丙型肝炎病毒核心基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答
作者：谭德明 刘双虎 李聪智 范学工 燕美玉 孙科柱
单位：谭德明(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；刘双虎(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；李聪智(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；范学工(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；燕美玉(湖南医科大学免疫教研室， 湖南410078)；孙科柱(湖南医科大学免疫教研室， 湖南410078)
关键词：丙型肝炎病毒;基因疫苗;小白鼠
基础医学与临床000512
摘要：为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响，本文将HCV核心区基因定向克隆于质粒pcDNA3巨细胞病毒启动子下游，构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗pcDNA3-HCV，将此疫苗通过多点肌肉注射免疫BALB/C小鼠，结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗-HCV IgG阳性，其抗体水平明显高于对照组，同时Th1免疫应答相关的细胞因子IL-2及g干扰素水平也明显高于对照组，其结果表明，HCV核心基因疫苗能诱导BACB/L小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。
, http://www.100md.com
中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)05-0041-02
V specific cellular and humoral immune responses induced by intramuscular
injection of DNA vaccine containing HCV core gene in mice
TAN De-ming，LIU Shuang-hu，LI Cong-zhi，et al
(Department of Infectious Diseases，Xiang-Ya Hospital，Hunan Medical University，Changsha，Hunan，410008，China)
, 百拇医药
Abstract: The aim of the study is to know that HCV DNA vaccine could induce the cellular and humoral immunity in mice or not. The pcDNA3-HCV，in which the core gene sequences of HCV were inserted into downstream of CMV promoter in pcDNA3，were injected intramuscularly into BALB/C mice.The results showed that the serum anti-HCV were detected in all of the pcDNA3-HCV immunized mice，but none in control mice.TH1 cytokines，such as interleukine 2 and interferon gamma， were significantly higher in pcDNA3-HCV immunized mice than that in controls. It was indicated that the good responses of cellular and humoral immunity can be induced by injection of pcDNA3-HCV in BACB/C mice.，in which the core gene sequences of HCV were inserted into downstream of CMV promoter in pcDNA3，were injected intramuscularly into BALB/C mice.The results showed that the serum anti-HCV were detected in all of the pcDNA3-HCV immunized mice，but none in control mice.TH1 cytokines，such as interleukine 2 and interferon gamma， were significantly higher in pcDNA3-HCV immunized mice than that in controls. It was indicated that the good responses of cellular and humoral immunity can be induced by injection of pcDNA3-HCV in BACB/C mice.
, 百拇医药
Key words ：HCV; DNA vaccine; BALB/C mouse
丙型肝炎病毒(HCV)感染是我国慢性病毒性肝炎的主要病原之一，可导致肝硬化及肝癌等严重后果。目前尚无有效的方法预防HCV感染。近来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫应答，特别是诱导细胞免疫应答的能力优于蛋白多肽类疫苗，更适应于易于变异的慢性病毒感染的预防与治疗[1～3]。为了探讨应用HCV基因疫苗预防HCV感染的可能性，本文构建了HCV&127;核心区基因疫苗，并观察了该疫苗经肌肉注射法接种BALB/C小鼠后的细胞及体液免疫功能的变化。
1. 材料与方法
1.1 pcDNA3-HCV的构建及鉴定
HCV核心基因为本研究所克隆[4]，所用载体为pUC19质粒。将此重组质粒中的HCV核心区基因用EcoR V及Hind 双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收和纯化HCV核心基因片段(Wizard DNA Clean UP System，购于Promega公司)后，定向克隆于已预先用同样方法处理的真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游，称之为pcDNA3-HCV，该重组质粒即为HCV核心区基因疫苗，经Hind 和EcoR V双酶 切电泳分析及PCR方法鉴定，确定pcDNA3-HCV中确有HCV核心基因片段。
, 百拇医药
1.2 pcDNA3-HCV大量制备
pcDNA3-HCV转化到大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，按碱裂解方法提取质粒，纯化后通过紫外分光光度计测定其浓度，按2g/L溶于无菌PBS，-20℃保存备用。
1.3基因疫苗的免疫接种
选用4～6周龄的BALB/C小白鼠，分为实验组与对照组。实验组(N=5)注射pcDNA3-HCV,用1mL注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，每次每只总量200mg，2周及4周后各追加免疫一次。对照组(n=5)按实验组相同的方法注射pcDNA3空质粒。末次注射2周后处理动物，去眼球采血至死，无菌取脾脏(处理见后)。采取的血液经分离血清后，取血清-20℃保存备用。
1.4 体液免疫功能测定
将HCV核心抗原(美国Chiron公司惠赠)包被于酶标板，1%BSA封闭后4℃备用，将小鼠血清用样本稀释液按1:20比例稀释，每孔100mL加于上述酶标板中，37℃，30min，加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(武汉博士德公司)100mL(1:15000)，37℃，30min，PBS洗涤后，加入底物，37℃，10min，终止反应后用酶标仪测定A值。
, 百拇医药
1.5 细胞免疫功能测定
无菌取脾脏后，用100目钢网研磨，低渗破坏红细胞，调细胞浓度到5×106/mL，放于24孔培养板内，每孔1mL，再加入ConA(终浓度为20mg/ml)，37℃，5% CO2培养48h，经2000r/min离心20min收集 上清液，即为白细胞介素Ⅱ(IL-2)及g干扰素(IFNg)的待测样品，-20℃保存待测。
1.5.1 IL-2测定：以本研究所的方法为基础，并参照丁桂风[5]的方法，IL-2活性以剌激指数(SI)表示：
1.5.2 IFNr测定：根据文献[6]采用病变抑制法，IFN活性以U/mL表示。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
采用t检验。
2 结果
经pcDNA3-HCV免疫后的小鼠血清抗HCV均呈阳性，其A值明显高于对照组小鼠血清。 脾淋巴细胞产生IL-2和IFNg的能力也以实验组明显高于对照组(表1)。
表1 小鼠血清抗HCV 和脾淋巴细胞产生IL-2
和IFNγ 的能力比较
Table 1 Serum anti-HCV level and IL-2 &IFN produced
by spleen cells in pcDNA3-HCV immunized BALB/C mice,as compared with the controls (
±s n=5)
, 百拇医药
Anti-HCV(Avalue)
IL-2(SI)
IFN(U/mL)
pcDNA3group
0.11±0.03
58.70±34.10
54.32±34.18
pcDNA3-HCVgroup
0.58±0.36*
173.93±58.54**
246.56±110.24*
, 百拇医药
3 讨论
本文以HCV核心蛋白基因作为免疫基因，通过修饰后，将其克隆到高效表达质粒pcDNA3中，该质粒带有巨细胞病毒启动子，可保证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。实验结果显示，本文构建的基因疫苗pcDNA3-HCV免疫小鼠6周后，实验组5只小鼠均出现了体液免疫应答，产生了较高效价的抗HCV核心蛋白抗体，说明基因疫苗能在小鼠体细胞内表达HCV核心抗原，从而刺激小鼠产生抗HCV，而注射pcDNA3的小鼠不能产生抗HCV，仅有较低的非特异性反应，二者结果差异有显著性。pcDNA3-HCV基因疫苗免疫小鼠后，除能诱导产生抗HCV外还能引起较强的细胞免疫应答，表现为IL-2及IFNg水平明显增高，与只注射pcDNA3的对照组差异有显著性。IL-2及IFNg是T淋巴细胞分泌的介导Th1细胞免疫应答的重要淋巴因子，具有显著的增强免疫及抗病毒作用。有研究表明，慢性丙型肝炎患者外周血中IL2和IFNg等Th1细胞因子水平下降。同时IL4和IL10等Th2细胞因子水平升高，这种Th1和Th2细胞因子水平的不平衡现象可能在HCV持续性感染及慢性丙型肝炎的发病机理中起了重要作用[7]。pcDNA3-HCV基因疫苗能明显地诱导Th1细胞因子IL-2及IFNg的产生，可能有助于增强抗丙型肝炎病毒感染的能力，因此基因疫苗可能在防治丙型肝炎病毒感染中起重要作用。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Lagging LM，Meyer K，Hoft D，et al. Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein[J]. J Viral，1995，69 : 5859-635.
[2] Tokushige K，Wakita T，Pachuk C，et al.Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs[J]. Hepatology，1994，20 : 123-127.
[3] Geissler M，Gesien A，Tokushige K，et al. Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids[J].J Immunol 1997，158: 1231-1237.
, http://www.100md.com
[4] 谭德明，胡国龄，张铮，等.丙型肝炎病毒分子克隆和DNA序列分析[J].中华医学杂志，1993，73(6):332-334
[5] 丁桂凤，席宏丽，邓玉兰，等.用活化的小鼠脾细胞测定IL-2[J].上海免疫学杂志，1988，8(1):64-673.
[6] 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990，265-267.
[7] Fan XG，Liu WE，Li CZ，et al. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infections[J]. Mediators of Inflammation，1998，7:295-297.
1999-10-03
1999-12-22, 百拇医药
单位：谭德明(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；刘双虎(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；李聪智(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；范学工(湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所，湖南 410008)；燕美玉(湖南医科大学免疫教研室， 湖南410078)；孙科柱(湖南医科大学免疫教研室， 湖南410078)
关键词：丙型肝炎病毒;基因疫苗;小白鼠
基础医学与临床000512
摘要：为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响，本文将HCV核心区基因定向克隆于质粒pcDNA3巨细胞病毒启动子下游，构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗pcDNA3-HCV，将此疫苗通过多点肌肉注射免疫BALB/C小鼠，结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗-HCV IgG阳性，其抗体水平明显高于对照组，同时Th1免疫应答相关的细胞因子IL-2及g干扰素水平也明显高于对照组，其结果表明，HCV核心基因疫苗能诱导BACB/L小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。
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中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)05-0041-02
V specific cellular and humoral immune responses induced by intramuscular
injection of DNA vaccine containing HCV core gene in mice
TAN De-ming，LIU Shuang-hu，LI Cong-zhi，et al
(Department of Infectious Diseases，Xiang-Ya Hospital，Hunan Medical University，Changsha，Hunan，410008，China)
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Abstract: The aim of the study is to know that HCV DNA vaccine could induce the cellular and humoral immunity in mice or not. The pcDNA3-HCV，in which the core gene sequences of HCV were inserted into downstream of CMV promoter in pcDNA3，were injected intramuscularly into BALB/C mice.The results showed that the serum anti-HCV were detected in all of the pcDNA3-HCV immunized mice，but none in control mice.TH1 cytokines，such as interleukine 2 and interferon gamma， were significantly higher in pcDNA3-HCV immunized mice than that in controls. It was indicated that the good responses of cellular and humoral immunity can be induced by injection of pcDNA3-HCV in BACB/C mice.，in which the core gene sequences of HCV were inserted into downstream of CMV promoter in pcDNA3，were injected intramuscularly into BALB/C mice.The results showed that the serum anti-HCV were detected in all of the pcDNA3-HCV immunized mice，but none in control mice.TH1 cytokines，such as interleukine 2 and interferon gamma， were significantly higher in pcDNA3-HCV immunized mice than that in controls. It was indicated that the good responses of cellular and humoral immunity can be induced by injection of pcDNA3-HCV in BACB/C mice.
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Key words ：HCV; DNA vaccine; BALB/C mouse
丙型肝炎病毒(HCV)感染是我国慢性病毒性肝炎的主要病原之一，可导致肝硬化及肝癌等严重后果。目前尚无有效的方法预防HCV感染。近来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫应答，特别是诱导细胞免疫应答的能力优于蛋白多肽类疫苗，更适应于易于变异的慢性病毒感染的预防与治疗[1～3]。为了探讨应用HCV基因疫苗预防HCV感染的可能性，本文构建了HCV&127;核心区基因疫苗，并观察了该疫苗经肌肉注射法接种BALB/C小鼠后的细胞及体液免疫功能的变化。
1. 材料与方法
1.1 pcDNA3-HCV的构建及鉴定
HCV核心基因为本研究所克隆[4]，所用载体为pUC19质粒。将此重组质粒中的HCV核心区基因用EcoR V及Hind 双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收和纯化HCV核心基因片段(Wizard DNA Clean UP System，购于Promega公司)后，定向克隆于已预先用同样方法处理的真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游，称之为pcDNA3-HCV，该重组质粒即为HCV核心区基因疫苗，经Hind 和EcoR V双酶 切电泳分析及PCR方法鉴定，确定pcDNA3-HCV中确有HCV核心基因片段。
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1.2 pcDNA3-HCV大量制备
pcDNA3-HCV转化到大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，按碱裂解方法提取质粒，纯化后通过紫外分光光度计测定其浓度，按2g/L溶于无菌PBS，-20℃保存备用。
1.3基因疫苗的免疫接种
选用4～6周龄的BALB/C小白鼠，分为实验组与对照组。实验组(N=5)注射pcDNA3-HCV,用1mL注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，每次每只总量200mg，2周及4周后各追加免疫一次。对照组(n=5)按实验组相同的方法注射pcDNA3空质粒。末次注射2周后处理动物，去眼球采血至死，无菌取脾脏(处理见后)。采取的血液经分离血清后，取血清-20℃保存备用。
1.4 体液免疫功能测定
将HCV核心抗原(美国Chiron公司惠赠)包被于酶标板，1%BSA封闭后4℃备用，将小鼠血清用样本稀释液按1:20比例稀释，每孔100mL加于上述酶标板中，37℃，30min，加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(武汉博士德公司)100mL(1:15000)，37℃，30min，PBS洗涤后，加入底物，37℃，10min，终止反应后用酶标仪测定A值。
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1.5 细胞免疫功能测定
无菌取脾脏后，用100目钢网研磨，低渗破坏红细胞，调细胞浓度到5×106/mL，放于24孔培养板内，每孔1mL，再加入ConA(终浓度为20mg/ml)，37℃，5% CO2培养48h，经2000r/min离心20min收集 上清液，即为白细胞介素Ⅱ(IL-2)及g干扰素(IFNg)的待测样品，-20℃保存待测。
1.5.1 IL-2测定：以本研究所的方法为基础，并参照丁桂风[5]的方法，IL-2活性以剌激指数(SI)表示：
1.5.2 IFNr测定：根据文献[6]采用病变抑制法，IFN活性以U/mL表示。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
采用t检验。
2 结果
经pcDNA3-HCV免疫后的小鼠血清抗HCV均呈阳性，其A值明显高于对照组小鼠血清。 脾淋巴细胞产生IL-2和IFNg的能力也以实验组明显高于对照组(表1)。
表1 小鼠血清抗HCV 和脾淋巴细胞产生IL-2
和IFNγ 的能力比较
Table 1 Serum anti-HCV level and IL-2 &IFN produced
by spleen cells in pcDNA3-HCV immunized BALB/C mice,as compared with the controls (
±s n=5), 百拇医药
Anti-HCV(Avalue)
IL-2(SI)
IFN(U/mL)
pcDNA3group
0.11±0.03
58.70±34.10
54.32±34.18
pcDNA3-HCVgroup
0.58±0.36*
173.93±58.54**
246.56±110.24*
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3 讨论
本文以HCV核心蛋白基因作为免疫基因，通过修饰后，将其克隆到高效表达质粒pcDNA3中，该质粒带有巨细胞病毒启动子，可保证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。实验结果显示，本文构建的基因疫苗pcDNA3-HCV免疫小鼠6周后，实验组5只小鼠均出现了体液免疫应答，产生了较高效价的抗HCV核心蛋白抗体，说明基因疫苗能在小鼠体细胞内表达HCV核心抗原，从而刺激小鼠产生抗HCV，而注射pcDNA3的小鼠不能产生抗HCV，仅有较低的非特异性反应，二者结果差异有显著性。pcDNA3-HCV基因疫苗免疫小鼠后，除能诱导产生抗HCV外还能引起较强的细胞免疫应答，表现为IL-2及IFNg水平明显增高，与只注射pcDNA3的对照组差异有显著性。IL-2及IFNg是T淋巴细胞分泌的介导Th1细胞免疫应答的重要淋巴因子，具有显著的增强免疫及抗病毒作用。有研究表明，慢性丙型肝炎患者外周血中IL2和IFNg等Th1细胞因子水平下降。同时IL4和IL10等Th2细胞因子水平升高，这种Th1和Th2细胞因子水平的不平衡现象可能在HCV持续性感染及慢性丙型肝炎的发病机理中起了重要作用[7]。pcDNA3-HCV基因疫苗能明显地诱导Th1细胞因子IL-2及IFNg的产生，可能有助于增强抗丙型肝炎病毒感染的能力，因此基因疫苗可能在防治丙型肝炎病毒感染中起重要作用。
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参考文献：
[1] Lagging LM，Meyer K，Hoft D，et al. Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein[J]. J Viral，1995，69 : 5859-635.
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[6] 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990，265-267.
[7] Fan XG，Liu WE，Li CZ，et al. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infections[J]. Mediators of Inflammation，1998，7:295-297.
1999-10-03
1999-12-22, 百拇医药