预热对K562细胞肿瘤坏死因子α敏感性的影响
作者：王枫 赵法伋 郭俊生
单位：王枫(第四军医大学军队卫生教研室，西安 710032)；赵法伋(第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433；郭俊生(第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433
关键词：K562细胞；肿瘤坏死因子α；预热；热应激蛋白70
摘 要摘 要：为探讨预热对肿瘤细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)敏感性的影响及其机理，将白血病患者胸腔渗出细胞系(K562细胞)在40℃预热不同时间(0、30、60、90、120、150和180min)，使细胞热应激蛋白70(HSP70)高表达；然后将预热60min细胞和未预热细胞分别暴露于50、100、200和400U/ml的TNF-α16小时，用MTT比色法检测细胞活力。保持TNF-α浓度为100U/ml不变，观察预热时间对细胞TNF-α敏感性的影响，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞HSP70的含量。结果：40℃预热后细胞的HSP70含量升高，在预热120min达到最高，以后缓慢下降；预热细胞对相同浓度TNF-α的敏感性明显低于未预热细胞；对于相同浓度的TNF-α，预热120min的细胞对TNF-α敏感性最低。结果提示，预热可以引起细胞HSP70表达增高，降低细胞对TNF-α的敏感性。
, 百拇医药
分类号：R736.3 R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0087-03
Effects of pre-heating on the sensitivity of K562
cell to tumor necrosis factor-α
Wang Feng Zhao Faji Guo Junsheng
(Department of Military Hygiene， Fourth Military Medical University， Xi-an 710032，China)
Abstract：In order to study the effects of pre-heating on the sensitivity of cells to tumor necrosis factor-α(TNF-α)， the K562 cells were pre-heated at 40℃ for different times to induce heat shock protein 70(HSP70). To observe the effects of TNF-α concentration on the sensitivity of pre-heated cells， cells were pre-heated for 60 min and treated with TNF-α (50，100，200 and 400U/ml) for 16 hours， and the cells vitalities were detected by MTT. In order to observe the effect of pre-heating time on the sensitivity of cells to TNF-α，the pre-heated cells were treated with 100U/ml TNF-α for 24 hours. The levels of HSP70 were tested by reversed transcription-PCR(RT-PCR). The results showed that HSP70 could be induced by pre-heating， and reached its top level after 120mins， and the sensitivity of non-heated cells to TNF-α was lower than that of pre-heated cells. To 100U/ml TNF-α， the sensitivity was lowest after the cells were pre-heated for 120 min. The results suggested that pre-heated could induce the expression of HSP70 and inhibite the sensitivity of cell to TNF-α， the mechanism may be involved with the overexpression of HSP70.
, 百拇医药
Key words：K562 cell，tumor necrosis factor,pre-heating, heat shock protein70
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由巨噬细胞产生的，体内、体外实验均发现其可引起肿瘤细胞的死亡[1]。根据肿瘤细胞的种类不同，分别可以引起细胞溶解、增强氧介导的反应(ROI)[2]、磷酯酶活化[3]、蛋白酶活化和DNA损伤等。TNF-α还与炎症反应、促有丝分裂和细胞分化有关。
预热可以使细胞对有害因素产生抗性，其机理可能是细胞合成了大量的热应激蛋白，其中最多的是热应激蛋白70(HSP70)。细胞保护能力与HSP70的表达水平有关，随着HSP70增加，细胞在有害环境中的生存能力增强。细胞因子对于效应细胞是一种损害因素，热应激蛋白对细胞因子也有对抗作用，可对抗细胞因子的细胞毒作用。K562细胞是肿瘤细胞系，TNF-α可引起肿瘤细胞死亡，所以推测，HSP70高表达可以引发K562细胞对TNF-α细胞毒作用的抗性。为验证假设，本文以预热暴露诱导K562细胞HSP70高表达，观察细胞对TNF-α敏感性的变化。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞及培养
K562细胞(白血病患者胸腔渗出细胞)系第二军医大学长海医院中医科实验室惠赠。按常规在RPMI-1640细胞培养液、37℃、湿化的5%CO2的细胞培养箱培养。
1.2 主要试剂和酶
RPMI-1640培养基，Gibco公司；MMLV逆转录酶、RNasin、TaqDNA聚合酶、dNTP、TNF-α均为Megagene公司产品；聚合酶链反应(PCR)引物、逆转录引物均为中国科学院上海生物工程研究所合成；总RNA提取试剂盒为上海华顺公司产品。
1.3 K562细胞HSP70的诱导
, http://www.100md.com 将对数生长的细胞换液，在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导细胞HSP70高表达；取部分用于RNA提取，部分用于接种96孔板。
1.4 诱导细胞HSP70 mRNA的检测[4]
用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法定量法，内对照为β-actin。按RNA的提取按试剂盒使用说明操作，提取的RNA溶于50μl的双蒸水中，定量、检测纯度。反转录合成cDNA第1链：其中含反转录缓冲液4μl，dNTP(各10mmol/L)1μl，RNasin20U，逆转录引物(50μmol/L)2μl，内参RNA2μl，细胞总RNA3μl(3μg)，加水到19μl，65℃保温5min，再加1μl逆转录酶(200U/μl)，37℃保温1h，95℃5min灭活酶。PCR扩增反应：总量为20μl，其中含10×PCR缓冲液2μl，5′-引物(10μmol/L)2μl，3′-引物(10μmol/L)2μl，dNTP(各2.5mmol/L)2μl，反转录产物2μl，双蒸水9μl，TaqDNA合成酶(1mol/L)1μl，PCR仪上，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，循环30次，最后72℃延伸15min。扩增产物的凝胶电泳及扫描：用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳后照相，Gel Scan XL扫描仪扫描电泳凝胶，目的RNA与内参RNA条带扫描密度的比值(e/e0)即代表HSP70 mRNA的量。
, 百拇医药
1.5 TNF-α浓度对细胞TNF敏感性影响
分别取预热60min和未预热细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，每孔加入RPMI-1640培养液60μl，再加入TNF-α使其终浓度分别达到50、100、200和400U/ml；每个浓度设6个试验孔，3个对照孔加入0.01mol pH7.2 PBS20μl/孔。使细胞在37℃、湿化5%CO2培养箱中孵育16h，MTT比色法检测细胞活力，计算细胞抑制率：
细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%
1.6 预热时间对细胞TNF-α敏感性的影响
分别取预热不同时间的细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，每孔加入RPMI-1640培养液60μl。每孔加入TNF-α使其浓度分别达到100U/ml，每个浓度设6个试验孔，再设6孔未预热细胞。3个对照孔加入0.01mol pH7.2 PBS 20μl/孔。使细胞在37℃、湿化5%CO2培养箱中孵育24h，测定细胞活力。
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1.7 统计分析
全部结果用
±s表示，用t检验和方差分析统计结果。
2 结果
2.1 预热对细胞HSP70 mRNA的诱导
从表1可见，预热诱导HSP70的速度比较快，30min后HSP70 mRNA水平即明显升高(P<0.05)；随着时间的延长，HSP70 mRNA水平也不断增高，到120min时达到最高，以后略有下降，但下降幅度不明显。
表1 预热对细胞HSP70的诱导结果(
±s，n=6)
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仪器参数
0min
30min
60min
90min
120min
150min
180min
e/e0
0.73±0.24
1.36±0.39(1)
2.81±0.53(1)
, http://www.100md.com
3.55±1.02(1)
4.94±1.17(1)
4.61±1.23(1)
4.65±0.97(1)
注：(1)与0min时相比 P<0.052.2 TNF-α水平对细胞活力的影响
由表2可见，未预热细胞加入TNF-α 16h后，可以显著抑制细胞活力(P<0.01)，对照组除100U/ml和200U/ml间无显著性差异外，随着TNF-α浓度的增高，抑制率明显升高(P<0.05)；说明TNF-α对正常生长细胞的细胞毒作用是明显的。细胞预热60min后，不同浓度TNF-α对细胞活力的抑制率也随浓度增高而增加，但增加不显著，只有400U/ml组与其它剂量组间有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
表2 不同浓度TNF-α对细胞活力的抑制率(±s，n=6)
%
组别
0U/ml
50U/ml
100U/ml
200U/ml
400U/ml
预热组
, http://www.100md.com
5.42±0.67
9.33±1.80(1)
13.57±4.83(1)
19.06±8.42(1)
33.61±7.81(1，2)
对照组
6.13±0.74
42.35±4.49
67.82±8.31
72.67±7.41
, http://www.100md.com
83.76±9.25
注：(1)与对照组相比P<0.01，(2)与其它剂量预热组相比P<0.052.3 预热时间对K562细胞对TNF-α敏感性的影响
从表3可见，100U/ml TNF-α作用24h，随着预热时间的延长，TNF-α对细胞的抑制率显著降低(预热不同时间两组间比较，差异均有显著性，因标记烦琐，未标出显著性标记)。
表3 100U/ml TNF-α作用24小时对不同预热时间细胞的抑制率(±s，n=6)
%
, 百拇医药
0min
30min
60min
90min
120min
95.48±2.56
61.63±3.87
43.52±1.08
36.74±3.21
27.31±1.56
3 讨论
本实验结果与Mehlen等通过转染热应激蛋白基因所得的结果基本一致[5]。人细胞如果在42℃水浴30min后，细胞就会出现部分死亡；如果水浴温度低于40℃，诱导HSP70合成的速度就比较慢，所以预热暴露温度选择40℃左右比较合适。
, http://www.100md.com
实验结果发现，K562细胞对TNF-α的敏感性与HSP70的诱导量有关。相似的结果在猴COS细胞、鼠L929细胞及NIH3T3细胞也可以观察到[6]。所以HSP70的保护作用不是严格局限在某一种细胞，具有物种的广泛性，也不是细胞对某一种损伤的适应结果。
HSP70减轻TNF-α细胞毒作用的机理还不清楚，因为HSP70的保护作用是多步骤、多环节的。推测其作用机理可能是：①HSP70影响了体内TNF-α与其受体结合的亲和力[7]，使TNF-α不能有效地与特异的受体结合，不能发挥应有的作用；②HSP70通过影响磷酯酶A2的活性干扰花生四烯酸的代谢来发挥作用，因为TNF-α有介导磷酯酶的作用。
作者简介：王枫，男，讲师，现为第四军医大学生物学博士后流动站博士后，e-mail：wfsy@263.net
参考文献：
, 百拇医药
[1]Beutler B. Tumor necrosis factor:the molecules and their emerging role in medicine. New York:Raven Press，1992
[2]Yamauchi NY， Kuriyama N， Watanabe H， et al. Suppressive effects of intracellular glutathione on hydroxyl radical production induced by tumor necrosis factor. Int J Cancer，1990，46：884—890
[3]Sulfys P， Beyaer D， Fiers W， et al. Tumor-necrosis-factor mediated cytotoxity is correlated with phosophliase-A2 activity， but not with arachidomic acid per se. EMBO J， 1991，195：465—469
, 百拇医药
[4]Abe K， Kogure K， Itoyama Y. Rapid and semiquantitative analysis of HSP72 and HSC73 heat shock mRNAs by RT-PCR. Brain Res，1995，683：251—253
[5]Mehlen P， Preville Y， Pierre C， et al. Constitutive expression of human HSP27， drosophila HSP27，or human αB-crystallin confers resistance to TNF and oxidative stress-induced cytotoxicity in stably transfected Murine L929 fibroblasts. J Immunol， 1995，154：363—374
[6]Weil D. What's new about tumor necrosis factors?Report on the fourth TNF international congress. Eur Cytokine News，1992，3:347—359
[7]Jaattela M. Biological activities and mechanisms of action of tumor necrosis factor-α. Lab Invest，1991，64：724—727
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药
单位：王枫(第四军医大学军队卫生教研室，西安 710032)；赵法伋(第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433；郭俊生(第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433
关键词：K562细胞；肿瘤坏死因子α；预热；热应激蛋白70
摘 要摘 要：为探讨预热对肿瘤细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)敏感性的影响及其机理，将白血病患者胸腔渗出细胞系(K562细胞)在40℃预热不同时间(0、30、60、90、120、150和180min)，使细胞热应激蛋白70(HSP70)高表达；然后将预热60min细胞和未预热细胞分别暴露于50、100、200和400U/ml的TNF-α16小时，用MTT比色法检测细胞活力。保持TNF-α浓度为100U/ml不变，观察预热时间对细胞TNF-α敏感性的影响，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞HSP70的含量。结果：40℃预热后细胞的HSP70含量升高，在预热120min达到最高，以后缓慢下降；预热细胞对相同浓度TNF-α的敏感性明显低于未预热细胞；对于相同浓度的TNF-α，预热120min的细胞对TNF-α敏感性最低。结果提示，预热可以引起细胞HSP70表达增高，降低细胞对TNF-α的敏感性。
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分类号：R736.3 R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0087-03
Effects of pre-heating on the sensitivity of K562
cell to tumor necrosis factor-α
Wang Feng Zhao Faji Guo Junsheng
(Department of Military Hygiene， Fourth Military Medical University， Xi-an 710032，China)
Abstract：In order to study the effects of pre-heating on the sensitivity of cells to tumor necrosis factor-α(TNF-α)， the K562 cells were pre-heated at 40℃ for different times to induce heat shock protein 70(HSP70). To observe the effects of TNF-α concentration on the sensitivity of pre-heated cells， cells were pre-heated for 60 min and treated with TNF-α (50，100，200 and 400U/ml) for 16 hours， and the cells vitalities were detected by MTT. In order to observe the effect of pre-heating time on the sensitivity of cells to TNF-α，the pre-heated cells were treated with 100U/ml TNF-α for 24 hours. The levels of HSP70 were tested by reversed transcription-PCR(RT-PCR). The results showed that HSP70 could be induced by pre-heating， and reached its top level after 120mins， and the sensitivity of non-heated cells to TNF-α was lower than that of pre-heated cells. To 100U/ml TNF-α， the sensitivity was lowest after the cells were pre-heated for 120 min. The results suggested that pre-heated could induce the expression of HSP70 and inhibite the sensitivity of cell to TNF-α， the mechanism may be involved with the overexpression of HSP70.
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Key words：K562 cell，tumor necrosis factor,pre-heating, heat shock protein70
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由巨噬细胞产生的，体内、体外实验均发现其可引起肿瘤细胞的死亡[1]。根据肿瘤细胞的种类不同，分别可以引起细胞溶解、增强氧介导的反应(ROI)[2]、磷酯酶活化[3]、蛋白酶活化和DNA损伤等。TNF-α还与炎症反应、促有丝分裂和细胞分化有关。
预热可以使细胞对有害因素产生抗性，其机理可能是细胞合成了大量的热应激蛋白，其中最多的是热应激蛋白70(HSP70)。细胞保护能力与HSP70的表达水平有关，随着HSP70增加，细胞在有害环境中的生存能力增强。细胞因子对于效应细胞是一种损害因素，热应激蛋白对细胞因子也有对抗作用，可对抗细胞因子的细胞毒作用。K562细胞是肿瘤细胞系，TNF-α可引起肿瘤细胞死亡，所以推测，HSP70高表达可以引发K562细胞对TNF-α细胞毒作用的抗性。为验证假设，本文以预热暴露诱导K562细胞HSP70高表达，观察细胞对TNF-α敏感性的变化。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞及培养
K562细胞(白血病患者胸腔渗出细胞)系第二军医大学长海医院中医科实验室惠赠。按常规在RPMI-1640细胞培养液、37℃、湿化的5%CO2的细胞培养箱培养。
1.2 主要试剂和酶
RPMI-1640培养基，Gibco公司；MMLV逆转录酶、RNasin、TaqDNA聚合酶、dNTP、TNF-α均为Megagene公司产品；聚合酶链反应(PCR)引物、逆转录引物均为中国科学院上海生物工程研究所合成；总RNA提取试剂盒为上海华顺公司产品。
1.3 K562细胞HSP70的诱导
, http://www.100md.com 将对数生长的细胞换液，在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导细胞HSP70高表达；取部分用于RNA提取，部分用于接种96孔板。
1.4 诱导细胞HSP70 mRNA的检测[4]
用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法定量法，内对照为β-actin。按RNA的提取按试剂盒使用说明操作，提取的RNA溶于50μl的双蒸水中，定量、检测纯度。反转录合成cDNA第1链：其中含反转录缓冲液4μl，dNTP(各10mmol/L)1μl，RNasin20U，逆转录引物(50μmol/L)2μl，内参RNA2μl，细胞总RNA3μl(3μg)，加水到19μl，65℃保温5min，再加1μl逆转录酶(200U/μl)，37℃保温1h，95℃5min灭活酶。PCR扩增反应：总量为20μl，其中含10×PCR缓冲液2μl，5′-引物(10μmol/L)2μl，3′-引物(10μmol/L)2μl，dNTP(各2.5mmol/L)2μl，反转录产物2μl，双蒸水9μl，TaqDNA合成酶(1mol/L)1μl，PCR仪上，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，循环30次，最后72℃延伸15min。扩增产物的凝胶电泳及扫描：用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳后照相，Gel Scan XL扫描仪扫描电泳凝胶，目的RNA与内参RNA条带扫描密度的比值(e/e0)即代表HSP70 mRNA的量。
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1.5 TNF-α浓度对细胞TNF敏感性影响
分别取预热60min和未预热细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，每孔加入RPMI-1640培养液60μl，再加入TNF-α使其终浓度分别达到50、100、200和400U/ml；每个浓度设6个试验孔，3个对照孔加入0.01mol pH7.2 PBS20μl/孔。使细胞在37℃、湿化5%CO2培养箱中孵育16h，MTT比色法检测细胞活力，计算细胞抑制率：
细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%
1.6 预热时间对细胞TNF-α敏感性的影响
分别取预热不同时间的细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，每孔加入RPMI-1640培养液60μl。每孔加入TNF-α使其浓度分别达到100U/ml，每个浓度设6个试验孔，再设6孔未预热细胞。3个对照孔加入0.01mol pH7.2 PBS 20μl/孔。使细胞在37℃、湿化5%CO2培养箱中孵育24h，测定细胞活力。
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1.7 统计分析
全部结果用
±s表示，用t检验和方差分析统计结果。2 结果
2.1 预热对细胞HSP70 mRNA的诱导
从表1可见，预热诱导HSP70的速度比较快，30min后HSP70 mRNA水平即明显升高(P<0.05)；随着时间的延长，HSP70 mRNA水平也不断增高，到120min时达到最高，以后略有下降，但下降幅度不明显。
表1 预热对细胞HSP70的诱导结果(
±s，n=6), http://www.100md.com
仪器参数
0min
30min
60min
90min
120min
150min
180min
e/e0
0.73±0.24
1.36±0.39(1)
2.81±0.53(1)
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3.55±1.02(1)
4.94±1.17(1)
4.61±1.23(1)
4.65±0.97(1)
注：(1)与0min时相比 P<0.052.2 TNF-α水平对细胞活力的影响
由表2可见，未预热细胞加入TNF-α 16h后，可以显著抑制细胞活力(P<0.01)，对照组除100U/ml和200U/ml间无显著性差异外，随着TNF-α浓度的增高，抑制率明显升高(P<0.05)；说明TNF-α对正常生长细胞的细胞毒作用是明显的。细胞预热60min后，不同浓度TNF-α对细胞活力的抑制率也随浓度增高而增加，但增加不显著，只有400U/ml组与其它剂量组间有显著性差异(P<0.05)。
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表2 不同浓度TNF-α对细胞活力的抑制率(
±s，n=6)%
组别
0U/ml
50U/ml
100U/ml
200U/ml
400U/ml
预热组
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5.42±0.67
9.33±1.80(1)
13.57±4.83(1)
19.06±8.42(1)
33.61±7.81(1，2)
对照组
6.13±0.74
42.35±4.49
67.82±8.31
72.67±7.41
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83.76±9.25
注：(1)与对照组相比P<0.01，(2)与其它剂量预热组相比P<0.052.3 预热时间对K562细胞对TNF-α敏感性的影响
从表3可见，100U/ml TNF-α作用24h，随着预热时间的延长，TNF-α对细胞的抑制率显著降低(预热不同时间两组间比较，差异均有显著性，因标记烦琐，未标出显著性标记)。
表3 100U/ml TNF-α作用24小时对不同预热时间细胞的抑制率(
±s，n=6)%
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0min
30min
60min
90min
120min
95.48±2.56
61.63±3.87
43.52±1.08
36.74±3.21
27.31±1.56
3 讨论
本实验结果与Mehlen等通过转染热应激蛋白基因所得的结果基本一致[5]。人细胞如果在42℃水浴30min后，细胞就会出现部分死亡；如果水浴温度低于40℃，诱导HSP70合成的速度就比较慢，所以预热暴露温度选择40℃左右比较合适。
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实验结果发现，K562细胞对TNF-α的敏感性与HSP70的诱导量有关。相似的结果在猴COS细胞、鼠L929细胞及NIH3T3细胞也可以观察到[6]。所以HSP70的保护作用不是严格局限在某一种细胞，具有物种的广泛性，也不是细胞对某一种损伤的适应结果。
HSP70减轻TNF-α细胞毒作用的机理还不清楚，因为HSP70的保护作用是多步骤、多环节的。推测其作用机理可能是：①HSP70影响了体内TNF-α与其受体结合的亲和力[7]，使TNF-α不能有效地与特异的受体结合，不能发挥应有的作用；②HSP70通过影响磷酯酶A2的活性干扰花生四烯酸的代谢来发挥作用，因为TNF-α有介导磷酯酶的作用。
作者简介：王枫，男，讲师，现为第四军医大学生物学博士后流动站博士后，e-mail：wfsy@263.net
参考文献：
, 百拇医药
[1]Beutler B. Tumor necrosis factor:the molecules and their emerging role in medicine. New York:Raven Press，1992
[2]Yamauchi NY， Kuriyama N， Watanabe H， et al. Suppressive effects of intracellular glutathione on hydroxyl radical production induced by tumor necrosis factor. Int J Cancer，1990，46：884—890
[3]Sulfys P， Beyaer D， Fiers W， et al. Tumor-necrosis-factor mediated cytotoxity is correlated with phosophliase-A2 activity， but not with arachidomic acid per se. EMBO J， 1991，195：465—469
, 百拇医药
[4]Abe K， Kogure K， Itoyama Y. Rapid and semiquantitative analysis of HSP72 and HSC73 heat shock mRNAs by RT-PCR. Brain Res，1995，683：251—253
[5]Mehlen P， Preville Y， Pierre C， et al. Constitutive expression of human HSP27， drosophila HSP27，or human αB-crystallin confers resistance to TNF and oxidative stress-induced cytotoxicity in stably transfected Murine L929 fibroblasts. J Immunol， 1995，154：363—374
[6]Weil D. What's new about tumor necrosis factors?Report on the fourth TNF international congress. Eur Cytokine News，1992，3:347—359
[7]Jaattela M. Biological activities and mechanisms of action of tumor necrosis factor-α. Lab Invest，1991，64：724—727
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药