反义周期蛋白B1基因转染HT29细胞后若干细胞增殖调控相关基因表达的变化*
作者：邢录洲 王永潮
单位：北京师范大学细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：分子杂交；反义周期蛋白B1基因；癌基因；抑癌基因；周期蛋白依赖性激酶
解剖学报980102
摘 要 用基因重组技术将插入有反义周期蛋白B1(cyclin B1)基因pXJ41-neo质粒，转染人结肠腺癌HT29，获得了HTB1细胞株。HTB1细胞显示出cyclin B1 mRNA明显
的表达抑制。为了探讨HTB1细胞生长变慢和它的增殖相关基因表达之间的关系，我
们用异硫氰酸胍-酚一步法提取HTB1和HT29细胞的总RNA，并用一些有关的基因探
, 百拇医药
针进行杂交实验。其结果表明：c-myc和CDK4在HTB1中的表达低于在HT29中的表
达；而另一方面，p53、Rb、TGF β和cyclin D3在HTB1细胞中的表达高于对照组。
而cdc2基因表达二者维持相似水平。根据研究结果我们发现，转染有反义cyclin B1
基因的HTB1细胞在一组正、负调节基因的协同作用下，导致细胞周期运转的变化。
在正常细胞的生长、增殖和分化过程中，正、负调节机制使细胞维持一种动态平
衡，在这种动态平衡条件下，细胞按照有序的、相互制约的规律进行着生理活动。几
十年来，在很多科学工作者的不懈努力下，发现和阐明了细胞增殖调控的一些事件和
, 百拇医药
环节，正趋向揭示增殖调控机理的本质。一方面是鉴定出转化病毒基因组中癌基因的
同源物(原癌基因)广泛存在于真核细胞，并且其表达产物涉及到细胞的许多生理功能，参与控制着细胞的生长、增殖和分化；抑癌基因和癌基因作为矛盾的统一体，它们的
基因产物也是信号传递网络中的重要组成元件。另一方面是对细胞周期时钟(cell cycle
clock)的识别，发现所有真核生物从酵母到哺乳类细胞增殖调控机制是一样的，调控
细胞通过G1/S和G2/M转换，在这一机制中发挥核心作用的是一个由基因产物p34cdc2[1]及其家族与周期蛋白cyclin[2]家族形成的激酶复合体。
人们曾经认为，cyclin B/cdc2直接磷酸化有丝分裂器不同部位的各种结构蛋白，而
, 百拇医药
成为M期的直接执行者。但最近随着在M期发挥作用的其他激酶的发现，表明同许多
信号转导一样，M期的发生也是一种级联磷酸化的反应，cyclin B/cdc2组成的M期促进
因子MPF[3]位于级联磷酸化的最上游，因而成为诱导者，并且与其他激酶一起各有分
工的磷酸化一套M期结构蛋白和调节蛋白，因而直接和间接地诱导M期的发生。解开
细胞增殖调控之谜不仅对揭示生命活动的规律具有理论意义，而且对提高人类健康水
平具有实际意义。我们将反义cyclin B1基因转染HT29细胞后，鉴定出一株内源性cyclin
B1 mRNA的表达及其生长明显受到抑制的细胞株HTB1。本工作以HT29为对照，系统
, 百拇医药
观察了HTB1细胞与增殖相关的基因表达变化和生长间的关系。
材料和方法
1.材料
1.1 菌种：大肠杆菌菌株HB101为本实验室保存。
1.2 质粒基因：(1) pCycB1由Tony Hunter教授(The Salk Institute forBiological Studies,San Diego, California)惠赠。其内部含有人类cyclin B1基因的全长cDNA。该基因大小
为1.45kb，克隆于质粒载体pGEM-4的BamH I酶切位点；(2) pCdc2来源于加州大学，其内部含有人类cdc2基因的长为2.0kb的cDNA，克隆于pCDVSV40的BamH I位点；
, 百拇医药
(3) pCycD3由DavidBeach教授(The Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork)惠赠，其
内部含有人类cyclinD3基因的长为1.96kb的cDNA，克隆于pUC118的EcoR Ⅰ位点；
(4) pCdk4内部含有人类cdk4基因的长为0.3kb的PCR片段，该片段由本实验室扩增、测
序，克隆于pUC18的EcoRI-Hind Ⅲ位点；(5) pMyc由本实验室保存，其内部含有人类
c-myc基因的长为2.2kb的cDNA，克隆于pSP65的EcoR Ⅰ位点；(6) pP53由本实验室保
存，其内部含有人类p53基因的长为1.7kb的cDNA，克隆于pUC18的EcoR Ⅰ-Hind Ⅲ
, 百拇医药
位点；(7) pRb由本实验室保存，其内部含有人类Rb基因的长为0.9kb的cDNA，克隆于
载体的EcoR Ⅰ位点；(8)pTGF-β1由本实验室保存，其内部含有人类TGF-β1基因的
长为2.0kb的cDNA， 克隆于pBR322的EcoR Ⅰ位点。
1.3 试剂：限制性内切酶、同位素标记试剂盒prime-a-gene labelling system(Promega)；
琼脂糖、低熔点琼脂糖、DEPC、HEPES、MOPS、gunidinium isothiocyanate(Gibco);
sodium lauryl sarcocinate, sodium citrate (Sigma);2-mercaptoethanol, formamide, formal-
, 百拇医药
dehyde (Fluka); (α-32P) dCTP (3 000 Ci/mmol,10mCi/ml) (北京亚辉公司)；其他试剂为
国产分析纯。
1.4 细胞株：人结肠腺癌HT29细胞为本实验室保存，HTB1本室用cyclin B1基因转染
的HT29细胞系[4]。
2.方法[5]
2.1 基因片段的制备：将各种质粒分别转化感受态细胞，制备质粒DNA，用相应的
限制性内切酶消化，用低熔点琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
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2.2 细胞总体RNA的制备：本实验采用异硫氰酸胍\|酚一步法，参照Chomczynski[5]的
方法略有改动。当RNA样品中18S，28S rRNA完整，OD260/OD280大于1.85时用于实
验。样品保存于-70℃。1 OD260=40mgRNA/L。(CSB buffer: 42mmol/L sodium citrate,0.83% N-lauryl sarcosine, 1% 2-mercaptoethanol)
2.3 点杂交(dot blot): 硝酸纤维素膜浸泡于RNase-free水中湿润，转入20×SSC中于
室温浸泡40min。RNA样品与dotMix(formamide 1 000 μl, 37% formaldehyde 350μl,20×SSC 100μl)按1∶2.9混合，68℃温浴15min, 冰水中冷却。利用多孔过滤加样器
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Minifold Ⅱ(Schleicher和 Schuell) 将RNA样品点样于硝酸纤维素膜上。室温自然晾干，真空80℃烤膜2h。
2.4 DNA探针的制备：本实验采用Promega公司的产品prime-a-gene labeling system,按照操作指南进行。以特定基因的DNA片段(25ng)作模板，(α-32p) dCTP和3种未标
记的dATP, dGTP,dTTP在klenow fragment作用下，合成出高比活度双链DNA探针。
2.5 预杂交、杂交及放射自显影：将样品膜浸入5×SSC湿润后，装入杂交袋中，按
小于0.2ml/cm2的用量加入预杂交液(5×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 200mg/Ldenatured
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salmon sperm DNA, 50% Formamide)，于42℃水浴预杂交过夜。加入水浴变性的DNA探
针，于42℃杂交18～24h。(50×Denhardt:Ficoll-400 5g, polyrinpyrrolidone 5g, BSA-V 5g,加水至500ml; 20×SSC:NaCl 175.3g, sodium citric88.2g, pH7.0, 加水至1 000ml)。
洗膜条件：1×SSC/0.1%SDS于68℃洗3次，每次15min，再用0.2×SSC/0.1%SDS
于68℃洗膜，直至同位素Monitor仪器计数为2-10 CPS。室温晾干，用保鲜膜盖封，样
品膜两面各放一张X线胶片置于曝光夹中，于-70℃放射自显影2～10d。显影、定影后，进行灰度扫描，比较信号差异。
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图1 c-myc在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.1 Expression ofc-myc in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图2 Rb在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.2 Expression ofRb in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图3 p53在HTB1和HT29细胞中的表达
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Fig.3 Expression ofp53 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图4 TGF-β 1在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.4 Expression ofTGF-β 1 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图5 cdc-2在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.5 Expression ofcdc2 in HTB1and HT29 cells
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A: HT29 B:HTB1
图6 cdk4在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.6 Expression ofcdk4 in HTB1and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图7 cyclin D3在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.7 Expression ofcyclin D3 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
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结 果
1.myc基因表达的变化
用α-32P-dCTP标记的c-myc基因探针与转染细胞HTB1和对照细胞HT29的RNA
进行dot blot杂交，结果显示，反义cyclin B1转染HT29细胞后，c-myc表达下降了
60%(图1)。
2.Rb、p53和转化生长因子TGF\|β1基因表达的变化
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用α-32P-dCTP标记的Rb、p53及TGF-β1基因探针分别与上述两种细胞的RNA
进行dot blot杂交。结果显示，转染细胞中Rb和p53表达明显升高，分别是对照细胞
的1.65，2.32倍(图2，3)。抑癌基因Rb和p53表达水平的升高负调节细胞的增殖。
TGF-β1的表达水平也显著升高，是对照的4.86倍(图4)。TGF-β1是一种多功
能分子[6]，其生物学效应复杂，但它作为典型的细胞生长抑制性多肽生长因子，已被公认。
3.cdc2、cyclin D3和cdk4基因表达的变化
用α-32P-dCTP标记的cdc2、cyclinD3和cdk4的基因探针分别与上述两种细胞的
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RNA进行dotblot杂交。结果显示，cdc2的表达没有明显变化。cdk4的表达是对照的
67%(图5，6)。cyclinD3的表达反而升高，是对照的1.46倍(图7)。
讨 论
细胞周期的分子调节使细胞在增殖与分化之间保持平衡。在这一过程中，两个蛋
白质家族形成的复合物(cyclin和cdks)作为正调节因子发挥着主要作用。负调节作用由
肿瘤抑制基因蛋白质，特别是p53和Rb，以及CKI(cyclin-dependent kinaseinhibitor)[7]蛋白家族起着重要作用。细胞的不同周期时相间的转变是在checkpoints处受调控的。
在肿瘤形成过程中，许多checkpoints失去调控，这通常是由于cyclin/cdk复合物中的一
, 百拇医药
些变化引起的。造成这种结果的原因可能是正调控因子的异常表达，如cyclins；也可
能是负调节因子的丢失，如CKIs。
cyclins是在海洋无脊椎动物早期胚胎细胞分裂过程中发现的。现在认为，G1
cyclin促进细胞通过G1期，超过G1/S交界。G1 cyclins中研究比较多的有3种D型cyclins
和cyclin E。G1cyclins和它们相应的cdks在细胞从G1进入S期进程中起决定作用。D型
cyclins[8]在cyclins家族有不同寻常的一面，它们能被外源生长因子调节。例如，细胞
静止因子(CSF)对其有诱导作用，而TGF-β1导致它们的下降调节。cyclin D与其cdk协
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作使Rb磷酸化，解除Rb的生长抑制作用，使细胞可能由G1期进入S期。Cyclin E[9]表
达与cyclin A和cyclin B相似，具有周期依赖性。cyclin E与cyclin D的活性作用有一定程
度重叠，它的活性从G1晚期一直延伸到S期。这说明它能驱使细胞经过一个特殊的限
制点(checkpoint)，它在DNA复制的起始中具有重要作用。cyclin A[10]促进细胞通过S
期，cyclin B调节细胞周期运转通过分裂期 。
cdc2首先是在裂殖酵母中认识的，它在进化上具有高度保守性。在高等动物中，有一个cdc2相关蛋白质的家族，这些蛋白质都需要结合一个cyclin，才能表现出激酶
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活性，因此它们被称作cdks(cyclin-dependent kinases)。人类cdc2(cdk1)是通过它具有
代替酵母cdc2的功能分离得到的，它主要结合有丝分裂cyclins，负责对有丝分裂的调
控。在cdks家族中，第2个蛋白激酶cdk2，它与cdc2具有65%的同源性，主要与cyclin
E和cyclin A结合，也能与cyclin D1结合，而与cyclin D3的结合较弱。cdk4和cdk6能结
合D型cyclins。其他类型的cdks和cyclins的名称来源主要是根据它们分别与cdc2和cyclin
的保守序列具有较高的同源性，它们在细胞周期中的作用还不够清楚。
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p53[11]是一个DNA结合蛋白，能够激活p21的转录[12]。p21是cdk的抑制因子，能
结合多种cdks，抑制cyclin/cdk复合物的活化，降低它们对目标蛋白发挥磷酸化作用的
能力，其中最重要的是RB蛋白。非磷酸化的RB同转录因子E2F形成复合物，只有RB
磷酸化，才能释放出E2F。cyclin D/cdk4和cyclinD/cdk6执行了这一功能。这样，p21通
过cyclin/cdk介导的通路将p53和RB的作用联系了起来。
p15是cdk抑制物中另一类代表。实验证明，用TGF-β处理人角质细胞时，p15的
表达增加了近30倍，从而增加了对cdk4和cdk6的结合，使它们的激酶或活性受到损
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失[13]，所以p15在TGF β抑制细胞增殖过程中发挥了信使作用。
在人类肿瘤中还没有关于cdk4基因突变的报道，但是cdk4在一些肿瘤细胞系中有
过表达现象[14]，并且在一些肿瘤中有cdk4基因的扩增[15]。cdk4的这种过表达可能使
细胞对于由生长抑制因子(如TGF-β)引起的细胞阻抑失去敏感性。
c-myc为快速早期应答基因，其表达产物能结合DNA，促进基因转录。c-myc在许
多肿瘤细胞中都出现过表达。
我们的实验结果表明，反义cyclin B1转染HT29细胞后，c-myc的表达下降了60%，抑癌基因Rb、p53的表达明显升高，TGF-β1的表达增加更为显著。cdc2在转染前后细
, 百拇医药
胞中基本没有变化，cdk4的表达明显下降。与此同时cyclin D3的表达升高了，其含量
是对照细胞的1.46倍，引起这种变化的原因有待于进一步探讨。但是，转染细胞的增
殖受到了抑制，而且G1期细胞数也有显著增加，为此，我们认为cdk4表达下降对细胞
的影响可能超过了cyclin D3表达升高所起的作用。一个反义的cyclin B1的转染HT29在
降低HTB1表达下降/增殖抑制的同时，发现其正负调控基因也发生相应的变化，表现
出一种协同作用。
正常的细胞癌变是受多因素和多基因作用的多阶段复杂过程。如果这些作用不是
, 百拇医药
以一条通路顺序活动，而是以多条通路，那么阻断其中的一个环节就不可能彻底抑制
癌细胞的特性。有报告认为cyclin A的过表达与肝癌的发生有关[11]。如果要回答cyclin
B1基因是否为潜在的癌基因，那么用过表达的cyclin B1基因去转染正常细胞，观察能
否出现转化表型，有助于这一问题的探讨。反义cyclin B1转染总的结果增强了细胞周
期的负调系统活动，导致增殖活性下降，但细胞增殖调控是一个多因子参与的复杂调
节网络，其详细机理有待于深入研究。
收稿 1996-09 修回 1996-04
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
参考文献
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with MDM2 and GL1 in human sarcomas.Cancer Res, 1993, 53(11):5535
STUDYON THE EXPRESSION OF SEVERAL CELL
, 百拇医药
PROLIFERATION RELATED GENES AFTER TRANSFECTING
ANTISENSE CYCLIN B1 INTO HT29 CELLS
XingLuzhou, Wang Yongchao△(Key Labof Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing NormalUniversity, Beijing)
HTB1 cell line was derived from HT29cells, which was transfected in our laboratory
with recombinant plasmid pXJ41-neo containing an antisense cyclinB1 gene. The HTB1 cells
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exhibited obvious expression inhibition of cyclin B1 mRNA. Forexploration of the relatio-
nship between the reduced growth rate and its proliferationrelated gene expressin in HTB1
cells, we prepared the total RNA of HT29 and HTB1 cells with thesingle-step method of
gunidinium isothiocyanate-phenol and conducted hybridization testwith several related gene
probes. The results demonstrated that the expression of c-myc andCDK4 is lower in HTB1
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than that in HT29 cells. On the other hand, the expression ofP53, Rb, TGF β and cyclin D3
is higher in HTB1 than that in the control cells. However, theexpression of cdc2 gene remain
at similar level in both cell lines. From the results of ourstudies on proliferation related gene
expression of the two cell lines, we found that transfecting anantisense cyclin B1 gene into
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HT29 cell could result in cell cycle progression changes in HTB1cells under the cooperative
activities of a group of positive and negative regulative genes. KEY WORDS Molecular hybridization;Antisense cyclin B1;Oncogene; Tumor
suppressor gene; Cyclins/cdks
____________________
△Key Laboratory of Cell Proliferation andRegulation Biology,Beijing Normal University, Beijing 100875,China, 百拇医药
单位：北京师范大学细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：分子杂交；反义周期蛋白B1基因；癌基因；抑癌基因；周期蛋白依赖性激酶
解剖学报980102
摘 要 用基因重组技术将插入有反义周期蛋白B1(cyclin B1)基因pXJ41-neo质粒，转染人结肠腺癌HT29，获得了HTB1细胞株。HTB1细胞显示出cyclin B1 mRNA明显
的表达抑制。为了探讨HTB1细胞生长变慢和它的增殖相关基因表达之间的关系，我
们用异硫氰酸胍-酚一步法提取HTB1和HT29细胞的总RNA，并用一些有关的基因探
, 百拇医药
针进行杂交实验。其结果表明：c-myc和CDK4在HTB1中的表达低于在HT29中的表
达；而另一方面，p53、Rb、TGF β和cyclin D3在HTB1细胞中的表达高于对照组。
而cdc2基因表达二者维持相似水平。根据研究结果我们发现，转染有反义cyclin B1
基因的HTB1细胞在一组正、负调节基因的协同作用下，导致细胞周期运转的变化。
在正常细胞的生长、增殖和分化过程中，正、负调节机制使细胞维持一种动态平
衡，在这种动态平衡条件下，细胞按照有序的、相互制约的规律进行着生理活动。几
十年来，在很多科学工作者的不懈努力下，发现和阐明了细胞增殖调控的一些事件和
, 百拇医药
环节，正趋向揭示增殖调控机理的本质。一方面是鉴定出转化病毒基因组中癌基因的
同源物(原癌基因)广泛存在于真核细胞，并且其表达产物涉及到细胞的许多生理功能，参与控制着细胞的生长、增殖和分化；抑癌基因和癌基因作为矛盾的统一体，它们的
基因产物也是信号传递网络中的重要组成元件。另一方面是对细胞周期时钟(cell cycle
clock)的识别，发现所有真核生物从酵母到哺乳类细胞增殖调控机制是一样的，调控
细胞通过G1/S和G2/M转换，在这一机制中发挥核心作用的是一个由基因产物p34cdc2[1]及其家族与周期蛋白cyclin[2]家族形成的激酶复合体。
人们曾经认为，cyclin B/cdc2直接磷酸化有丝分裂器不同部位的各种结构蛋白，而
, 百拇医药
成为M期的直接执行者。但最近随着在M期发挥作用的其他激酶的发现，表明同许多
信号转导一样，M期的发生也是一种级联磷酸化的反应，cyclin B/cdc2组成的M期促进
因子MPF[3]位于级联磷酸化的最上游，因而成为诱导者，并且与其他激酶一起各有分
工的磷酸化一套M期结构蛋白和调节蛋白，因而直接和间接地诱导M期的发生。解开
细胞增殖调控之谜不仅对揭示生命活动的规律具有理论意义，而且对提高人类健康水
平具有实际意义。我们将反义cyclin B1基因转染HT29细胞后，鉴定出一株内源性cyclin
B1 mRNA的表达及其生长明显受到抑制的细胞株HTB1。本工作以HT29为对照，系统
, 百拇医药
观察了HTB1细胞与增殖相关的基因表达变化和生长间的关系。
材料和方法
1.材料
1.1 菌种：大肠杆菌菌株HB101为本实验室保存。
1.2 质粒基因：(1) pCycB1由Tony Hunter教授(The Salk Institute forBiological Studies,San Diego, California)惠赠。其内部含有人类cyclin B1基因的全长cDNA。该基因大小
为1.45kb，克隆于质粒载体pGEM-4的BamH I酶切位点；(2) pCdc2来源于加州大学，其内部含有人类cdc2基因的长为2.0kb的cDNA，克隆于pCDVSV40的BamH I位点；
, 百拇医药
(3) pCycD3由DavidBeach教授(The Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork)惠赠，其
内部含有人类cyclinD3基因的长为1.96kb的cDNA，克隆于pUC118的EcoR Ⅰ位点；
(4) pCdk4内部含有人类cdk4基因的长为0.3kb的PCR片段，该片段由本实验室扩增、测
序，克隆于pUC18的EcoRI-Hind Ⅲ位点；(5) pMyc由本实验室保存，其内部含有人类
c-myc基因的长为2.2kb的cDNA，克隆于pSP65的EcoR Ⅰ位点；(6) pP53由本实验室保
存，其内部含有人类p53基因的长为1.7kb的cDNA，克隆于pUC18的EcoR Ⅰ-Hind Ⅲ
, 百拇医药
位点；(7) pRb由本实验室保存，其内部含有人类Rb基因的长为0.9kb的cDNA，克隆于
载体的EcoR Ⅰ位点；(8)pTGF-β1由本实验室保存，其内部含有人类TGF-β1基因的
长为2.0kb的cDNA， 克隆于pBR322的EcoR Ⅰ位点。
1.3 试剂：限制性内切酶、同位素标记试剂盒prime-a-gene labelling system(Promega)；
琼脂糖、低熔点琼脂糖、DEPC、HEPES、MOPS、gunidinium isothiocyanate(Gibco);
sodium lauryl sarcocinate, sodium citrate (Sigma);2-mercaptoethanol, formamide, formal-
, 百拇医药
dehyde (Fluka); (α-32P) dCTP (3 000 Ci/mmol,10mCi/ml) (北京亚辉公司)；其他试剂为
国产分析纯。
1.4 细胞株：人结肠腺癌HT29细胞为本实验室保存，HTB1本室用cyclin B1基因转染
的HT29细胞系[4]。
2.方法[5]
2.1 基因片段的制备：将各种质粒分别转化感受态细胞，制备质粒DNA，用相应的
限制性内切酶消化，用低熔点琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
, http://www.100md.com
2.2 细胞总体RNA的制备：本实验采用异硫氰酸胍\|酚一步法，参照Chomczynski[5]的
方法略有改动。当RNA样品中18S，28S rRNA完整，OD260/OD280大于1.85时用于实
验。样品保存于-70℃。1 OD260=40mgRNA/L。(CSB buffer: 42mmol/L sodium citrate,0.83% N-lauryl sarcosine, 1% 2-mercaptoethanol)
2.3 点杂交(dot blot): 硝酸纤维素膜浸泡于RNase-free水中湿润，转入20×SSC中于
室温浸泡40min。RNA样品与dotMix(formamide 1 000 μl, 37% formaldehyde 350μl,20×SSC 100μl)按1∶2.9混合，68℃温浴15min, 冰水中冷却。利用多孔过滤加样器
, 百拇医药
Minifold Ⅱ(Schleicher和 Schuell) 将RNA样品点样于硝酸纤维素膜上。室温自然晾干，真空80℃烤膜2h。
2.4 DNA探针的制备：本实验采用Promega公司的产品prime-a-gene labeling system,按照操作指南进行。以特定基因的DNA片段(25ng)作模板，(α-32p) dCTP和3种未标
记的dATP, dGTP,dTTP在klenow fragment作用下，合成出高比活度双链DNA探针。
2.5 预杂交、杂交及放射自显影：将样品膜浸入5×SSC湿润后，装入杂交袋中，按
小于0.2ml/cm2的用量加入预杂交液(5×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 200mg/Ldenatured
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salmon sperm DNA, 50% Formamide)，于42℃水浴预杂交过夜。加入水浴变性的DNA探
针，于42℃杂交18～24h。(50×Denhardt:Ficoll-400 5g, polyrinpyrrolidone 5g, BSA-V 5g,加水至500ml; 20×SSC:NaCl 175.3g, sodium citric88.2g, pH7.0, 加水至1 000ml)。
洗膜条件：1×SSC/0.1%SDS于68℃洗3次，每次15min，再用0.2×SSC/0.1%SDS
于68℃洗膜，直至同位素Monitor仪器计数为2-10 CPS。室温晾干，用保鲜膜盖封，样
品膜两面各放一张X线胶片置于曝光夹中，于-70℃放射自显影2～10d。显影、定影后，进行灰度扫描，比较信号差异。
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图1 c-myc在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.1 Expression ofc-myc in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图2 Rb在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.2 Expression ofRb in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图3 p53在HTB1和HT29细胞中的表达
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Fig.3 Expression ofp53 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图4 TGF-β 1在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.4 Expression ofTGF-β 1 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图5 cdc-2在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.5 Expression ofcdc2 in HTB1and HT29 cells
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A: HT29 B:HTB1
图6 cdk4在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.6 Expression ofcdk4 in HTB1and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
图7 cyclin D3在HTB1和HT29细胞中的表达
Fig.7 Expression ofcyclin D3 in HTB1 and HT29 cells
A: HT29 B:HTB1
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结 果
1.myc基因表达的变化
用α-32P-dCTP标记的c-myc基因探针与转染细胞HTB1和对照细胞HT29的RNA
进行dot blot杂交，结果显示，反义cyclin B1转染HT29细胞后，c-myc表达下降了
60%(图1)。
2.Rb、p53和转化生长因子TGF\|β1基因表达的变化
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用α-32P-dCTP标记的Rb、p53及TGF-β1基因探针分别与上述两种细胞的RNA
进行dot blot杂交。结果显示，转染细胞中Rb和p53表达明显升高，分别是对照细胞
的1.65，2.32倍(图2，3)。抑癌基因Rb和p53表达水平的升高负调节细胞的增殖。
TGF-β1的表达水平也显著升高，是对照的4.86倍(图4)。TGF-β1是一种多功
能分子[6]，其生物学效应复杂，但它作为典型的细胞生长抑制性多肽生长因子，已被公认。
3.cdc2、cyclin D3和cdk4基因表达的变化
用α-32P-dCTP标记的cdc2、cyclinD3和cdk4的基因探针分别与上述两种细胞的
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RNA进行dotblot杂交。结果显示，cdc2的表达没有明显变化。cdk4的表达是对照的
67%(图5，6)。cyclinD3的表达反而升高，是对照的1.46倍(图7)。
讨 论
细胞周期的分子调节使细胞在增殖与分化之间保持平衡。在这一过程中，两个蛋
白质家族形成的复合物(cyclin和cdks)作为正调节因子发挥着主要作用。负调节作用由
肿瘤抑制基因蛋白质，特别是p53和Rb，以及CKI(cyclin-dependent kinaseinhibitor)[7]蛋白家族起着重要作用。细胞的不同周期时相间的转变是在checkpoints处受调控的。
在肿瘤形成过程中，许多checkpoints失去调控，这通常是由于cyclin/cdk复合物中的一
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些变化引起的。造成这种结果的原因可能是正调控因子的异常表达，如cyclins；也可
能是负调节因子的丢失，如CKIs。
cyclins是在海洋无脊椎动物早期胚胎细胞分裂过程中发现的。现在认为，G1
cyclin促进细胞通过G1期，超过G1/S交界。G1 cyclins中研究比较多的有3种D型cyclins
和cyclin E。G1cyclins和它们相应的cdks在细胞从G1进入S期进程中起决定作用。D型
cyclins[8]在cyclins家族有不同寻常的一面，它们能被外源生长因子调节。例如，细胞
静止因子(CSF)对其有诱导作用，而TGF-β1导致它们的下降调节。cyclin D与其cdk协
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作使Rb磷酸化，解除Rb的生长抑制作用，使细胞可能由G1期进入S期。Cyclin E[9]表
达与cyclin A和cyclin B相似，具有周期依赖性。cyclin E与cyclin D的活性作用有一定程
度重叠，它的活性从G1晚期一直延伸到S期。这说明它能驱使细胞经过一个特殊的限
制点(checkpoint)，它在DNA复制的起始中具有重要作用。cyclin A[10]促进细胞通过S
期，cyclin B调节细胞周期运转通过分裂期 。
cdc2首先是在裂殖酵母中认识的，它在进化上具有高度保守性。在高等动物中，有一个cdc2相关蛋白质的家族，这些蛋白质都需要结合一个cyclin，才能表现出激酶
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活性，因此它们被称作cdks(cyclin-dependent kinases)。人类cdc2(cdk1)是通过它具有
代替酵母cdc2的功能分离得到的，它主要结合有丝分裂cyclins，负责对有丝分裂的调
控。在cdks家族中，第2个蛋白激酶cdk2，它与cdc2具有65%的同源性，主要与cyclin
E和cyclin A结合，也能与cyclin D1结合，而与cyclin D3的结合较弱。cdk4和cdk6能结
合D型cyclins。其他类型的cdks和cyclins的名称来源主要是根据它们分别与cdc2和cyclin
的保守序列具有较高的同源性，它们在细胞周期中的作用还不够清楚。
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p53[11]是一个DNA结合蛋白，能够激活p21的转录[12]。p21是cdk的抑制因子，能
结合多种cdks，抑制cyclin/cdk复合物的活化，降低它们对目标蛋白发挥磷酸化作用的
能力，其中最重要的是RB蛋白。非磷酸化的RB同转录因子E2F形成复合物，只有RB
磷酸化，才能释放出E2F。cyclin D/cdk4和cyclinD/cdk6执行了这一功能。这样，p21通
过cyclin/cdk介导的通路将p53和RB的作用联系了起来。
p15是cdk抑制物中另一类代表。实验证明，用TGF-β处理人角质细胞时，p15的
表达增加了近30倍，从而增加了对cdk4和cdk6的结合，使它们的激酶或活性受到损
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失[13]，所以p15在TGF β抑制细胞增殖过程中发挥了信使作用。
在人类肿瘤中还没有关于cdk4基因突变的报道，但是cdk4在一些肿瘤细胞系中有
过表达现象[14]，并且在一些肿瘤中有cdk4基因的扩增[15]。cdk4的这种过表达可能使
细胞对于由生长抑制因子(如TGF-β)引起的细胞阻抑失去敏感性。
c-myc为快速早期应答基因，其表达产物能结合DNA，促进基因转录。c-myc在许
多肿瘤细胞中都出现过表达。
我们的实验结果表明，反义cyclin B1转染HT29细胞后，c-myc的表达下降了60%，抑癌基因Rb、p53的表达明显升高，TGF-β1的表达增加更为显著。cdc2在转染前后细
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胞中基本没有变化，cdk4的表达明显下降。与此同时cyclin D3的表达升高了，其含量
是对照细胞的1.46倍，引起这种变化的原因有待于进一步探讨。但是，转染细胞的增
殖受到了抑制，而且G1期细胞数也有显著增加，为此，我们认为cdk4表达下降对细胞
的影响可能超过了cyclin D3表达升高所起的作用。一个反义的cyclin B1的转染HT29在
降低HTB1表达下降/增殖抑制的同时，发现其正负调控基因也发生相应的变化，表现
出一种协同作用。
正常的细胞癌变是受多因素和多基因作用的多阶段复杂过程。如果这些作用不是
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以一条通路顺序活动，而是以多条通路，那么阻断其中的一个环节就不可能彻底抑制
癌细胞的特性。有报告认为cyclin A的过表达与肝癌的发生有关[11]。如果要回答cyclin
B1基因是否为潜在的癌基因，那么用过表达的cyclin B1基因去转染正常细胞，观察能
否出现转化表型，有助于这一问题的探讨。反义cyclin B1转染总的结果增强了细胞周
期的负调系统活动，导致增殖活性下降，但细胞增殖调控是一个多因子参与的复杂调
节网络，其详细机理有待于深入研究。
收稿 1996-09 修回 1996-04
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* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
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STUDYON THE EXPRESSION OF SEVERAL CELL
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PROLIFERATION RELATED GENES AFTER TRANSFECTING
ANTISENSE CYCLIN B1 INTO HT29 CELLS
XingLuzhou, Wang Yongchao△(Key Labof Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing NormalUniversity, Beijing)
HTB1 cell line was derived from HT29cells, which was transfected in our laboratory
with recombinant plasmid pXJ41-neo containing an antisense cyclinB1 gene. The HTB1 cells
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exhibited obvious expression inhibition of cyclin B1 mRNA. Forexploration of the relatio-
nship between the reduced growth rate and its proliferationrelated gene expressin in HTB1
cells, we prepared the total RNA of HT29 and HTB1 cells with thesingle-step method of
gunidinium isothiocyanate-phenol and conducted hybridization testwith several related gene
probes. The results demonstrated that the expression of c-myc andCDK4 is lower in HTB1
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than that in HT29 cells. On the other hand, the expression ofP53, Rb, TGF β and cyclin D3
is higher in HTB1 than that in the control cells. However, theexpression of cdc2 gene remain
at similar level in both cell lines. From the results of ourstudies on proliferation related gene
expression of the two cell lines, we found that transfecting anantisense cyclin B1 gene into
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HT29 cell could result in cell cycle progression changes in HTB1cells under the cooperative
activities of a group of positive and negative regulative genes. KEY WORDS Molecular hybridization;Antisense cyclin B1;Oncogene; Tumor
suppressor gene; Cyclins/cdks
____________________
△Key Laboratory of Cell Proliferation andRegulation Biology,Beijing Normal University, Beijing 100875,China, 百拇医药