原位杂交反应灰度变化
Table 2 Changes ofreactive intensity of NT-3 mRNA in situ hybridiz
, 百拇医药
ation of neurons in spinal cord of each aniaml group
组别
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
1
3
5
7
, http://www.100md.com
10
15
30
正常组
63.71
-
-
-
-
-
-
-
normal group
, 百拇医药 ±3.92
-
-
-
-
-
-
-
损伤组
63.71
72.86
96.35+
110.14++
, 百拇医药
149.36++
123.07+
103.45+
63.50
injured group
±3.92
±5.81
±4.44
±12.45
±4.1
±7.21
±11.72
, 百拇医药
±6.32
移植组
63.71
96.89+*
107.91++*
121.98++
147.72++
152.73++*
162.41++**
80.61+*
, http://www.100md.com
transp.group
±3.92
±3.24
±3.74
±4.55
±6.07
±5.97
±6.77
±4.31
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
, http://www.100md.com
表3 各组脊髓NT-3 mRNA斑点杂交反应值(拷贝数/μg总RNA)
Table 3 Reaction values of NT-3 mRNA dot hybridization in spinalcord of each
aniaml group(copy number/μg total RNA)
组别
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
, 百拇医药
1
3
5
7
10
15
30
正常组
0.05
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
-
-
normal group
±0.01
-
-
-
-
-
-
-
损伤组
0.05
, http://www.100md.com 0.07
0.10+
0.18++
0.23++
0.18++
0.11++
0.03
injured group
±0.01
±0.01
±0.01
, 百拇医药
±0.06
±0.06
±0.06
±0.05
±0.01
移植组
0.05
0.09+
0.21++*
0.21++
0.25++
0.52++**
, http://www.100md.com
0.53++**
0.07
transp.group
±0.01
±0.01
±0.09
±0.02
±0.02
±0.02
±0.02
±0.01
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
, 百拇医药
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
讨 论
脊髓损伤的移植修复历来是临床和基础医学工作者极为重视的课题之一。但作为
宿主，人们公认脊髓是最难植入的部位。因此，移植物的存活与否就成了这一课题研
究中的首要问题。从本研究的结果来看，植入ISC的ESC不仅能够存活，而且可继续生
长发育。我们认为这可能首先和本实验选取的移植胎龄有关。E14ESC的细胞成分主要
以神经上皮细胞为主[12]，这为其移植后的存活和生长发育奠定了细胞学基础。其次
, http://www.100md.com
和移植技术有关。本研究利用微外科技术进行移植，不仅保证彻底剔除了ESC表面的
脊膜，从而防止随ESC一同植入的结缔组织限制移植物的存活和生长发育，也使移植
物和宿主组织密切接触，以及时从宿主获得存活和生长所必需的营养。此外，在显微
镜下仔细缝合宿主脊髓的硬脊膜可阻断外源结缔组织长入对移植物存活和生长发育的
威胁。
移植成功之后，移植修复机制必然成为倍受重视的课题。作者从前述NT-3的生物
效应出发，用原位杂交技术观察了它在ESC、移植物和宿主脊髓内的变化。结果表明，在上述各结构内，细胞成分特异性地呈现了强度不同的阳性反应。而在本研究所用的
, 百拇医药
3种对照切片内，所有细胞成分均呈阴性反应。说明本研究的杂交方法可靠，所得结果
正确。我们认为这可能和所用标本新鲜，所用探针较短、同源性较高、浓度适宜，以
及杂交过程中RNase去除彻底和所用试剂质量较高等因素有关。此外，研究结果也进一
步显示，ESC除移植前呈现很强的杂交反应外，移植后直到15d仍然对NT-3 mRNA呈强
杂交反应。这一方面说明ESC自身在移植后的存活和发育分化过程中需要NT-3的维持
和促进；另一方面也表明ESC向ISC施加神经营养作用。正常情况下再生能力有限的脊
髓神经纤维向着移植物迅速再生，或许正是ESC为其提供了神经营养的结果；ESC挽救
, 百拇医药
损伤神经元的机理可能也在于此。
ISC在本实验中也出现了比正常脊髓强的杂交反应。这种杂交结果的含义之一是，脊髓损伤后表现出的神经再生可能是脊髓本身增强NF表达所致，属于对损伤刺激的一
种自我修复反应；另一含义是，ESC移植后的存活以及随之而来的发育分化可能部分
归功于HSC的神经营养作用。对于脊髓损伤后NT-3 mRNA的变化未见其他报道，但
从Rocamora等[13]的报道来看，化学性损伤以后，脑组织中NT-3 mRNA表达也有类
似的增强现象。尽管损伤可以增强NF的表达，然而单纯损伤所激发的增强程度尚未
, 百拇医药 达到足以修复损伤的水平似乎是不容忽视的客观事实。既往中枢神经再生失败的很多
实例对此已做了很好说明。另外，我们的定性、定量观察都显示ESC植入ISC后，HSC NT-3 mRNA的表达得到了进一步增强。这提示ISC须借助外界条件才能进一步
提高自我修复能力。
究竟ESC是如何增强HSC表达NT-3 mRNA的，本实验结果无法直接回答这一问题。
我们只能根据实验观察做如下分析：中枢神经组织表达NF的能力和中枢神经再生能力
一样随着动物的成熟而逐渐丧失，损伤刺激可能唤醒了成熟组织在胚胎发生时期曾经
有过的现象和机制，于是便以合成NF为能源，重新生长为措施，主动对损伤做出修复
, 百拇医药
反应。从实验结果中可以看到，正常大鼠脊髓NT-3 mRNA含量的确非常低。当脊髓损
伤后其含量明显升高，同时很多胶质细胞也渐呈阳性反应；ESC表达NF的能力移植后
得到了保留，从而在自身生长发育的同时，不断诱使宿主损伤神经纤维向着移植物再
生。宿主神经元为了满足这种生长的需要，不得不动用“备用”的表达能力，甚至动
员与其共存的胶质细胞来为神经再生提供营养。目前实验显示，ESC移植的确大大提
高了HSC表达NT-3mRNA的能力，特别是胶质细胞以更多的数量参与了原位分子杂交
反应。
关于NT-3mRNA表达持续时间问题，我们的分析是，脊髓损伤后由于神经再生
, 百拇医药
的需要而增强NT-3的表达，因此术后7d内本实验的定性、定量都显示了明显增强的
杂交反应。但单纯脊髓损伤后多数神经纤维再生并不能持续长久，所以维持神经生
长和救援神经损伤的NF就随之减少，这在我们杂交结果中的反应就是，损伤7d后杂
交反应强度逐渐减弱。ESC植入以后，在移植物的诱导和促进下，HSC神经纤维呈现
向ESC再生的强劲势头，特别是有了再生靶细胞后，损伤神经纤维再生持续时间更为
长久，这就需要更多更久的神经营养，所以在移植后15d时仍能观察到很强的分子杂
交反应。这种分析与神经发生过程中NF的表达和合成需要靶细胞，以及大量神经元
, 百拇医药
由于得不到靶组织的神经营养而消失的现象[6,14]正好相符。
收稿1996-06修回1997-05
本文图1～8见插图第1页
图 版 说 明
图1移植后7d大鼠脊髓。G.移植物H.宿主脊髓 HE染色×100
图2 移植后30d大鼠脊髓。G.移植物H.宿主脊髓 HE染色×40
图3 正常大鼠脊髓NT-3 mRNA原位杂交。↑.阳性反应前角运动神经元×200
图4 损伤后7d大鼠脊髓损伤侧NT-3 mRNA原位杂交。↑.阳性反应前角运动神经元×100
, http://www.100md.com
图5 移植后15d大鼠脊髓移植侧NT-3 mRNA原位杂交。↑.宿主脊髓阳性反应前角运动
神经元×100
图6 妊娠14d大鼠胚胎脊髓NT-3 mRNA原位杂交呈强阳性，为防止蛋白酶K的消化作用
而切的过厚切片(200μm)，使得组织结构分辩不清×100
图7 移植后15d大鼠脊髓NT-3 mRNA原位杂交。移植物(G)和宿主脊髓(H)神经元均呈阳
性杂交反应(↑)×40
图8 各组大鼠脊髓NT-3 mRNA斑点杂交图
Explanationof figures
, http://www.100md.com
Fig.1 Rat spinal cord on7th day after transplantation.G and H mean graft and host tissue
respectively.HE staining ×100
Fig.2 Rat spinal cord on 30th day after transplantation.G and Hindicate graft and host
tissue respectively.HE staining×40
Fig.3 Spinal cord of normal rat.↑:indicates positively reactedmotor neuron in anterior
, 百拇医药 horn of the spinal cord.NT-3 mRNA in situhybridizaton. ×200
Fig.4 Rat spinal cord on 7th day after operation.↑:indicatespositively reacted motor neuron
in anterior horn of the spinal cord.NT-3mRNA in situ hybridization,injured side.×100
Fig.5 Rat spinal cord on 15th day after transplantation.↑:indicatespositively reacted motor
neuron in anterior horn of the host spinalcord.NT-3 mRNA in situ hybridization.
, 百拇医药
transplanted side. ×100
Fig.6 E14 embryonic spinal cord showed very intensive reaction ofNT-3 mRNA in situ
hybridization,but in order to do againstdigestion of proteinase K,200μm sections
have to be made so as to structure of thetissue can not be distinctively observed.×100
Fig.7 Rat spinal cord on 15th day after transplantation.Neurons(↑) in thegraft and host
, http://www.100md.com
tissue showed positive reaction of NT-3mRNA in situ hybridization.×40
Fig.8 The picture of NT-3 mRNA dot hybridization in eachexperimental group.
参 考 文 献
[1]Reier PJ,Anderson,F Thompson,et al.Neurol tissue transplantation and CNS
trauma:anatomical and functional repair ofthe injured spinal cord.J Neurotrauma,1992,9(Suppl 1):223
, 百拇医药
[2]李仓兵，刘枚，李应玉等.大鼠胚胎脊髓对成鼠急性脊髓损伤的组织修复作
用.中华创伤杂志，1993，9(4)：199
[3]Yasulshi I,Kawaguchi S,MurataM.Restoration of function by replacement of spinal
cord segments in therat.Nature,1994,367(6459):167
[4]Himes B T,Goldberger M E,TesslerA.Grafts of fetal central nervous system tissue
rescue axotomized clarke′snucleus neurons in adult and neonatal operates.J Comp
, 百拇医药
Neurol,1994,339(1):117
[5]Ventimiglia R, Mather PE,JonesBE,et al.The neurotrophins BDNF,NT-3 and NT-4/5
promote survival and morphological andbiochemical differentiation of striatal neurons
in vitro.Eur J Neurosci,1995,7(2):213
[6]Ockel M,Lewin GR,Barde YA.In vivoeffects of neurotrophin-3 during sensory
neurogenesis.Developmen,1996,122(1):301
, 百拇医药
[7]Vejsada R,Sagot Y,KatoC.Quantitative comparison of the transient rescue effects of
neurotrophic factors on axotomizedmotoneurons in vivo.Eur J Neurosci,1995,7(1):108
[8]Wang T,Xie K,Lu B.Neurotrophinspromote maturation of developing neuromuscular
synapses.J Neurosci,1995,15(7 pt 1):4796
[9]金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992：1-74,304-395
, 百拇医药
[10]蔡文琴，王伯云著.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学
技术出版社，1994：406-434
[11]Chomczynski P,SacchiN.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenolo-chloroformextraction.Analy Biochem,1987,162;(1)156
[12]李兵仓，伍亚民，刘枚等.急性脊髓损伤后胎鼠脊髓的脊髓内移植及其影响
因素.第三军医大学学报，1992，14(4)：347
[13]Rocamora N,Massieu L,Boddeke HW,et al.Differential regulation of the expression
, 百拇医药
of nerve growth factor,brain-derivedneurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in
adult rat brain after intrahippocampalinjection of quinolinic acid.Brain Res Mol Brain
Res,1994,26(1-2):89
[14]Barde YA.Neurotrophins:A familyof proteins supporting the survival of neurons.
Prog Clin Biol Res,1994,390(1):45
CHANGESOF NT-3 mRNA BY MOLECULAR HYBRIDIZATION
, 百拇医药
DURING EMBRYONIC SPINAL CORD REPAIRING SPINAL
CORD INJURY OF ADULT RATS
LiBingcang△,Wang Zhengguo,Zhu Peifang,Li Yingyu,HuJian,Liao Weihong
(ResearchInstitute of Surgery,Daping Hospital,Third Military MedicalUniversity,Chongqing)
In order to study the mechanism oftransplantation and repairing from the view of
neurotrophines,on days 1,3,5,7,10,15,and 30 after E14 embryonicspinal cord being
, http://www.100md.com
transplanted into the acutely injured spinal cord of adultrats,changes of NT-3 mRNA
within donor tissue and host tissue were demonstratedqualitatively and quantitatively by
in situ hybridization and dot hybridization.Meantime,normalspinal cord and simply injured
spinal cord were used as controls.It was shown qualitatively thatNT-3 mRNA was mainly
expressed within cytoplasm of motor neurons and a few gliocyte innormal spinal cord;After
, http://www.100md.com
spinal cord injury,hybridizing products expended to the mediumand small-sized neurons,also
more gliocytes took part in hybridization response;Followingtransplantation,positively
hybridizing neurons and gliocytes became more in number in thehost tissue,and embryonic
spinal cord kept an expressing level similar to that before beingtransplanted.It was also
revealed quantitatively that reacting intensity of the cells inthe injured group was strikingly
, 百拇医药
higher than that in the normal group.However hybridizationintensity in the transplanted group
was even higher at many intervals than that in the injuredgroup;Besides these,the lasting
period for hybridization reaction of the transplanted group wasalso different from that of the
injured group.The most intensive reacting phase in the formerpresented at dya 10 and 15,and
, 百拇医药
in the latter at day 7 after operation .We suggest thattransplanted embryonic spinal cord can,besides providing neurotrophic factors for itself and host spinalcord,evoke synthetic mechan-
isms of host spinal cord once holding during its embryonicdevelopment so as to enhance expr-
ession of the neurotrophic factors.In this way,the host spinalcord might provide neurotrophic
factors for its regeneration and provide an trophic environmentfor the grafts to develop and
differentiate.
KEY WORDS Spinal cord injury;Spinalcord transplantation;NT-3;Molecular hybridization
_____________________
△Research Institute of Surgery,DapingHospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042；* 第三军医大学附属西南医院骨科
关键词：
解剖学报980103
摘 要 为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠14d胚胎脊髓(ESC)植
入急性损伤成鼠脊髓后1、3、5、7、10、15和30d，用原位杂交和斑点杂交技术对ESC
和宿主脊髓(HSC)内NT-3 mRNA的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常
脊髓内，NT-3mRNA以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂
, 百拇医药
交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ESC植入后，除移植
物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果
表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交
反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组
内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后7d，后者为术后10~15d.我们认为，移植的ESC除为自身和HSC提供神经营养外，也诱发了HSC在发生过程中曾经拥有的
合成机制，以增强NF表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提
供合适的营养环境。
, 百拇医药
关键词 脊髓损伤 脊髓移植 神经营养素-3 分子杂交
胚胎脊髓(embryonic spinal cord,ESC)移植不但可以修复成体损伤脊髓(injured spinal
cord,ISC)的组织缺损[1,2]，对恢复ISC功能也有促进作用[3]，并能挽救(rescue)损伤的宿
主神经元[4]。根据神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)不仅对感觉神经元、胆碱能神经
元和多巴胺能神经元发育分化具有维持和促进作用[5,6]，还能挽救脊髓损伤神经元而
免遭变性死亡[7]和促使神经肌肉突触在结构和功能上尽快成熟[8]，我们推测ESC
, http://www.100md.com
移植后的生长、分化以及修复ISC组织缺损和救援损伤神经元等作用可能和NT-3有关。
为此，本研究将ESC植入成鼠ISC后，对NT-3mRNA的变化进行原位和斑点分子杂交观
察，以从神经营养因子(neurotrophic factor,NF)角度探讨移植修复机理。
材料和方法
1.动物处理与取材
按我们以前[2]介绍的方法进行脊髓损伤和脊髓移植。主要方法和步骤：以体重
200g左右的Wistar大鼠脊髓为宿主，以同种妊娠14d(E14)的胎鼠脊髓为受体。移植时先
, 百拇医药
半切宿主脊髓腰膨大(L1)左侧并吸出局部脊髓组织，然后由孕鼠子宫内取出E14胎鼠，于显微镜下仔细剥离颈胸段脊髓，用玻璃针头吸取一段长约3mm的纯净胎鼠脊髓，注
入脊髓损伤处。确认植入后，用8-0的无创缝合线间断缝合硬脊膜。术后1、3、5、7、10、15、30d时，随机取6只宿主鼠做原位分子杂交，另取5只用于斑点杂交。做原位分
子杂交者麻醉后开胸暴露心脏，经左心室\|主动脉系统依次灌注无RNase的PBS 150ml
和4%多聚甲醛200ml。灌注固定后2h取出移植部位脊髓，投入相同固定液继续固定2h，然后转入20%蔗糖(无RNase)中过夜；欲做斑点杂交的动物麻醉后直接取出移植部位脊
髓，迅速投入液氮中保存备用。
除宿主鼠外，在以上各时相点还另用10只单纯脊髓损伤的大鼠做损伤对照。正常
, 百拇医药
对照动物总共11只，其中原位杂交用6只，斑点杂交用5只。本实验共用受体鼠77只，单纯脊髓损伤鼠70只，包括11只正常对照大鼠在内，各种大鼠共计158只。
2.原位分子杂交
人NT-3 cDNA探针(穆援越博士赠送，北京军事医学科学院)片断长0.44kb，连接于
PUC18质粒多克隆位点EcoRⅠ和HindⅢ之间。质粒的扩增、纯化、酶切和基因片段的
回收主要参照文献[9]进行。基因探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒
(德国BoehringerMannheim Biochemica)说明书操作。原位分子杂交的主要步骤[10]为：
, http://www.100md.com
取出蔗糖中过夜标本置冰冻切片机切50μm切片，收集切片于前述固定液中固定10min，依次经浸洗、蛋白酶K(2mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步
处理后，入杂交液(探针浓度500μg/L)于42℃恒温水浴中杂交25h，其后分别经浓度递
减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶1 000)室温中作用
12h，此步完成后分别经0.05mol/L pH7.2 PBS、缓冲液1、缓冲液3漂洗，入新鲜配置的
显色液于室温下黑暗中显色12h，转切片入缓冲液4，并在此液中将切片平铺于涂有粘
附剂的载玻片上，风干切片，1%甲基绿复染15min，然后经系列乙醇脱水、二甲苯透
, http://www.100md.com
明，最后用封固剂DPX封片。
原位分子杂交切片对照采用：(1)杂交前用RNA酶100mg/L于37℃预处理切片30min；
(2)杂交液内去除标记探针；(3)杂交液内加入未标记探针。
3.斑点杂交
将用异硫氰酸瓜-酚-氯仿抽提法[11]提取的脊髓RNA水溶液(浓度约为1.4g/L)与
等体积甲醛变性溶液混匀，然后于60℃水浴中变性30min，取出之置室温中冷却，再
将其点到经过预处理的硝酸纤维素膜上，另取标准品(1∶10倍比稀释)同时点膜以做
, http://www.100md.com
对照。待膜自然晾干后，将其置于两层滤纸中间转入80℃真空烘烤2h。转移杂交膜
于塑料袋中，按0.2ml/cm2杂交膜面积的比例向袋中加入预杂交液，封口后于42℃预
杂交1h。剪开塑料袋，吸除预杂交液，再按1ml/cm2膜面积加入新配杂交液(标记探针
400μg/L)，封膜后42℃杂交24h。取出杂交膜，用2×SSC-0.1%SDS室温下洗涤数次，0.1×SSC-0.1%SDS55℃洗膜2×30min，缓冲液1和缓冲液2各洗2×5min。将杂交膜转
入新配显色液，室温避光过夜显色。
4.结果观察和定量
, 百拇医药 首先将原位杂交切片做光镜定性观察。然后随即选取3只动物的切片标本，在10
×20倍下每标本随机摄取5个视野，如此每组得到105幅光镜组织学图像(正常对照组
15幅)。在计算机图像分析系统下计数每张图像上的阳性反应细胞数，最后推算出每
100μm2中的面数密度；测量细胞反应强度时，用相同图像分析系统随机在每张图像
上测量10个细胞的反应灰度值，以其平均值表示该动物标本中的反应强度。
斑点杂交结果用真彩色扫描仪扫描入计算机系统，在Photostyler 2.0软件支持下测
量标准品各斑点的反应灰度值，然后根据浓度变化梯度与反应强度计算出浓度变化曲
, 百拇医药
线。NT-3在各时相点的反应灰度值也用相同办法测出，再依据它们的反应强度与浓度
变化曲线求出每微克总RNA中mRNA的拷贝数。
5.统计学分析
所有数据均进行t检验分析。
结 果
1.移植物存活情况
将ESC植入ISC后，ESC不仅存活，也呈现了逐渐生长发育过程。术后早期，移植
物的体积小，其内神经元的数目多，但体积小，染色深，形态上类似神经母细胞和神
经上皮细胞(图1)。后期，移植物的体积虽然增大，神经元的形态也显正常，但神经元
, 百拇医药
的数目却减少(图2)。
2.原位分子杂交
2.1 定性观察：在正常动物的脊髓内，深蓝色细颗粒状杂交产物主要存在于前角运
动神经元胞浆(图3)，少数胶质细胞中也可观察到反应颗粒，但由于反应产物的遮蔽，光镜下很难对这些阳性胶质细胞做进一步分类。脊髓损伤后1d，每张切片平均约8个左
右前角运动神经元呈现颗粒稀疏的阳性反应，但阳性杂交的胶质细胞比较少见。此后，除前角运动神经元外，部分中、小神经元也慢慢呈现阳性反应，同时阳性胶质细胞的
数目增多，胞浆内杂交颗粒也逐渐密集，至术后7d各种阳性细胞的数目最多，反应颗
粒也最为密集(图4)。7d后，上述反应逐渐减弱，到术后15d时，单纯ISC内的反应情况
, 百拇医药
基本减弱到正常脊髓的水平。将ESC植入ISC后1d，很多前角运动神经元及不少中、小
型神经元和胶质细胞就呈阳性反应。术后7d这种反应势头有增无减，到术后15d时，很
多上述细胞仍然呈现较强的反应(图5)。
E14 ESC在移植前呈很强的NT-3 mRNA杂交反应(图6)。将其植入到损伤脊髓后
1~7d，由于娇嫩的ESC尚未和宿主脊髓(host spinal cord,HSC)形成完善的组织连接，因
此它们大多被杂交过程中必不可少的蛋白酶K处理消化殆尽。但从残存的组织碎片上，仍然可见移植物呈强阳性反应。术后15d时，移植物已和HSC形成了疏松的组织连接，由此可见，幼稚的胚胎神经元和胶质细胞内有较强的杂交信号(图7)。
, 百拇医药
2.2 定量观察：NT-3 mRNA原位杂交阳性神经元数目和反应灰度值分别列于表1和
表2。可以归纳出，损伤组内阳性神经元的数目和反应灰度值在术后有一个逐渐增高和
回落的过程，峰值在术后7d时出现。除术后1d和30d外，两种数值与正常组的相比均有
显著差异。
移植组的阳性反应神经元数目和灰度值在术后同样有一个逐步增高的过程，但增
加幅度大，持续时间长，数目和灰度的最大值均表现在术后15d。由于术后7d以后损
伤组的相应数值逐步下降，移植组的对应值则在术后10d至30d的各时相点上与损伤组
的相比有显著(P<0.05)或非常显著(P<0.01)的差异。
, 百拇医药
3.斑点杂交
NT-3 mRNA斑点杂交反应图谱呈现在图8。表3是根据图谱所计算的每微克总RNA
中该mRNA的拷贝数，其在各组中的变化趋势和上述原位杂交的大致相同。
表1 各组脊髓NT-3 mRNA原位杂交阳性神经元数量变化(个/100μm2)
Table 1 Number changes of positively reacted neuron of NT-3 mRNAin situ hybridization
of each animal group(number/100μm2)
组别
, 百拇医药
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
1
3
5
7
10
15
30
正常组
, 百拇医药
8.54
-
-
-
-
-
-
-
normal group
±0.74
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
损伤组
8.54
8.57
13.85+
21.19++
30.10++
23.67++
16.33++
8.90
, 百拇医药
injured group
±0.74
±0.58
±1.31
±4.13
±3.48
±3.02
±1.87
±1.23
移植组
8.54
9.84
16.94+
, http://www.100md.com
28.81++
31.89++
40.82++
47.89++
16.35+
transp.group
±0.74
±1.14
±1.97
±2.35±
2.41±
, http://www.100md.com
2.58±
3.13±
1.70
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
表2 各组脊髓神经元NT-3 mRNA原位杂交反应灰度变化
Table 2 Changes ofreactive intensity of NT-3 mRNA in situ hybridiz
, 百拇医药
ation of neurons in spinal cord of each aniaml group
组别
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
1
3
5
7
, http://www.100md.com
10
15
30
正常组
63.71
-
-
-
-
-
-
-
normal group
, 百拇医药 ±3.92
-
-
-
-
-
-
-
损伤组
63.71
72.86
96.35+
110.14++
, 百拇医药
149.36++
123.07+
103.45+
63.50
injured group
±3.92
±5.81
±4.44
±12.45
±4.1
±7.21
±11.72
, 百拇医药
±6.32
移植组
63.71
96.89+*
107.91++*
121.98++
147.72++
152.73++*
162.41++**
80.61+*
, http://www.100md.com
transp.group
±3.92
±3.24
±3.74
±4.55
±6.07
±5.97
±6.77
±4.31
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
, http://www.100md.com
表3 各组脊髓NT-3 mRNA斑点杂交反应值(拷贝数/μg总RNA)
Table 3 Reaction values of NT-3 mRNA dot hybridization in spinalcord of each
aniaml group(copy number/μg total RNA)
组别
group
基线值
value of basin line
术 后 天 数
day after operation
, 百拇医药
1
3
5
7
10
15
30
正常组
0.05
-
-
-
-
-
, http://www.100md.com
-
-
normal group
±0.01
-
-
-
-
-
-
-
损伤组
0.05
, http://www.100md.com 0.07
0.10+
0.18++
0.23++
0.18++
0.11++
0.03
injured group
±0.01
±0.01
±0.01
, 百拇医药
±0.06
±0.06
±0.06
±0.05
±0.01
移植组
0.05
0.09+
0.21++*
0.21++
0.25++
0.52++**
, http://www.100md.com
0.53++**
0.07
transp.group
±0.01
±0.01
±0.09
±0.02
±0.02
±0.02
±0.02
±0.01
+：与正常组比(compared with normal group)P<0.05；++：与正常组比(compared with normal group)P<0.01；
, 百拇医药
*：与损伤组比(compared with injured group)P<0.05；**：与损伤组比(compared with injured group)P<0.01
讨 论
脊髓损伤的移植修复历来是临床和基础医学工作者极为重视的课题之一。但作为
宿主，人们公认脊髓是最难植入的部位。因此，移植物的存活与否就成了这一课题研
究中的首要问题。从本研究的结果来看，植入ISC的ESC不仅能够存活，而且可继续生
长发育。我们认为这可能首先和本实验选取的移植胎龄有关。E14ESC的细胞成分主要
以神经上皮细胞为主[12]，这为其移植后的存活和生长发育奠定了细胞学基础。其次
, http://www.100md.com
和移植技术有关。本研究利用微外科技术进行移植，不仅保证彻底剔除了ESC表面的
脊膜，从而防止随ESC一同植入的结缔组织限制移植物的存活和生长发育，也使移植
物和宿主组织密切接触，以及时从宿主获得存活和生长所必需的营养。此外，在显微
镜下仔细缝合宿主脊髓的硬脊膜可阻断外源结缔组织长入对移植物存活和生长发育的
威胁。
移植成功之后，移植修复机制必然成为倍受重视的课题。作者从前述NT-3的生物
效应出发，用原位杂交技术观察了它在ESC、移植物和宿主脊髓内的变化。结果表明，在上述各结构内，细胞成分特异性地呈现了强度不同的阳性反应。而在本研究所用的
, 百拇医药
3种对照切片内，所有细胞成分均呈阴性反应。说明本研究的杂交方法可靠，所得结果
正确。我们认为这可能和所用标本新鲜，所用探针较短、同源性较高、浓度适宜，以
及杂交过程中RNase去除彻底和所用试剂质量较高等因素有关。此外，研究结果也进一
步显示，ESC除移植前呈现很强的杂交反应外，移植后直到15d仍然对NT-3 mRNA呈强
杂交反应。这一方面说明ESC自身在移植后的存活和发育分化过程中需要NT-3的维持
和促进；另一方面也表明ESC向ISC施加神经营养作用。正常情况下再生能力有限的脊
髓神经纤维向着移植物迅速再生，或许正是ESC为其提供了神经营养的结果；ESC挽救
, 百拇医药
损伤神经元的机理可能也在于此。
ISC在本实验中也出现了比正常脊髓强的杂交反应。这种杂交结果的含义之一是，脊髓损伤后表现出的神经再生可能是脊髓本身增强NF表达所致，属于对损伤刺激的一
种自我修复反应；另一含义是，ESC移植后的存活以及随之而来的发育分化可能部分
归功于HSC的神经营养作用。对于脊髓损伤后NT-3 mRNA的变化未见其他报道，但
从Rocamora等[13]的报道来看，化学性损伤以后，脑组织中NT-3 mRNA表达也有类
似的增强现象。尽管损伤可以增强NF的表达，然而单纯损伤所激发的增强程度尚未
, 百拇医药 达到足以修复损伤的水平似乎是不容忽视的客观事实。既往中枢神经再生失败的很多
实例对此已做了很好说明。另外，我们的定性、定量观察都显示ESC植入ISC后，HSC NT-3 mRNA的表达得到了进一步增强。这提示ISC须借助外界条件才能进一步
提高自我修复能力。
究竟ESC是如何增强HSC表达NT-3 mRNA的，本实验结果无法直接回答这一问题。
我们只能根据实验观察做如下分析：中枢神经组织表达NF的能力和中枢神经再生能力
一样随着动物的成熟而逐渐丧失，损伤刺激可能唤醒了成熟组织在胚胎发生时期曾经
有过的现象和机制，于是便以合成NF为能源，重新生长为措施，主动对损伤做出修复
, 百拇医药
反应。从实验结果中可以看到，正常大鼠脊髓NT-3 mRNA含量的确非常低。当脊髓损
伤后其含量明显升高，同时很多胶质细胞也渐呈阳性反应；ESC表达NF的能力移植后
得到了保留，从而在自身生长发育的同时，不断诱使宿主损伤神经纤维向着移植物再
生。宿主神经元为了满足这种生长的需要，不得不动用“备用”的表达能力，甚至动
员与其共存的胶质细胞来为神经再生提供营养。目前实验显示，ESC移植的确大大提
高了HSC表达NT-3mRNA的能力，特别是胶质细胞以更多的数量参与了原位分子杂交
反应。
关于NT-3mRNA表达持续时间问题，我们的分析是，脊髓损伤后由于神经再生
, 百拇医药
的需要而增强NT-3的表达，因此术后7d内本实验的定性、定量都显示了明显增强的
杂交反应。但单纯脊髓损伤后多数神经纤维再生并不能持续长久，所以维持神经生
长和救援神经损伤的NF就随之减少，这在我们杂交结果中的反应就是，损伤7d后杂
交反应强度逐渐减弱。ESC植入以后，在移植物的诱导和促进下，HSC神经纤维呈现
向ESC再生的强劲势头，特别是有了再生靶细胞后，损伤神经纤维再生持续时间更为
长久，这就需要更多更久的神经营养，所以在移植后15d时仍能观察到很强的分子杂
交反应。这种分析与神经发生过程中NF的表达和合成需要靶细胞，以及大量神经元
, 百拇医药
由于得不到靶组织的神经营养而消失的现象[6,14]正好相符。
收稿1996-06修回1997-05
本文图1～8见插图第1页
图 版 说 明
图1移植后7d大鼠脊髓。G.移植物H.宿主脊髓 HE染色×100
图2 移植后30d大鼠脊髓。G.移植物H.宿主脊髓 HE染色×40
图3 正常大鼠脊髓NT-3 mRNA原位杂交。↑.阳性反应前角运动神经元×200
图4 损伤后7d大鼠脊髓损伤侧NT-3 mRNA原位杂交。↑.阳性反应前角运动神经元×100
, http://www.100md.com
图5 移植后15d大鼠脊髓移植侧NT-3 mRNA原位杂交。↑.宿主脊髓阳性反应前角运动
神经元×100
图6 妊娠14d大鼠胚胎脊髓NT-3 mRNA原位杂交呈强阳性，为防止蛋白酶K的消化作用
而切的过厚切片(200μm)，使得组织结构分辩不清×100
图7 移植后15d大鼠脊髓NT-3 mRNA原位杂交。移植物(G)和宿主脊髓(H)神经元均呈阳
性杂交反应(↑)×40
图8 各组大鼠脊髓NT-3 mRNA斑点杂交图
Explanationof figures
, http://www.100md.com
Fig.1 Rat spinal cord on7th day after transplantation.G and H mean graft and host tissue
respectively.HE staining ×100
Fig.2 Rat spinal cord on 30th day after transplantation.G and Hindicate graft and host
tissue respectively.HE staining×40
Fig.3 Spinal cord of normal rat.↑:indicates positively reactedmotor neuron in anterior
, 百拇医药 horn of the spinal cord.NT-3 mRNA in situhybridizaton. ×200
Fig.4 Rat spinal cord on 7th day after operation.↑:indicatespositively reacted motor neuron
in anterior horn of the spinal cord.NT-3mRNA in situ hybridization,injured side.×100
Fig.5 Rat spinal cord on 15th day after transplantation.↑:indicatespositively reacted motor
neuron in anterior horn of the host spinalcord.NT-3 mRNA in situ hybridization.
, 百拇医药
transplanted side. ×100
Fig.6 E14 embryonic spinal cord showed very intensive reaction ofNT-3 mRNA in situ
hybridization,but in order to do againstdigestion of proteinase K,200μm sections
have to be made so as to structure of thetissue can not be distinctively observed.×100
Fig.7 Rat spinal cord on 15th day after transplantation.Neurons(↑) in thegraft and host
, http://www.100md.com
tissue showed positive reaction of NT-3mRNA in situ hybridization.×40
Fig.8 The picture of NT-3 mRNA dot hybridization in eachexperimental group.
参 考 文 献
[1]Reier PJ,Anderson,F Thompson,et al.Neurol tissue transplantation and CNS
trauma:anatomical and functional repair ofthe injured spinal cord.J Neurotrauma,1992,9(Suppl 1):223
, 百拇医药
[2]李仓兵，刘枚，李应玉等.大鼠胚胎脊髓对成鼠急性脊髓损伤的组织修复作
用.中华创伤杂志，1993，9(4)：199
[3]Yasulshi I,Kawaguchi S,MurataM.Restoration of function by replacement of spinal
cord segments in therat.Nature,1994,367(6459):167
[4]Himes B T,Goldberger M E,TesslerA.Grafts of fetal central nervous system tissue
rescue axotomized clarke′snucleus neurons in adult and neonatal operates.J Comp
, 百拇医药
Neurol,1994,339(1):117
[5]Ventimiglia R, Mather PE,JonesBE,et al.The neurotrophins BDNF,NT-3 and NT-4/5
promote survival and morphological andbiochemical differentiation of striatal neurons
in vitro.Eur J Neurosci,1995,7(2):213
[6]Ockel M,Lewin GR,Barde YA.In vivoeffects of neurotrophin-3 during sensory
neurogenesis.Developmen,1996,122(1):301
, 百拇医药
[7]Vejsada R,Sagot Y,KatoC.Quantitative comparison of the transient rescue effects of
neurotrophic factors on axotomizedmotoneurons in vivo.Eur J Neurosci,1995,7(1):108
[8]Wang T,Xie K,Lu B.Neurotrophinspromote maturation of developing neuromuscular
synapses.J Neurosci,1995,15(7 pt 1):4796
[9]金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992：1-74,304-395
, 百拇医药
[10]蔡文琴，王伯云著.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学
技术出版社，1994：406-434
[11]Chomczynski P,SacchiN.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenolo-chloroformextraction.Analy Biochem,1987,162;(1)156
[12]李兵仓，伍亚民，刘枚等.急性脊髓损伤后胎鼠脊髓的脊髓内移植及其影响
因素.第三军医大学学报，1992，14(4)：347
[13]Rocamora N,Massieu L,Boddeke HW,et al.Differential regulation of the expression
, 百拇医药
of nerve growth factor,brain-derivedneurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in
adult rat brain after intrahippocampalinjection of quinolinic acid.Brain Res Mol Brain
Res,1994,26(1-2):89
[14]Barde YA.Neurotrophins:A familyof proteins supporting the survival of neurons.
Prog Clin Biol Res,1994,390(1):45
CHANGESOF NT-3 mRNA BY MOLECULAR HYBRIDIZATION
, 百拇医药
DURING EMBRYONIC SPINAL CORD REPAIRING SPINAL
CORD INJURY OF ADULT RATS
LiBingcang△,Wang Zhengguo,Zhu Peifang,Li Yingyu,HuJian,Liao Weihong
(ResearchInstitute of Surgery,Daping Hospital,Third Military MedicalUniversity,Chongqing)
In order to study the mechanism oftransplantation and repairing from the view of
neurotrophines,on days 1,3,5,7,10,15,and 30 after E14 embryonicspinal cord being
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transplanted into the acutely injured spinal cord of adultrats,changes of NT-3 mRNA
within donor tissue and host tissue were demonstratedqualitatively and quantitatively by
in situ hybridization and dot hybridization.Meantime,normalspinal cord and simply injured
spinal cord were used as controls.It was shown qualitatively thatNT-3 mRNA was mainly
expressed within cytoplasm of motor neurons and a few gliocyte innormal spinal cord;After
, http://www.100md.com
spinal cord injury,hybridizing products expended to the mediumand small-sized neurons,also
more gliocytes took part in hybridization response;Followingtransplantation,positively
hybridizing neurons and gliocytes became more in number in thehost tissue,and embryonic
spinal cord kept an expressing level similar to that before beingtransplanted.It was also
revealed quantitatively that reacting intensity of the cells inthe injured group was strikingly
, 百拇医药
higher than that in the normal group.However hybridizationintensity in the transplanted group
was even higher at many intervals than that in the injuredgroup;Besides these,the lasting
period for hybridization reaction of the transplanted group wasalso different from that of the
injured group.The most intensive reacting phase in the formerpresented at dya 10 and 15,and
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in the latter at day 7 after operation .We suggest thattransplanted embryonic spinal cord can,besides providing neurotrophic factors for itself and host spinalcord,evoke synthetic mechan-
isms of host spinal cord once holding during its embryonicdevelopment so as to enhance expr-
ession of the neurotrophic factors.In this way,the host spinalcord might provide neurotrophic
factors for its regeneration and provide an trophic environmentfor the grafts to develop and
differentiate.
KEY WORDS Spinal cord injury;Spinalcord transplantation;NT-3;Molecular hybridization
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△Research Institute of Surgery,DapingHospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China, 百拇医药