一氧化氮在长时程增强中作用的研究进展
作者：杨志华
单位：杨志华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)
关键词：长时程增强；一氧化氮；逆行性信使
生理科学进展000210 摘要 长时程增强(LTP)是神经突触可塑性和突触传递的一种表现形式，被认为是学习和记忆的细胞学基础，但有关LTP的形成机制仍存有争论。普遍认为LTP的维持需要逆行性信使的参与，本文就NO作为逆向信使以及其在LTP学习和记忆中的作用做了简要综述。
学科分类号 Q427
传统上认为化学神经传递是以顺行方向进行的, 即从突触前神经元传递到突触后神经元。近来大量的证据表明信号也可以逆行方向传递, 即从突触后神经元传递到突触前神经元, 并且认为这种逆行信号在海马的长时程增强(LTP)中起重要作用。能跨膜扩散的可溶性气体NO, 被认为在LTP中起逆行信使的作用, 本文拟就这方面的有关进展做一简要综述。
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一、NO作为逆向信使
在发现NO是神经递质之前, 有关LTP主要是由突触前机制还是突触后机制形成一直存在争论。实验发现诱导LTP能增加突触前递质的释放, 表明在突触后位点和突触前位点之间存在某种联系。参与LTP产生的逆行信使必须满足以下条件: (1) 必须由突触后神经元产生。已发现在海马突触后锥体细胞的胞体和树突存在NO合酶, Arancio等[1]发现突触后注入NO合酶抑制剂能阻断LTP的形成; (2) 必须能从突触后扩散到突触前, 并作用于突触前位点。研究发现在海马突触前存在NO敏感的鸟苷酸环化酶, 突触前注入NO释放剂能促进LTP形成, 注入NO吸收剂能阻断NO的这种作用, Nei等[2]证实NO能增加海马的递质释放; (3)作用部位必须十分有限, 以保证其作用的特异性。NO的半衰期很短, 保证了其作用的特异性。以上几点表明海马神经元突触后位点释放NO, 并作用于突触前部位。
二、NO参与LTP和长时程抑制(LTD)的诱导
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已有不少实验结果表明NO参与LTP的诱导和/或维持。脑片实验发现NO或NO释放剂均能促进LTP的形成。Wu等[3]证实NO合酶抑制剂1-(2-三氟甲基)咪唑和3-溴-7-硝基-indazole能抑制海马脑片齿状回的LTP和LTD， L-精氨酸可倒转这种抑制作用, 因为L-精氨酸能将抑制剂从NO合酶的L-精氨酸结合位点上置换下来。培养基中加入血红蛋白(可吸收NO)也可阻止LTP的诱导。血红蛋白不能被细胞吸收, 所以NO要起作用必须在细胞间运动。Mizutani等[4]在整体实验中也发现NO合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸、NG-甲基-L-精氨酸及NG-硝基-L-精氨酸甲酯能阻断海马齿状回LTP的诱导, L-精氨酸能倒转这种作用。有关NO的作用机制，Musleh 等[5]认为NO合酶抑制剂NG-甲基-L-精氨酸通过干扰NMDA受体的功能而抑制LTP的诱导, 但Malen等[6]的结果表明NO并不是通过作用于NMDA受体而促进LTP的诱导的，Kleppisch等[7]认为NO可能通过ADP核糖基化而诱导LTP。
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另一些实验不能证实NO合酶的抑制剂能阻止海马脑片LTP的形成, 或仅仅在某些特定条件下抑制LTP。Bannerman等在整体实验中也没有发现NO合酶抑制剂能抑制LTP的形成。结果的不一致可能与以下一些因素有关: (1)实验条件的不同。有人发现NO合酶抑制剂仅仅在室温下阻止海马脑片LTP的诱导(大多数以前的实验都是在此条件下进行的)，在更接近生理条件下(30℃)不能阻止LTP的诱导。(2)刺激条件的不同。海马脑片实验发现NO合成酶抑制剂不能阻断低强度高频刺激引起的LTP, 但可阻断高强度高频刺激诱发的LTP。另外的实验得到了相反的结果: 高频刺激诱发的LTP可被阻断, 而串配对脉冲(paired pulse)诱发的LTP不能被阻断, 这种刺激能诱发出更稳定的LTP; Haley等发现NO合酶抑制剂能抑制弱刺激诱发的LTP, 不能抑制强刺激诱发的LTP。在CA1区记录发现NO略为抑制低或中等强度刺激诱发的EPSPs, 而不能抑制高强度刺激引起的EPSPs, 这表明强刺激能掩盖NO的效应, 但当NO作用时间延长时, NO对低或中等强度刺激诱发的EPSPs的抑制作用消失, 强刺激能诱发出更大的EPSPs, 认为NO引起的基因转录可能参与这一效应。(3)脑片的不同。NO对LTP的影响似乎与脑片标本的状态及实验条件有关, 而且NO并不是存在于脑的所有部位。脑片实验已在海马Subarea stratum radiatum 发现与NO无关的LTP成分, 而Stratum oriens 的LTP大部分与NO合酶无关。NO合酶染色实验表明只有少量神经元表达NO合酶。因为LTP是通过记录场兴奋性突触后电位而得到的, 而记录到的场兴奋性突触后电位是许多神经元的场电位之和, 因此不同的结果可能是由于所记录亚群神经元中NO合酶表达不同所致。(4)NO合成酶抑制剂的不同。L-NAME对乙酰胆碱M-受体有拮抗作用, 并抑制内皮型NO合酶活性，因此影响血压和脑血流。Nitroindazole(7-NI)在中等浓度时不影响血压，但可抑制神经元型NO合酶的活性, 在体研究发现7-NI能完全阻断CA1区的LTP, 脑片研究发现3-溴-7-硝基-indazole可阻断LTP的诱导。另外, 神经元中NO合酶诱导增加也可部分解释这些矛盾的结果。
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随着分子生物学技术的发展，人们可以从基因水平研究NO对LTP的影响。研制出了一种不表达神经元型NO合酶的小鼠，这种小鼠脑片的突触可塑性不受影响，其学习能力也不受影响。奇怪的是NO合酶抑制剂仍能影响脑片的LTP，不久又证明海马锥体细胞能表达内皮型NO合酶。神经元型NO合酶单独对LTP诱导或学习机制来说可能并不是关键的, 或可能表达更多的内皮型NO合酶来补偿神经元型NO合酶的功能。人们又开发出不表达内皮型NO合酶或既不表达神经元型NO合酶又不表达内皮型NO合酶的鼠品系, 结果表明不表达内皮型NO合酶的小鼠的LTP几乎不受影响, 而不表达内皮型和神经元型NO合酶的小鼠海马stratum radiatum区的LTP明显下降, 但stratum oriens区的LTP不受影响，这进一步证明stratum oriens区的LTP完全与NOS无关。基因敲除品系有许多明显的缺点, 神经系统在无敲除基因存在下发育，因此LTP的破坏可能是由于发育不全所致。例如, 线粒体ATP生成障碍的小鼠完成认知任务的能力也差。更好的是基因抑制(knock down)方法, 如使用反义mRNA来阻断某一特定酶的合成或使用一插入了能破坏传导通路的基因的载体。使用基因抑制技术的动物能在正常条件下生长发育，只是在开始实验时才抑制某一特定酶。已使用插入改变了的内皮型NO合酶基因的载体进行了实验，发现带有这种载体的海马脑片的LTP形成受到阻碍。此实验证明内皮型NO合酶对于LTP的诱导是必需的，而基因敲除方法发现内皮型NO合酶并不是LTP形成所必需的，同样用选择性试剂如1-(2-trifluoromethylphenyl)indazole(TRIM)急性阻断神经元型NO合酶也能阻断LTP, 而将神经元型NO合酶基因敲除并不影响LTP。理由可能是神经元没有时间来上调其它类型NO合酶的表达来补偿缺乏的内皮型NO合酶。这些结果也支持NO对突触可塑性是重要的。
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三、NO在学习和记忆中的作用
如果LTP是突触学习机制的模型, 那么阻断NO的产生应该影响动物的学习行为。确实在水迷宫实验中发现注射NO合酶抑制剂L-NAME或L-NARG可导致大鼠记忆缺失；在数天龄小鸡中L-NARG可破坏一次性被动回避反应的学习, 注入L-精氨酸能通过与L-NARG竞争NO合酶的结合位点来阻止其效应。实验也发现L-NARG能损害长时记忆的形成, 而且注射L-NAME或7-NI破坏空间工作记忆[8]。Bohme等[9]注射在以前研究中证明足以阻止LTP诱导剂量的L-NARG, 发现能破坏空间学习和气味学习, 但不影响电击回避学习, 他由此认为并不是所有形式的学习均是NO依赖的。另一研究[10]发现，L-NAME可能根本不破坏空间学习, 因为预先学习空间任务可阻止L-NAME诱导的学习破坏。可是, 近来研究发现水迷宫预训练能消除NMDA受体拮抗剂的作用。在水迷宫中, 预训可使动物获得诸如如何在池中游泳及决定方向的机会, 这有助于克服在主训期注射药物所带来的副作用。
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在解释行为实验结果时必须记住的另一重要方面是L-NAME有对抗乙酰胆碱M受体的特性, 而阻断ACh受体能破坏学习能力。另外, 非选择性NO合酶抑制剂对血压的影响也不应低估。为了避免这些问题, 使用不影响血压和ACh受体的NO抑制剂7-NI, 结果发现7-NI破坏一天龄小鸡学习被动回避反应能力。其它实验也发现7-NI破坏空间学习能力。
从以上实验结果可以看出, 有关NO在LTP中的作用仍存有争论, 但越来越多的证据表明NO参与某些区域LTP的形成, 但并不是所有部位的LTP均是NO依赖的, 可能其它一些逆行信使如CO、花生四烯酸和血小板活性因子等也参与LTP的形成，进一步研究逆行信使在LTP中的作用，对于阐明LTP的形成机制将具有重要作用。
参考文献
1，Arancio O， Kiebler M，Lee CJ, et al. Nitric oxide acts directly in the presynaptic neuron to produce long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Cell，1996, 87∶1025～1035.
, 百拇医药
2，Nei K，Matsuyama S，Shunt H，et al. NMDA receptor activation induces glutamate release through nitric oxide synthase in guinea pig dentate gyrus. Brain Res， 1996，728∶105～110.
3，Wu J，Wang Y，Rowan MJ，et al. Evidence for involvement of the neuronal isoform of nitric oxide synthase during induction of long-term potentiation and long-term depression in the rat dentate gyrus in vitro. Neurosci， 1997，78∶393～398.
4，Mizutani A，Saito H，Abe K. Involvement of nitric oxide in long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo. Brain Res, 1993，605∶309～311.
, 百拇医药
5，Musleh W, Yaghoubi S, Anwyl R. Effects of a nitric oxide synthase inhibitor on NMDA receptor function in organotypic hippocampal cultures. Brain Res, 1997, 770∶298～301.
6，Malen PL, Chapman PF. Nitric oxide facilitates long-term potentiation, but not long-term depression. J Neurosci, 1997, 17∶2645～51.
7，Kleppisch T, Pfeifer A, Klatt P, et al. Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of nitric oxide synthase. J Neurosci, 1999, 19∶48～55.
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8，Bernabeu R，de Stein ML, Fin C et al. Role of hippocampal NO in the acquisition and consolidation of inhibitory avoidance learning. Neuroreport, 1995，6∶1498～1500.
9，Bohme GA，Bon C，Lemaire M，et al. Altered synaptic plasticity and memory formation in nitric oxide synthase inhibitor-treated rats. Prog Natl Acad Sci U.S.A., 1993，90∶9191～9194.
10，Bannerman DM，Chapman PF，Kelly PAT，et al. Inhibition of nitric oxide synthase does not impair spatial learning. J Neurosci, 1994，14∶7404～7414., http://www.100md.com
单位：杨志华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)
关键词：长时程增强；一氧化氮；逆行性信使
生理科学进展000210 摘要 长时程增强(LTP)是神经突触可塑性和突触传递的一种表现形式，被认为是学习和记忆的细胞学基础，但有关LTP的形成机制仍存有争论。普遍认为LTP的维持需要逆行性信使的参与，本文就NO作为逆向信使以及其在LTP学习和记忆中的作用做了简要综述。
学科分类号 Q427
传统上认为化学神经传递是以顺行方向进行的, 即从突触前神经元传递到突触后神经元。近来大量的证据表明信号也可以逆行方向传递, 即从突触后神经元传递到突触前神经元, 并且认为这种逆行信号在海马的长时程增强(LTP)中起重要作用。能跨膜扩散的可溶性气体NO, 被认为在LTP中起逆行信使的作用, 本文拟就这方面的有关进展做一简要综述。
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一、NO作为逆向信使
在发现NO是神经递质之前, 有关LTP主要是由突触前机制还是突触后机制形成一直存在争论。实验发现诱导LTP能增加突触前递质的释放, 表明在突触后位点和突触前位点之间存在某种联系。参与LTP产生的逆行信使必须满足以下条件: (1) 必须由突触后神经元产生。已发现在海马突触后锥体细胞的胞体和树突存在NO合酶, Arancio等[1]发现突触后注入NO合酶抑制剂能阻断LTP的形成; (2) 必须能从突触后扩散到突触前, 并作用于突触前位点。研究发现在海马突触前存在NO敏感的鸟苷酸环化酶, 突触前注入NO释放剂能促进LTP形成, 注入NO吸收剂能阻断NO的这种作用, Nei等[2]证实NO能增加海马的递质释放; (3)作用部位必须十分有限, 以保证其作用的特异性。NO的半衰期很短, 保证了其作用的特异性。以上几点表明海马神经元突触后位点释放NO, 并作用于突触前部位。
二、NO参与LTP和长时程抑制(LTD)的诱导
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已有不少实验结果表明NO参与LTP的诱导和/或维持。脑片实验发现NO或NO释放剂均能促进LTP的形成。Wu等[3]证实NO合酶抑制剂1-(2-三氟甲基)咪唑和3-溴-7-硝基-indazole能抑制海马脑片齿状回的LTP和LTD， L-精氨酸可倒转这种抑制作用, 因为L-精氨酸能将抑制剂从NO合酶的L-精氨酸结合位点上置换下来。培养基中加入血红蛋白(可吸收NO)也可阻止LTP的诱导。血红蛋白不能被细胞吸收, 所以NO要起作用必须在细胞间运动。Mizutani等[4]在整体实验中也发现NO合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸、NG-甲基-L-精氨酸及NG-硝基-L-精氨酸甲酯能阻断海马齿状回LTP的诱导, L-精氨酸能倒转这种作用。有关NO的作用机制，Musleh 等[5]认为NO合酶抑制剂NG-甲基-L-精氨酸通过干扰NMDA受体的功能而抑制LTP的诱导, 但Malen等[6]的结果表明NO并不是通过作用于NMDA受体而促进LTP的诱导的，Kleppisch等[7]认为NO可能通过ADP核糖基化而诱导LTP。
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另一些实验不能证实NO合酶的抑制剂能阻止海马脑片LTP的形成, 或仅仅在某些特定条件下抑制LTP。Bannerman等在整体实验中也没有发现NO合酶抑制剂能抑制LTP的形成。结果的不一致可能与以下一些因素有关: (1)实验条件的不同。有人发现NO合酶抑制剂仅仅在室温下阻止海马脑片LTP的诱导(大多数以前的实验都是在此条件下进行的)，在更接近生理条件下(30℃)不能阻止LTP的诱导。(2)刺激条件的不同。海马脑片实验发现NO合成酶抑制剂不能阻断低强度高频刺激引起的LTP, 但可阻断高强度高频刺激诱发的LTP。另外的实验得到了相反的结果: 高频刺激诱发的LTP可被阻断, 而串配对脉冲(paired pulse)诱发的LTP不能被阻断, 这种刺激能诱发出更稳定的LTP; Haley等发现NO合酶抑制剂能抑制弱刺激诱发的LTP, 不能抑制强刺激诱发的LTP。在CA1区记录发现NO略为抑制低或中等强度刺激诱发的EPSPs, 而不能抑制高强度刺激引起的EPSPs, 这表明强刺激能掩盖NO的效应, 但当NO作用时间延长时, NO对低或中等强度刺激诱发的EPSPs的抑制作用消失, 强刺激能诱发出更大的EPSPs, 认为NO引起的基因转录可能参与这一效应。(3)脑片的不同。NO对LTP的影响似乎与脑片标本的状态及实验条件有关, 而且NO并不是存在于脑的所有部位。脑片实验已在海马Subarea stratum radiatum 发现与NO无关的LTP成分, 而Stratum oriens 的LTP大部分与NO合酶无关。NO合酶染色实验表明只有少量神经元表达NO合酶。因为LTP是通过记录场兴奋性突触后电位而得到的, 而记录到的场兴奋性突触后电位是许多神经元的场电位之和, 因此不同的结果可能是由于所记录亚群神经元中NO合酶表达不同所致。(4)NO合成酶抑制剂的不同。L-NAME对乙酰胆碱M-受体有拮抗作用, 并抑制内皮型NO合酶活性，因此影响血压和脑血流。Nitroindazole(7-NI)在中等浓度时不影响血压，但可抑制神经元型NO合酶的活性, 在体研究发现7-NI能完全阻断CA1区的LTP, 脑片研究发现3-溴-7-硝基-indazole可阻断LTP的诱导。另外, 神经元中NO合酶诱导增加也可部分解释这些矛盾的结果。
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随着分子生物学技术的发展，人们可以从基因水平研究NO对LTP的影响。研制出了一种不表达神经元型NO合酶的小鼠，这种小鼠脑片的突触可塑性不受影响，其学习能力也不受影响。奇怪的是NO合酶抑制剂仍能影响脑片的LTP，不久又证明海马锥体细胞能表达内皮型NO合酶。神经元型NO合酶单独对LTP诱导或学习机制来说可能并不是关键的, 或可能表达更多的内皮型NO合酶来补偿神经元型NO合酶的功能。人们又开发出不表达内皮型NO合酶或既不表达神经元型NO合酶又不表达内皮型NO合酶的鼠品系, 结果表明不表达内皮型NO合酶的小鼠的LTP几乎不受影响, 而不表达内皮型和神经元型NO合酶的小鼠海马stratum radiatum区的LTP明显下降, 但stratum oriens区的LTP不受影响，这进一步证明stratum oriens区的LTP完全与NOS无关。基因敲除品系有许多明显的缺点, 神经系统在无敲除基因存在下发育，因此LTP的破坏可能是由于发育不全所致。例如, 线粒体ATP生成障碍的小鼠完成认知任务的能力也差。更好的是基因抑制(knock down)方法, 如使用反义mRNA来阻断某一特定酶的合成或使用一插入了能破坏传导通路的基因的载体。使用基因抑制技术的动物能在正常条件下生长发育，只是在开始实验时才抑制某一特定酶。已使用插入改变了的内皮型NO合酶基因的载体进行了实验，发现带有这种载体的海马脑片的LTP形成受到阻碍。此实验证明内皮型NO合酶对于LTP的诱导是必需的，而基因敲除方法发现内皮型NO合酶并不是LTP形成所必需的，同样用选择性试剂如1-(2-trifluoromethylphenyl)indazole(TRIM)急性阻断神经元型NO合酶也能阻断LTP, 而将神经元型NO合酶基因敲除并不影响LTP。理由可能是神经元没有时间来上调其它类型NO合酶的表达来补偿缺乏的内皮型NO合酶。这些结果也支持NO对突触可塑性是重要的。
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三、NO在学习和记忆中的作用
如果LTP是突触学习机制的模型, 那么阻断NO的产生应该影响动物的学习行为。确实在水迷宫实验中发现注射NO合酶抑制剂L-NAME或L-NARG可导致大鼠记忆缺失；在数天龄小鸡中L-NARG可破坏一次性被动回避反应的学习, 注入L-精氨酸能通过与L-NARG竞争NO合酶的结合位点来阻止其效应。实验也发现L-NARG能损害长时记忆的形成, 而且注射L-NAME或7-NI破坏空间工作记忆[8]。Bohme等[9]注射在以前研究中证明足以阻止LTP诱导剂量的L-NARG, 发现能破坏空间学习和气味学习, 但不影响电击回避学习, 他由此认为并不是所有形式的学习均是NO依赖的。另一研究[10]发现，L-NAME可能根本不破坏空间学习, 因为预先学习空间任务可阻止L-NAME诱导的学习破坏。可是, 近来研究发现水迷宫预训练能消除NMDA受体拮抗剂的作用。在水迷宫中, 预训可使动物获得诸如如何在池中游泳及决定方向的机会, 这有助于克服在主训期注射药物所带来的副作用。
, 百拇医药
在解释行为实验结果时必须记住的另一重要方面是L-NAME有对抗乙酰胆碱M受体的特性, 而阻断ACh受体能破坏学习能力。另外, 非选择性NO合酶抑制剂对血压的影响也不应低估。为了避免这些问题, 使用不影响血压和ACh受体的NO抑制剂7-NI, 结果发现7-NI破坏一天龄小鸡学习被动回避反应能力。其它实验也发现7-NI破坏空间学习能力。
从以上实验结果可以看出, 有关NO在LTP中的作用仍存有争论, 但越来越多的证据表明NO参与某些区域LTP的形成, 但并不是所有部位的LTP均是NO依赖的, 可能其它一些逆行信使如CO、花生四烯酸和血小板活性因子等也参与LTP的形成，进一步研究逆行信使在LTP中的作用，对于阐明LTP的形成机制将具有重要作用。
参考文献
1，Arancio O， Kiebler M，Lee CJ, et al. Nitric oxide acts directly in the presynaptic neuron to produce long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Cell，1996, 87∶1025～1035.
, 百拇医药
2，Nei K，Matsuyama S，Shunt H，et al. NMDA receptor activation induces glutamate release through nitric oxide synthase in guinea pig dentate gyrus. Brain Res， 1996，728∶105～110.
3，Wu J，Wang Y，Rowan MJ，et al. Evidence for involvement of the neuronal isoform of nitric oxide synthase during induction of long-term potentiation and long-term depression in the rat dentate gyrus in vitro. Neurosci， 1997，78∶393～398.
4，Mizutani A，Saito H，Abe K. Involvement of nitric oxide in long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo. Brain Res, 1993，605∶309～311.
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5，Musleh W, Yaghoubi S, Anwyl R. Effects of a nitric oxide synthase inhibitor on NMDA receptor function in organotypic hippocampal cultures. Brain Res, 1997, 770∶298～301.
6，Malen PL, Chapman PF. Nitric oxide facilitates long-term potentiation, but not long-term depression. J Neurosci, 1997, 17∶2645～51.
7，Kleppisch T, Pfeifer A, Klatt P, et al. Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of nitric oxide synthase. J Neurosci, 1999, 19∶48～55.
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8，Bernabeu R，de Stein ML, Fin C et al. Role of hippocampal NO in the acquisition and consolidation of inhibitory avoidance learning. Neuroreport, 1995，6∶1498～1500.
9，Bohme GA，Bon C，Lemaire M，et al. Altered synaptic plasticity and memory formation in nitric oxide synthase inhibitor-treated rats. Prog Natl Acad Sci U.S.A., 1993，90∶9191～9194.
10，Bannerman DM，Chapman PF，Kelly PAT，et al. Inhibition of nitric oxide synthase does not impair spatial learning. J Neurosci, 1994，14∶7404～7414., http://www.100md.com