睫状神经营养因子对应激引起大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制的研究
作者：严进
单位：严进(第二军医大学基础医学部神经生物学教研室，上海200433)
关键词：应激；睫状神经营养因子；海马神经元；形态学；信号转导
生理科学进展000208 摘要 本实验用Nissl染色法、Bielschowsky-Gros-Lawrentjew染色法、常规透射电镜、行为活动测定、双侧海马微量给药、海马神经元原代培养、活细胞连续照相、全细胞膜片钳记录、细胞内游离Ca2+浓度测定及P53蛋白免疫组化测定等方法，观察了睫状神经营养因子(CNTF)对应激引起动物行为变化和海马神经元形态学变化的影响，探讨了CNTF的部分作用机制。结果表明，急性应激不引起大鼠海马神经元损伤，CNTF不能改善急性应激时的焦虑样行为。但CNTF可显著减轻慢性应激引起的大鼠海马神经元损伤，并改善慢性应激时的抑郁样行为。CNTF可能通过早期快速抑制谷氨酸(Glu)膜电流、胞内游离钙([Ca2+]i)的升高，以及后期核内效应，发挥其保护神经元的作用，从而改善应激引起的抑郁样行为障碍。
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学科分类号 Q189
Protective Effect of Ciliary Neurotrophic Factor on the Hippocampal Neuronal Damage Induced by Stress and Its Mechanisms in Rats
YAN Jin
(Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Effect of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on behavior and morphology of hippocampal neurons were observed and its mechanisms in rats were explored by Nissl staining, Bielschowsky-Gros-Lawrentjew staining, transmission electron microscopy, behavior determination, primary culture of hippocampal neuron, running photography of living cell, whole-cell patch clamp recording, detection of intracellular free Ca2+ and immunohistochemical detection of P53 protein. The results showed that there was no statistically significant change in the morphology of hippocampal neurons as a result of acute stress. The behavioral activity was increased during acute stress stage, which was not affected by CNTF. In chronic stress stage, neuronal damage in hippocampus was significant, and behavioral activity was significantly decreased under basal line. Administration of CNTF into bilateral hippocampus prevented neurons from damage and improved behavior. In vitro, CNTF could significantly suppress channel current, intracellular Ca2+ content and the expression of P53 protein in the nucleus induced by glutamate. The results suggested that the protective effect of CNTF may involve rapid effects on cell membrane and cytoplasma, and delayed effects on nucleus, thereby improve behavioral defects.
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Key words Stress; Ciliary neurotrophic factor; Hippocampal neuron; Morphology; Signal transduction
不同的实验室曾报道，应激或应激水平的糖皮质激素可引起中枢神经元损伤或丢失[1～6]。应激反应中的神经元损伤，既是诸多应激反应的结果，也是许多继发反应的原因。对应激反应的中枢机制中这一重要环节进行研究，有可能对部分应激性障碍的防治提供新的参考意见。由于糖皮质激素受体拮抗剂的作用复杂，因此其对应激引起的中枢神经元损伤的作用不被关注。已发现应激时易损脑区的谷氨酸持续在高水平[7，8]，并认为这是应激时神经元损伤的重要因素之一。虽然已有报道某些谷氨酸受体拮抗剂可以改善应激引起的行为障碍，但其安全范围小，副作用大，因此应用前景渺茫。神经营养因子对神经细胞具有保护作用。CNTF不同于其它神经营养因子的特点有：CNTF基因转录起始点(tsp)上游有与应激关系密切的Jun和Fos家族的二聚体结合位点5’-TGAGTCA;在海马，无神经生长因子(NGF)受体，但CNTF受体分布较多[9]；CNTF的血-神经屏障的表面系数渗透率约为NGF的7倍[10]。本实验针对应激反应中的神经元损伤这一重要环节，应用多种实验方法，观察并探讨了CNTF对应激引起大鼠海马神经元损伤的作用及其可能的机制。结果如下：
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一、应激对大鼠open field行为的影响
在足底电击应激模型中，急性应激时大鼠行为活动增加，呈焦虑样；慢性应激时大鼠行为活动减少，呈抑郁样。
二、应激大鼠的海马神经元形态变化
(一)光镜 Nissl染色结果显示，急性应激时海马各区神经元无显著性变化，慢性应激可见海马CA1、CA3区神经元尼氏体减少，CA1区变化大于CA3区，神经细胞数量减少，排列松散。Bieshowsky-Gros-Lawrentijew染色结果显示，海马CA3、CA1区不仅细胞排列松散，而且细胞突起减少，神经纤维紊乱，与邻周细胞间联系减少。
(二)常规透射电镜 慢性应激大鼠海马神经细胞内线粒体减少、嵴紊乱、扩大、出现空泡，粗面内质网减少，高尔基体囊泡扩大，溶酶体增多，出现脂褐质，嗜锇性增强。细胞核膜皱折内陷加深；核异染色质增多，核仁增大。
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三、CNTF对应激大鼠行为和海马神经元形态的作用
应激前2天每天双侧海马给予CNTF(100～1000nU/μl，1μl×2)后，无应激和急性应激组动物的行为无显著改变，而慢性应激大鼠的运动活性和探究行为都有显著改善(500，1000nU/μl)，相应地，光镜、电镜结果表明，CNTF对慢性应激大鼠海马神经元的损害也有显著改善。
四、CNTF保护海马神经元形态的部分作用机制的探讨
已有不同实验室发现应激时海马的谷氨酸持续在高水平[7，8]，并认为这是应激时神经元损伤的重要因素之一。以下实验将探讨CNTF保护海马神经元抵抗Glu伤害的作用机制。
(一)给予原代培养海马神经元不同剂量的Glu，连续跟踪观察发现，海马神经元的损伤与Glu呈剂量依赖性，而CNTF减弱Glu对海马神经元的损伤也呈剂量依赖性。
, 百拇医药
(二)全细胞膜片钳记录了海马神经细胞的静息膜电位(-42±11mV,n=40)。将膜电位钳制在不同的电压水平，间隔给予Glu(200μmol/L)，可诱发不同的电流。从全细胞的Ⅰ～Ⅴ关系可以看出，IGlu在钳制电压(Vh)为正值时呈外向电流，而Vh为负值时呈内向电流。细胞外单独给予CNTF(100～1000nU/μl)对静息膜电导及电压门控离子通道无影响，而孵育5min后再灌流Glu，IGlu明显被抑制。用G蛋白抑制剂PTX(100ng/ml)孵育24h后，重复上述实验，CNTF的抑制作用减弱非常显著，表明CNTF抑制Glu诱发的海马神经元全细胞通道电流，主要与PTX敏感的G蛋白的活化有关。
(三)CNTF可显著减弱Glu引起的海马神经细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高。给予不同浓度的Glu后发现，[Ca2+]i在10s内迅速升高并呈剂量依赖性。给予不同剂量的CNTF，对Glu(200μmol/L)引起的[Ca2+]i升高有抑制效应，并呈剂量依赖性；而单独给予少于1000nU/μl剂量的CNTF时，对[Ca2+]i无显著性影响。
, 百拇医药
(四)CNTF在海马神经细胞内的信号转导途径
1.PTX孵育海马神经细胞24h后给予Glu(200μmol/L)，用CNTF(500nU/μl)孵育5min后给予Glu(200μmol/L)及PTX孵育24h后再经CNTF孵育5min后给予Glu(200μmol/L)，分别测定[Ca2+]i。结果表明，抑制G蛋白活化后，CNTF抑制Glu引起[Ca2+]i升高的效应也非常显著地被减弱。与全细胞膜片钳结果相联系，提示CNTF可能通过G蛋白调制Glu离子型通道功能，进而影响[Ca2+]i。由于实验条件限制，尚不能在同一细胞同时记录全细胞膜片钳电流、测定[Ca2+]i，因此这一推论尚待进一步证实。
2.用PKC抑制剂(CHE)和激动剂(PMA)阻断或激活PKC后，没有观察到对CNTF抑制Glu升高海马神经元[Ca2+]i的效应有显著性影响。提示PKC在CNTF抑制Glu升高海马神经元[Ca2+]i的过程中不起主要作用。
, 百拇医药
3.用EGTA将细胞外Ca2+耗竭，排除外Ca2+影响，然后给予内质网膜Ca2+依赖ATP酶(钙泵)的抑制剂Thapsigargin，测得[Ca2+]i快速升高。当用CNTF(500nU/μl)孵育5min后，再重复上述实验，[Ca2+]i升高的值显著减少。提示CNTF可部分拮抗Thapsigargin抑制内质网膜钙泵的功能，使胞质Ca2+进入胞内Ca2+库。
4.给予Glu (200μmol/L,0、1、2、4h)后，P53蛋白表达呈时间依赖性增加。用CNTF(500nU/μl)孵育5min后，再给予Glu(200μmol/L)，P53蛋白表达减弱。单独给予CNTF不影响P53蛋白表达。提示CNTF抑制Glu诱导的细胞核内P53蛋白的表达。
综上所述，慢性应激可以引起海马神经元损伤，适宜浓度的CNTF可以保护海马神经元，从而改善慢性应激引起的抑郁样行为。CNTF保护海马神经元免受Glu伤害的细胞膜-细胞质-细胞核的信号转导途径可能有：CNTF通过G蛋白抑制Glu诱发的全细胞膜电流，同时通过G蛋白抑制Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度升高，并激活内质网膜Ca2+依赖ATP酶(钙泵)，促进胞质内游离Ca2+进入内质网。胞质内游离Ca2+的减少，使Glu诱导的细胞核内P53蛋白表达显著减弱，从而使Glu引起海马神经细胞损伤的作用减弱。PKC在CNTF对Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度升高的抑制过程中，不起显著作用。
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(感谢第二军医大学陈宜张院士、王春安教授、王成海教授、何成博士,中科院上海脑研究所鲍璇研究员,中科院北京发育生物学研究所孙方臻研究员,军事医学科学院毒理药理研究所罗质璞教授的指导及所提供的实验条件)
国家自然科学基金(39670259)、军队医药卫生科研基金(96M077、98M079)资助课题
严进，男，神经生物学专业。导师：路长林教授。论文答辩日期：1998年4月26日，答辩委员会主席：梅镇彤教授。
参考文献
1，Uno H, Tarara R, Else JG, et al. Hippocampal damage associated with prolonged and fatal stress in primates. J Neurosci, 1989, 9∶1705～1711.
, 百拇医药
2，严进，王春安，陈宜张，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影响.心理学报，1991，23∶418～425.
3，王旭民，严进，陈坚，等.血浆糖皮质激素升高条件下海马神经元的形态变化.解剖学杂志，1991，14∶330～333.
4，Watanabe Y, Gould E, McEwen BS. Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons. Brain Res, 1992, 588∶341～345.
5，Smith MA. Hippocampal vulnerability to stress and aging. Behavioral Brain Res, 1996, 78∶25～29.
, http://www.100md.com 6，Markowitsch HJ, Kessler J, Van-Der-Ven C,et al. Psychic trauma causing grossly reduced brain metabolism and cognitive deterioration. Neuropsychologia, 1998, 36∶77～81.
7，Moghaddam B, Bolinao ML, Stein-Behrens B, et al. Glucocorticoids mediate the stress-induced extracellular accumulation of glutamate. Brain Res, 1994, 655∶251～254.
8，严进，王春安，陈宜张，等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响.心理学报，1995，27∶422～427.
9，Watanabe D, Yoshimura R, Khalil M, et al. Characteristic localization of gp130 (the signal-transducing receptor component used in common for IL-6/IL-111/CNTF/LIF/OSM) in the rat brain. Eur J Neurosci, 1996, 8∶1630～1640.
10，Podus JF, Curran GL. Permeability at the blood-brain and blood-nerve barriers of the neurotrophic factors: NGF, CNTF, NT-3, BDNF. Mol Brain Res, 1996, 36∶280～286., http://www.100md.com
单位：严进(第二军医大学基础医学部神经生物学教研室，上海200433)
关键词：应激；睫状神经营养因子；海马神经元；形态学；信号转导
生理科学进展000208 摘要 本实验用Nissl染色法、Bielschowsky-Gros-Lawrentjew染色法、常规透射电镜、行为活动测定、双侧海马微量给药、海马神经元原代培养、活细胞连续照相、全细胞膜片钳记录、细胞内游离Ca2+浓度测定及P53蛋白免疫组化测定等方法，观察了睫状神经营养因子(CNTF)对应激引起动物行为变化和海马神经元形态学变化的影响，探讨了CNTF的部分作用机制。结果表明，急性应激不引起大鼠海马神经元损伤，CNTF不能改善急性应激时的焦虑样行为。但CNTF可显著减轻慢性应激引起的大鼠海马神经元损伤，并改善慢性应激时的抑郁样行为。CNTF可能通过早期快速抑制谷氨酸(Glu)膜电流、胞内游离钙([Ca2+]i)的升高，以及后期核内效应，发挥其保护神经元的作用，从而改善应激引起的抑郁样行为障碍。
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学科分类号 Q189
Protective Effect of Ciliary Neurotrophic Factor on the Hippocampal Neuronal Damage Induced by Stress and Its Mechanisms in Rats
YAN Jin
(Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Effect of ciliary neurotrophic factor (CNTF) on behavior and morphology of hippocampal neurons were observed and its mechanisms in rats were explored by Nissl staining, Bielschowsky-Gros-Lawrentjew staining, transmission electron microscopy, behavior determination, primary culture of hippocampal neuron, running photography of living cell, whole-cell patch clamp recording, detection of intracellular free Ca2+ and immunohistochemical detection of P53 protein. The results showed that there was no statistically significant change in the morphology of hippocampal neurons as a result of acute stress. The behavioral activity was increased during acute stress stage, which was not affected by CNTF. In chronic stress stage, neuronal damage in hippocampus was significant, and behavioral activity was significantly decreased under basal line. Administration of CNTF into bilateral hippocampus prevented neurons from damage and improved behavior. In vitro, CNTF could significantly suppress channel current, intracellular Ca2+ content and the expression of P53 protein in the nucleus induced by glutamate. The results suggested that the protective effect of CNTF may involve rapid effects on cell membrane and cytoplasma, and delayed effects on nucleus, thereby improve behavioral defects.
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Key words Stress; Ciliary neurotrophic factor; Hippocampal neuron; Morphology; Signal transduction
不同的实验室曾报道，应激或应激水平的糖皮质激素可引起中枢神经元损伤或丢失[1～6]。应激反应中的神经元损伤，既是诸多应激反应的结果，也是许多继发反应的原因。对应激反应的中枢机制中这一重要环节进行研究，有可能对部分应激性障碍的防治提供新的参考意见。由于糖皮质激素受体拮抗剂的作用复杂，因此其对应激引起的中枢神经元损伤的作用不被关注。已发现应激时易损脑区的谷氨酸持续在高水平[7，8]，并认为这是应激时神经元损伤的重要因素之一。虽然已有报道某些谷氨酸受体拮抗剂可以改善应激引起的行为障碍，但其安全范围小，副作用大，因此应用前景渺茫。神经营养因子对神经细胞具有保护作用。CNTF不同于其它神经营养因子的特点有：CNTF基因转录起始点(tsp)上游有与应激关系密切的Jun和Fos家族的二聚体结合位点5’-TGAGTCA;在海马，无神经生长因子(NGF)受体，但CNTF受体分布较多[9]；CNTF的血-神经屏障的表面系数渗透率约为NGF的7倍[10]。本实验针对应激反应中的神经元损伤这一重要环节，应用多种实验方法，观察并探讨了CNTF对应激引起大鼠海马神经元损伤的作用及其可能的机制。结果如下：
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一、应激对大鼠open field行为的影响
在足底电击应激模型中，急性应激时大鼠行为活动增加，呈焦虑样；慢性应激时大鼠行为活动减少，呈抑郁样。
二、应激大鼠的海马神经元形态变化
(一)光镜 Nissl染色结果显示，急性应激时海马各区神经元无显著性变化，慢性应激可见海马CA1、CA3区神经元尼氏体减少，CA1区变化大于CA3区，神经细胞数量减少，排列松散。Bieshowsky-Gros-Lawrentijew染色结果显示，海马CA3、CA1区不仅细胞排列松散，而且细胞突起减少，神经纤维紊乱，与邻周细胞间联系减少。
(二)常规透射电镜 慢性应激大鼠海马神经细胞内线粒体减少、嵴紊乱、扩大、出现空泡，粗面内质网减少，高尔基体囊泡扩大，溶酶体增多，出现脂褐质，嗜锇性增强。细胞核膜皱折内陷加深；核异染色质增多，核仁增大。
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三、CNTF对应激大鼠行为和海马神经元形态的作用
应激前2天每天双侧海马给予CNTF(100～1000nU/μl，1μl×2)后，无应激和急性应激组动物的行为无显著改变，而慢性应激大鼠的运动活性和探究行为都有显著改善(500，1000nU/μl)，相应地，光镜、电镜结果表明，CNTF对慢性应激大鼠海马神经元的损害也有显著改善。
四、CNTF保护海马神经元形态的部分作用机制的探讨
已有不同实验室发现应激时海马的谷氨酸持续在高水平[7，8]，并认为这是应激时神经元损伤的重要因素之一。以下实验将探讨CNTF保护海马神经元抵抗Glu伤害的作用机制。
(一)给予原代培养海马神经元不同剂量的Glu，连续跟踪观察发现，海马神经元的损伤与Glu呈剂量依赖性，而CNTF减弱Glu对海马神经元的损伤也呈剂量依赖性。
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(二)全细胞膜片钳记录了海马神经细胞的静息膜电位(-42±11mV,n=40)。将膜电位钳制在不同的电压水平，间隔给予Glu(200μmol/L)，可诱发不同的电流。从全细胞的Ⅰ～Ⅴ关系可以看出，IGlu在钳制电压(Vh)为正值时呈外向电流，而Vh为负值时呈内向电流。细胞外单独给予CNTF(100～1000nU/μl)对静息膜电导及电压门控离子通道无影响，而孵育5min后再灌流Glu，IGlu明显被抑制。用G蛋白抑制剂PTX(100ng/ml)孵育24h后，重复上述实验，CNTF的抑制作用减弱非常显著，表明CNTF抑制Glu诱发的海马神经元全细胞通道电流，主要与PTX敏感的G蛋白的活化有关。
(三)CNTF可显著减弱Glu引起的海马神经细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高。给予不同浓度的Glu后发现，[Ca2+]i在10s内迅速升高并呈剂量依赖性。给予不同剂量的CNTF，对Glu(200μmol/L)引起的[Ca2+]i升高有抑制效应，并呈剂量依赖性；而单独给予少于1000nU/μl剂量的CNTF时，对[Ca2+]i无显著性影响。
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(四)CNTF在海马神经细胞内的信号转导途径
1.PTX孵育海马神经细胞24h后给予Glu(200μmol/L)，用CNTF(500nU/μl)孵育5min后给予Glu(200μmol/L)及PTX孵育24h后再经CNTF孵育5min后给予Glu(200μmol/L)，分别测定[Ca2+]i。结果表明，抑制G蛋白活化后，CNTF抑制Glu引起[Ca2+]i升高的效应也非常显著地被减弱。与全细胞膜片钳结果相联系，提示CNTF可能通过G蛋白调制Glu离子型通道功能，进而影响[Ca2+]i。由于实验条件限制，尚不能在同一细胞同时记录全细胞膜片钳电流、测定[Ca2+]i，因此这一推论尚待进一步证实。
2.用PKC抑制剂(CHE)和激动剂(PMA)阻断或激活PKC后，没有观察到对CNTF抑制Glu升高海马神经元[Ca2+]i的效应有显著性影响。提示PKC在CNTF抑制Glu升高海马神经元[Ca2+]i的过程中不起主要作用。
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3.用EGTA将细胞外Ca2+耗竭，排除外Ca2+影响，然后给予内质网膜Ca2+依赖ATP酶(钙泵)的抑制剂Thapsigargin，测得[Ca2+]i快速升高。当用CNTF(500nU/μl)孵育5min后，再重复上述实验，[Ca2+]i升高的值显著减少。提示CNTF可部分拮抗Thapsigargin抑制内质网膜钙泵的功能，使胞质Ca2+进入胞内Ca2+库。
4.给予Glu (200μmol/L,0、1、2、4h)后，P53蛋白表达呈时间依赖性增加。用CNTF(500nU/μl)孵育5min后，再给予Glu(200μmol/L)，P53蛋白表达减弱。单独给予CNTF不影响P53蛋白表达。提示CNTF抑制Glu诱导的细胞核内P53蛋白的表达。
综上所述，慢性应激可以引起海马神经元损伤，适宜浓度的CNTF可以保护海马神经元，从而改善慢性应激引起的抑郁样行为。CNTF保护海马神经元免受Glu伤害的细胞膜-细胞质-细胞核的信号转导途径可能有：CNTF通过G蛋白抑制Glu诱发的全细胞膜电流，同时通过G蛋白抑制Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度升高，并激活内质网膜Ca2+依赖ATP酶(钙泵)，促进胞质内游离Ca2+进入内质网。胞质内游离Ca2+的减少，使Glu诱导的细胞核内P53蛋白表达显著减弱，从而使Glu引起海马神经细胞损伤的作用减弱。PKC在CNTF对Glu引起的细胞内游离Ca2+浓度升高的抑制过程中，不起显著作用。
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(感谢第二军医大学陈宜张院士、王春安教授、王成海教授、何成博士,中科院上海脑研究所鲍璇研究员,中科院北京发育生物学研究所孙方臻研究员,军事医学科学院毒理药理研究所罗质璞教授的指导及所提供的实验条件)
国家自然科学基金(39670259)、军队医药卫生科研基金(96M077、98M079)资助课题
严进，男，神经生物学专业。导师：路长林教授。论文答辩日期：1998年4月26日，答辩委员会主席：梅镇彤教授。
参考文献
1，Uno H, Tarara R, Else JG, et al. Hippocampal damage associated with prolonged and fatal stress in primates. J Neurosci, 1989, 9∶1705～1711.
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2，严进，王春安，陈宜张，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影响.心理学报，1991，23∶418～425.
3，王旭民，严进，陈坚，等.血浆糖皮质激素升高条件下海马神经元的形态变化.解剖学杂志，1991，14∶330～333.
4，Watanabe Y, Gould E, McEwen BS. Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons. Brain Res, 1992, 588∶341～345.
5，Smith MA. Hippocampal vulnerability to stress and aging. Behavioral Brain Res, 1996, 78∶25～29.
, http://www.100md.com 6，Markowitsch HJ, Kessler J, Van-Der-Ven C,et al. Psychic trauma causing grossly reduced brain metabolism and cognitive deterioration. Neuropsychologia, 1998, 36∶77～81.
7，Moghaddam B, Bolinao ML, Stein-Behrens B, et al. Glucocorticoids mediate the stress-induced extracellular accumulation of glutamate. Brain Res, 1994, 655∶251～254.
8，严进，王春安，陈宜张，等.应激对大鼠行为和部分脑区谷氨酸含量的影响.心理学报，1995，27∶422～427.
9，Watanabe D, Yoshimura R, Khalil M, et al. Characteristic localization of gp130 (the signal-transducing receptor component used in common for IL-6/IL-111/CNTF/LIF/OSM) in the rat brain. Eur J Neurosci, 1996, 8∶1630～1640.
10，Podus JF, Curran GL. Permeability at the blood-brain and blood-nerve barriers of the neurotrophic factors: NGF, CNTF, NT-3, BDNF. Mol Brain Res, 1996, 36∶280～286., http://www.100md.com