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编号:10279495
高温对大鼠红细胞免疫功能和胚胎发育的影响
http://www.100md.com 《卫生研究》 2000年第2期
     作者:朱新安 李勇

    单位:朱新安(新疆医科大学附属中医医院,乌鲁木齐 830000);李勇(北京医科大学卫生部生育健康研究重点实验室)

    关键词:高温;红细胞;免疫功能;胚胎;致畸性

    摘 要摘 要:为研究高温(40℃)对孕10天龄大鼠红细胞免疫功能和胚胎生长发育的影响并探讨其作用机理,对孕鼠进行不同时间的热处理(0、0.5、1.0、2.5和5.0h)后,取静脉血检测红细胞C3b受体活性(花环)、红细胞免疫复合物和血清中循环免疫复合物含量;并用尼罗兰活体染色、光镜、电镜、组织化学等方法探讨高温对胚胎的致畸性。结果显示,高温使红细胞C3b受体花环、红细胞免疫复合物和循环免疫复合物水平升高,室温(22±2)℃恢复20h后,基本降至正常水平;随着高温处理时间的延长,畸胎率由0.9%(1/117)上升到18.3%(22/120),呈明显时间-效应关系,活性染色发现在胚胎肢芽、颅面部和腮弓等部位出现死亡细胞,镜检发现高温能损害细胞的超微结构和诱发胚胎细胞凋亡过度。提示:热应激时,母体红细胞免疫功能的增强可能是高温致畸作用的机制之一。
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    分类号:R122.2 R392 R329 文献标识码:A

    文章编号:1000-8020(2000)02-0089-03

    Effect of hyperthermia on the red-cell immune function of

    rats and its teratogenicity on developing embryos

    Zhu Xin-an Li Yong

    Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University,Urumuqi 830000,China

    Abstract:After rats on gestation day 10 exposed to hyperthermia(40℃) for 0.5,1.0,2.5and5.0h,redcell C3b receptor activity(aggregate),red-cell immune complex,circulating immune complex,Nile blue sulfate(NBS) vital staining,electronic microscope and histochemical techniques were used in investigate whether the hyperthermia was disturb red-cell immune functions of pregnant rats and played some role in teratogenesis.The results showed that hyperthermia increased the level of red-cell C3b receptor activity,red-cell immune complex and circulating immune complex.On the other hand,many of them also decreased to normal level after rats were placed in room temperature for 20h.Following the extension of hyperthermic exposure,the teratogenic incidence increased from 0.9%(1/117)to 18.3%(22/120),in apparent time-effect relationship,when pregnant rats of gestation day 11.5 were killed.It was found that hyperthermia induced over apoptosis of embryos in many areas,and damaged cellular ultrastructures by NBS staining and electronic microscope.These findings show that there may be some relationship between red-cell immune function of pregnant rats and developmental defects of embryos after exposure to hyperthermia.
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    Key words:hyperthermia,red cell,immune function,embryo,teratogenicity

    随着免疫学理论及方法学的飞速发展和对红细胞作用认识的不断加深,已发现红细胞不仅具有呼吸功能,而且和白细胞一样,具有免疫功能[1,2]。本实验观察了高温对孕大鼠红细胞免疫功能及对胚胎生长发育的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物和分组

    健康未生育SD雌性大鼠,体重为200~280g,按雌雄1∶1 合笼交配。次日晨9∶00时检查阴栓,查见阴栓日定为妊娠0天。常规饲养至10天后,60只孕大鼠被随机分成5组(第1组为对照组,第2~4组为实验组),每组12只。每一实验组经40℃高温环境处理不同时间(0.5、1.0、2.5和5.0h)后,室温环境(22±2)℃中恢复20h;对照组除高温环境外,其它条件同实验组。
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    1.2 方法

    1.2.1 红细胞C3b受体花环试验 割尾采血法取不同时间热处理及恢复后的孕鼠尾静脉血0.5ml/只。肝素抗凝,生理盐水洗涤离心(2 000r/min、4min×2)和红细胞计数后,配成浓度为1.25×107/ml的红细胞使用液。冻干补体致敏酵母菌用生理盐水洗涤离心1次,配成1×108/ml的补体致敏酵母菌悬液。取红细胞使用液和补体致敏酵母菌悬液各50μl,试管内充分混匀,37℃水浴30min,加生理盐水100μl稀释混匀,再加0.25%戊二醛液2滴,涂片冷风吹干,瑞氏染色后镜下计数200个红细胞,以结有2个和2个以上酵母菌的红细胞为阳性花环,换算成百分率作为红细胞C3b受体活性的指标。

    1.2.2 红细胞免疫复合物花环试验 原理是酵母菌外膜酵母多糖可黏附红细胞膜上的免疫复合物并形成花环。具体操作步骤与红细胞C3b受体花环试验相同,仅将致敏酵母菌改成未致敏酵母菌;亦换算成百分率用为红细胞膜上吸附免疫复合物量的指标。
, 百拇医药
    1.2.3 循环免疫复合物采用紫外分光光度计定量测定方法检测[3]

    1.2.4 大鼠胚胎生长发育终点监测方法见文献[4];每窝随机取3~4只胚胎进行组织病理、免疫组化和蛋白质DNA含量测定。

    1.2.5 尼罗兰硫酸盐(NBS)活体染色法见文献[5];每窝随机取2只胚胎。

    1.2.6 统计处理 实验所获数据录入微机,采用SAS软件系统中的方差分析和χ2检验等方法。

    2 结果

    2.1 高温处理对孕鼠红细胞免疫功能的影响

    各高温处理组均未见孕鼠有明显的中暑症状和死亡。与正常对照组比较,高温(40±0.3)℃处理各组红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率和循环免疫复合物均明显升高(表1)。
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    表1 不同时间高温(40℃)处理对孕鼠红细胞免疫

    功能的影响(x±s)

    组别

    例数

    (只)

    红细胞C3b受

    体花环率(%)

    红细胞免疫复合

    物花环率(%)

    循环免疫

    复合物(mg/L)

    对照组
, 百拇医药
    12

    8.74±2.31

    4.05±2.04

    5.32±2.10

    高温处理组

    0.5h组

    12

    9.07±2.20

    9.11±2.77(1)

    7.41±2.31(1)

    1.0h组

    11
, 百拇医药
    11.36±2.69(1)

    10.21±2.08(1)

    8.99±1.87(1)

    2.5h组

    11

    11.84±2.84(1)

    10.71±3.14(1)

    9.46±2.26(1)

    5.0h组

    12
, 百拇医药
    11.98±1.94(1)

    10.87±2.42(1)

    9.81±2.37(1)

    注:(1)与对照组比较P<0.052.2 恢复20h后孕鼠红细胞免疫功能的测定

    由表2可见高温暴露的孕鼠经室温(22±2)℃恢复20h后,红细胞C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环率基本恢复至正常水平(P>0.05);但5.0h组孕鼠的红细胞免疫复合物花环率和循环免疫复合物水平仍明显高于对照组(P<0.05)。

    表2 室温恢复20h后孕鼠红细胞免疫复合物

    功能测定结果(x±s)
, 百拇医药
    组别

    例数

    (只)

    红细胞C3b受

    体花环率(%)

    红细胞免疫复

    合物花环率(%)

    循环免疫复合物

    (mg/L)

    对照组

    12

    9.01±2.24

    5.56±2.48
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    5.92±2.76

    高温处理组

    0.5h组

    12

    8.93±2.15

    6.78±2.34

    7.02±2.71

    1.0h组

    11

    8.84±1.96

    7.01±2.66

    7.06±1.95
, 百拇医药
    2.5h组

    11

    9.77±2.45

    7.02±2.81

    7.11±2.28

    5.0h组

    12

    9.69±2.31

    7.76±2.61(1)

    8.96±3.01(1)

    注:(1)与对照组比较 P<0.052.3 高温对胚胎的影响
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    2.3.1 不同时间高温处理对胚胎生长发育的影响 高温处理后,剖取的580只11.5天龄大鼠胚胎体视镜观察结果见表3。高温诱发各种畸形的主要表现为颅面部畸形、体节紊乱、神经管末闭及小肢芽等。

    表3 高温对器官形成期大鼠胚胎生长发育的影响

    组别

    胚胎数

    (只)

    卵黄囊直径

    (mm)

    颅臀长

    (mm)

    头长

, 百拇医药     (mm)

    发育正常

    死亡

    总畸形

    胎数

    率(%)

    胎数

    率(%)

    胎数

    率(%)

    对照组

    117

    5.07±0.24
, 百拇医药
    4.05±0.11

    2.04±0.08

    116

    99.1

    0

    1

    0.9

    高温处理组

    0.5h组

    121

    5.11±0.42

    4.06±0.34

    2.08±0.09
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    119

    98.3

    0

    2

    1.7

    1.0h组

    109

    4.92±0.19

    3.97±0.26

    1.94±0.12

    106

    97.2

    1
, 百拇医药
    0.9

    2

    1.8

    2.5h组

    113

    4.81±0.37

    3.74±0.31

    1.82±0.14

    103

    91.1

    3

    2.7

    7
, 百拇医药
    6.2

    5.0h组

    120

    4.58±0.56

    3.96±0.47

    1.62±0.32(1)

    90

    75.0

    8

    6.7

    22

    18.3

, http://www.100md.com     注:(1)与对照组比较P<0.05 (2)趋势性χ2检验,P<0.05

    2.3.2 NBS活体染色 不同时间高温处理诱导胚胎细胞死亡结果见表4。死亡部位多发生在大鼠胚胎肢芽、颅面部和腮弓等位点。

    表4 高温对10天龄大鼠胚胎的损害

    组 别

    胚胎数

    (只)

    受损胚胎数

    (只)

    阳性率(1)

    (%)
, 百拇医药
    对照组

    24

    1

    4.2

    高温处理组

    0.5h组

    24

    3

    12.5

    1.0h组

    22

    5

    22.7
, 百拇医药
    2.5h组

    22

    7

    31.8

    5.0h组

    24

    16

    66.7

    注:(1)趋势性χ2检验 P<0.05

    2.3.3 大鼠胚胎的组织形态学观察 透射电镜下与正常对照组比较,当40℃高温处理5.0h时,可见:(1)卵黄囊内皮层细胞表面的微绒毛排列不规则、变短和数量明显减少;胞质内空泡增多,线粒体和内质网有不同程度肿胀;胞核染色质分布不均和边缘化。间质层卵黄血管微量减少和管腔变细,可见部分凋亡的血管内皮细胞;(2)胚胎脑神经细胞形态变异,细胞间缝隙连接减少,胞内溶酶体增多和电子密度增高,观察到少量已发生凋亡的脑神经细胞。光镜观察可见高温处理5.0h组胚胎脑室结构异常和一些脱落的室管壁边缘层细胞,其体积变小且部分细胞已死亡。
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    2.3.4 大鼠胚胎蛋白质和DNA含量测定 不同时间高温处理对胚胎蛋白质和DNA的影响见表5。热暴露5.0h时可明显抑制胚胎蛋白质和DNA的合成。

    表5 高温对大鼠胚胎总蛋白质和DNA含量的影响(x±s)

    组 别

    胚胎数

    (只)

    蛋白质

    (μg/胚胎)

    DNA

    (μg/胚胎)

    对照组

    12
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    302.8±81.3

    31.6±5.4

    高温处理组

    0.5h组

    12

    298.7±57.2

    30.1±6.3

    1.0h组

    11

    271.1±49.8

    25.3±4.9

    2.5h组
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    11

    264.9±51.3

    27.6±9.6

    5.0h组

    12

    181.4±43.7(1)

    23.7±8.1(1)

    注:(1)与对照组比较 P<0.053 讨论

    红细胞免疫是一新的研究领域,红细胞具有多种免疫功能,它参与机体免疫调控和免疫反应,其主要功能之一是增强机体对血循环免疫复合物的清除作用[1,2]。红细胞能通过其表面膜结构中的C3b受体识别与黏附循环复合物,然后携带至肝脏、脾脏而被降解,进而减少血中循环免疫复合物在组织中的沉积,避免循环免疫复合物激活补体而导致的病理性损伤。内/外高温环境(例如:高烧、夏季炎热和某些特殊劳动环境等)是影响生物体的重要因素[6],尤其是对特殊人群——妊娠妇女。本实验结果发现,在外界高温环境(40℃)下,孕10天龄大鼠的红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率和血中循环免疫复合物随着热暴露时间的不断延长而升高;热暴露2.5h和5.0h组,上述3项指标仍处在基本一致的高水平,这就提示:热暴露达一定时间后,红细胞的免疫功能可升高到某一持续水平,此时,机体就可能发生分解代谢增强、电解质紊乱、较严重的酸中毒和血中白细胞总数下降等情况。从另一角度而言,由于循环免疫复合物的增多,此时红细胞免疫黏附能力的增强应视为是孕体对高温的应激反应,可能对维持机体的正常免疫状态,及时有效地清除血中的循环免疫复合物具有积极作用。
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    实验发现当孕鼠经室温恢复20h后,多数指标基本降至正常,但热暴露5.0h组的红细胞免疫复合物花环率和血中循环免疫复合物仍维持在高水平(P<0.05),说明较长时间热暴露后尽管经一定时期的恢复,血中的免疫复合物不能很快被清除,提示参与红细胞清除机制的肝、脾脏可能发生一定程度的功能异常,如果这一状态进一步发展,可能会引起孕鼠红细胞免疫功能下降,进而影响胚胎的生长发育。

    大量的体内/体外实验研究均证实高温可导致多种动物发生先天性畸形[7,8]。本实验结果亦证实高温可导致器官形成期大鼠胚胎死亡、畸形和发育迟缓,主要作用的靶器官是神经系统和体节。例如:热暴露5.0h后,反映胚胎脑发育的重要指标头长明显低于正常对照组;神经系统的畸形亦明显高于正常对照组。病理观察发现的胚胎脑神经细胞损伤,PCD数增多;活体染色观察到的死亡细胞增多等均证明高温致畸作用机理与其损伤胚胎细胞关系密切。此外,我们还发现在热应激条件下,热休克蛋白(HSP)70和27及诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)等基因及其编码产物的表达异常(待发表资料);胚胎蛋白质和DNA合成明显减少,这些结果均提示胚胎细胞分化受损与高温诱导遗传物质变异密切关联。实验还发现,高温对卵黄囊胎盘血管也有明显的损害作用,进而干扰其转运功能和造血功能;说明在异常的高温环境中,机体免疫复合物的增多,可能会影响卵黄囊微血管中血液的流动,造成微循环缺血和缺氧,最终造成胚胎发育受损。
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    本研究结果提示,检测妊娠动物的红细胞免疫功能可以作为评判热应激下机体功能变异的一个客观指标,母体红细胞免疫功能的增强(或紊乱)可能是高温致畸的一个重要机理。此外,是否尚有红细胞免疫调节因子、神经体液调节因子参与上述过程,将是我们下一步要进行研究的重要问题之一。

    基金项目:国家自然科学基金(No.39870697,39870845)

    作者简介:朱新安,男,硕士,副教授

    参考文献:

    [1]Siegel I, Liu TL, Gleicher N. The red-cell immune system. Lancet,1981,2:556—559

    [2]郭峰,卢紫茜,赵中平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志,1982,62(12):715—716
, 百拇医药
    [3]武建国.实用临床免疫学检验.南京:江苏科技出版社,1989,214—218

    [4]李勇,朱惠刚,潘漪清,等.砷对大鼠的致畸作用.中华预防医学杂志,1998,32(1):37—39

    [5]李勇,陈星,齐佩文,等.同型半胱氨酸对鸡神经胚形成期胚胎的发育毒性和致畸作用初探.中国优生优育,1998,9(1):7—9

    [6]李勇,朱惠刚.热休克蛋白在应激环境中对胚胎生长发育的影响.国外医学卫生学分册,1997,24(1):20—23

    [7]Buckiova D, Jelinek R. Heat shock proteins and teratogenesis. Reprod Toxicol,1995,9(6):501—505

    [8]Kimmel CA, Cuff JM, Kimmel GL, et al. Skeletal development following heat exposure in the rat. Teratology,1993,47:229—242

    收稿日期:2000-01-05, http://www.100md.com