凋亡细胞细胞膜和线粒体的动态变化
作者：管增伟 王盛兰 李勇 杨业鹏 袁兰 杨建如 马士良 王起恩
单位：管增伟(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；袁兰(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；杨建如(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；马士良(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；王盛兰(北京医科大学病理学系)；李勇(北京医科大学中国妇婴保健中心)；杨业鹏(北京医科大学基础学院放射医学教研室)；王起恩(北京医科大学公共卫生学院劳卫教研室)
关键词：细胞凋亡；流式细胞术
卫生研究000208 摘 要：应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16及化学毒物叠氮钠分别诱导HL-60细胞凋亡及坏死，在0、2、4、8、16及24h各时间点，应用Hoechst33258染色，荧光显微镜及透射电镜对核形态进行观察，通过流式细胞术检测二乙酸荧光素(FDA)、罗丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(PI)荧光强度的变化，观察细胞凋亡及坏死过程中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。结果显示：HL-60细胞在VP-16处理4h时核形态开始变化，有核浓缩的细胞比例在8h达高峰，然后下降；核碎裂细胞的比例在24h达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。线粒体跨膜电位在8h后渐渐降低，16h可见明显降低。坏死细胞的线粒体膜电位在4h降低50%，细胞膜通透性也在8h之后出现变化。随处理的时间延长，FDA荧光强度进一步降低，对PI的摄取渐渐升高。结果提示，细胞凋亡过程中细胞膜通透性逐渐增高，线粒体膜电位降低。这两个指标能反映细胞凋亡及其程度，结合对细胞核形态观察，能更准确、可靠地反映细胞凋亡的发展变化。
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分类号：Q244 Q558 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0083-04
Kinetics of plasma membrane and mitochondrial alterations
in HL-60 cells undergoing apoptosis
Guan Zengwei Wang Shenglan Li Yong Yang Yepeng，et al.
(Medical and Pharmaceutical Analysis Center，Beijing Medical University，Beijing 100083，China)
, 百拇医药 Abstract：In the present study，VP16，an inhibitor of topoisomerase Ⅱ，and NaN3，a chemical toxic substance，were used to induce apoptosis and necrosis of HL-60 cells，respectively. Cells were examined by transmission electron microscopy and by fluorecence micrscopy after staining with Hoechst 33258 at 0，2，4，8，16 and 24h of culture. Alterations of fluorescent intensity produced by FDA，Rh 123 and PI were measured by flow cytometry，which reflects sequential changes on plasma membrane permeability and the potential of mitochondrial membrane. The results indicated that the nuclear morphologic alteration of cells treated with VP-16 began at 4 hour of culture and the cells with condensed nucleus culminated at 8h of culture and then reduced with no drop in cell counts，while the percentage of cells with fragmented nuclei reached its maximum at 24h of culture accounting for some 80%. The potential of mitochondrial membrane of of apopototic cells decreased gradually from 8h of culture and showed obvious decline at 16h of culture.In necrotic cells，the potential decreased by 50% at 4h of culture which indicates an earlier and more rapid decline than that in apopototic cells. Alteration of plasma membrane permeability appeared at 8h of culture and showed a steady increase over time. It was concluded that plasma membrane permeability and mitochondrial membrane potential could reflect the development and degree of apoptosis，and the combination of these two criteria with nuclear morphology revealed by staining with Hoechst 33258 would be a simple and reliable assay for apoptosis and its progression.
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Key words：apoptosis，flow cytometry
细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义[1]。
细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作用、严重缺氧、高温、某些病毒感染及多种化学毒物损伤都可造成细胞坏死。坏死时，细胞膜、核膜常破损，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集[2]。根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。本文应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16和叠氮钠分别诱导HL-60细胞的凋亡及坏死，在透射电镜和荧光显微镜下观察形态变化，流式细胞术检测FDA、PI及罗丹明123荧光强度的动态变化，以探讨细胞凋亡和坏死时在流式细胞术检测中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。
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1 材料和方法
1.1 细胞培养
人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞由北京医科大学天然药物国家重点实验室提供，本室传代培养。取0.2×106/ml细胞接种于含10%热灭活小牛血清(北京北效农场产品)及100 U/ml青霉毒、100U/ml链霉素的RPMI 1640(Gibco)培养液中，在37℃、含5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。
1.2 细胞凋亡及坏死的诱导
VP-16(连云港制药厂产品950259)在实验前用乙醇新鲜配制成200mmol/L，终浓度为0.6mmol/L，NaN3用蒸馏水制成3mol/L，室温保存，终浓度为30mmol/L。将对数增长期的细胞离心后换液，同时加上述药物处理，在不同作用时间点收集细胞进行形态学观察和流式细胞术检测。
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1.3 透射电镜观察
取20×106个培养细胞，用1%戊二醛迅速原位固定30min，置细胞于离心管中，低速离心后向沉淀中加入1.5%戊二醛继续固定1h，用0.18mol/L蔗糖冲洗液冲洗3次，每次1h，并在冲洗液中过夜，用1%琼脂包埋沉淀的细胞，用1%锇酸后固定2h，冲洗后，用丙酮梯度系列脱水；以100%丙酮与包埋剂(1∶1)混合物37℃浸透3h，Epon 812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，H-500电镜下观察、拍照。
1.4 荧光显微镜观察
Hoechst 33258(Sigma)用蒸馏水配制成1mg/ml，细胞培养液的终浓度为10μg/ml，在37℃下染色30min后，用多聚甲醛固定，将细胞沉淀物涂于玻片上，用指甲油封片进行观察。此外，用Hoechst 33258(1μg/ml)染色7min，用PBS洗涤，然后用PI 5μg/ml再染5min，立即在玻片上观察，分别计数PI+细胞中核形态正常、核浓缩或核碎裂的细胞。
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1.5 流式细胞术检测
荧光染料PI(Sigma)(最大激发光波长540nm，发射光波长625nm)用PBS配制为100μg/ml，4℃避光保存，按5μg/ml终浓度染色，立即用流式细胞术检测，FDA(最大激发光波长494nm，发射光波长517nm)(Sigma)用丙酮新鲜配制为2mg/ml贮备液，按1×106/ml细胞加125μl，使终浓度为0.25mg/ml，孵育5min后，用流式细胞术检测，Rh123(最大激发光波长505nm，发射光波长334nm)(Sigma)用蒸馏水配为1mg/ml贮备液。按1×106/ml细胞加10μl，使终浓度为10μg/ml，37℃孵育30min，然后用PBS洗2次，在流式细胞仪上检测荧光强度。
流式细胞术(FACScan flow cytometry)(Becton Dickinson)系用氩离子激光激发光源，功率15mW，发射光488nm，FDA、Rh123的绿色荧光用530/30nm带通滤片收集，PI发出的红色荧光用585/42nm带通滤片收集，分析细胞数为10 000，荧光强度以对数模式测定。PI染色时，当荧光强度大于对照细胞时认为是PI+，FDA及Rh123染色时，当荧光强度低于对照细胞时，认为染色为阴性，应用Lysys Ⅱ软件(Becton Dickinson)收集、储存、处理数据。
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2 结果
2.1 凋亡细胞的形态变化
培养细胞在凋亡诱导处理的0、4、16小时进行电镜和荧光显微镜观察，与对照(图1A)相比，用VP-16处理后，可见典型的凋亡细胞形态特征，表现为核浓缩或染色质边集，或有核碎裂，但细胞膜、核膜及线粒体形态保持完整(图1B)。NaN3处理细胞的细胞膜及核膜完整性破坏，细胞浆降解，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集(图1C)。在培养的0、2、4、8、16、24小时，用Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态，可见正常细胞核边界规则整齐(图1D)，用VP-16处理后，可见细胞核碎裂(图1E)或浓缩(图1F)，NaN3处理后，可见核形态弥散且不规整(图1G)。
未经处理(0小时)时，85%～90%的细胞核规整且呈圆形，5%有核碎裂，4%～9%有核浓缩，1%细胞核呈不规则形状，对照组在整个培养过程中，各种核形态所占百分比的变化不大。用VP-16或NaN3处理4小时后，核形态比例开始变化，在处理8小时有核浓缩的细胞比例达高峰，然后下降，而核碎裂细胞的比例在24小时达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。在整个培养过程中，VP-16处理者，具有坏死细胞核形态特点的细胞<8%，而用NaN3处理后的细胞，坏死细胞的比例在2～24小时渐渐从5%升高到97%。核碎裂及核浓缩细胞的比例超过对照组(图2)。
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2.2 线粒体跨膜电位的变化
用Rh123染色后，用流式细胞术检测染色细胞的比例(图3a)可见对照组细胞在整个培养过程中，荧光强度无明显变化，在不同时间点均为76%左右，NaN3处理后能使荧光细胞的比例迅速下降，在4h降低50%，而VP-16处理组在16小时才有Rh123荧光强度的变化，表明凋亡细胞线粒体的跨膜电位的下降比坏死细胞要晚。也说明线粒体跨膜电位的降低是随细胞凋亡的发展而渐进的一个过程。
2.3 细胞膜通透性的改变
通过测定FDA和PI荧光强度的变化可反映细胞膜完整性，FDA荧光强度降低，表明细胞内非特异性酯酶活性降低，或细胞膜完整性破坏，荧光从胞浆中外漏，或二者皆有。实验结果表明，NaN3诱导FDA阳性细胞(坏死)的比例低于VP-16处理组(图3b)，VP-16、NaN3两种处理的细胞对PI的摄取在8h之前基本相似，8h后，坏死细胞对PI的摄取在各时间点都高于凋亡细胞(图3c)。在VP-16诱导细胞凋亡的过程中，培养20小时的细胞计数稳定不变。用Hoechst 33258(10μg/ml)和PI 5μg/ml同时染色后，在荧光显微镜下观察PI+且核形态正常的细胞、与有核浓缩或核碎裂的细胞比例。动态观察的结果表明，细胞凋亡时，先有对PI摄取增加，继而为核浓缩、核碎裂。实际上PI+核形态正常细胞数比例在3～6小时达到最高，然后减少，但细胞数并无减少，随后核浓缩细胞比例上升，当核碎裂达最高时，核浓缩比例下降。
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A：对照组(4h)；B：VP-16处理组(4h)，可见核浓缩和染色质核周边集，细胞膜、核膜及线粒体形态完整；C：NaN3处理组(4h)，细胞坏死，细胞膜和核膜的完整性破坏，细胞质降解，染色质呈絮状凝集。Hoechst 33258染色，荧光显微镜下可见，D：对照组细胞核形态规整(8h)；E：VP-16处理组(8h)，可见核碎裂现象；F：VP-16处理组(8h)，可见核浓缩；G：NaN3处理组(8h)，细胞坏死，可见核弥散，形态不规则。
图1 电镜及荧光显微镜下 HL-60细胞凋亡和坏死的形态特征
图2 VP-16和NaN3诱导HL-60细胞凋亡
和坏死的比例变化
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3 讨论
细胞死亡，无论是凋亡还是坏死，都是一个多步骤的连续过程。最终细胞破裂，细胞碎片为巨噬细胞所吞噬，但由于细胞死亡的机制不同，细胞膜、细胞核、细胞器变化的先后次序不同。本文以荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术为研究手段，以VP-16、NaN3分别诱导HL-60细胞的凋亡和坏死。在凋亡和坏死诱导过程的不同时间点动态观察细胞核形态、细胞膜通透性及线粒体膜电位的变化。VP-16是一种拓扑异构酶Ⅱ抑制剂，在临床上广泛用于难治性急性白血病等多种恶性肿瘤的化疗，是一种公认的作用确切的细胞凋亡诱导剂，叠氮钠(NaN3)是作用于氧化呼吸链的一种化学毒物，能引起细胞死亡[3]。与以往的研究一致，凋亡和坏死细胞在透射电镜下清晰可辨，凋亡细胞染色质浓缩、核周边集呈块状或新月形，或有核碎裂，而胞膜完整，线粒体形态正常[4]；坏死细胞的细胞膜及核膜破裂，线粒体肿胀，染色质絮状凝集[5]。Hoechst 33258染色，荧光显微镜下观察区别正常、凋亡和坏死细胞是研究细胞凋亡常用的一种可靠技术方法[6，7]，Rh123是一种阳离子亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，由于活细胞线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，因而能特异地聚集于线粒体[5，6，8]，Rh123荧光强度降低，反映线粒体数量减少和/或线粒体膜电位的降低或丧失。与坏死细胞相比，凋亡细胞的线粒体相对完整，能较长时间地维持其跨膜电位[8]。本实验中，VP-16处理的细胞Rh123荧光强度在8h后开始降低，说明细胞凋亡一定时间后就会出现线粒体的损伤。不过，线粒体损伤的速度和程度比NaN3所致者要慢而且轻。FDA是一种不带电荷的脂质性分子，本身不发荧光，但进入细胞后可被细胞非特异性酯酶水解为荧光素，由于其极性而留存于细胞中，FDA荧光强度降低，表明有细胞损伤，如：非特异性酯酶活性降低或丧失，细胞膜破裂或通透性增高。本研究发现在凋亡或坏死细胞FDA荧光降低与PI荧光升高的动力学变化相似。根据
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a.Rh123荧光强度的变化表示线粒体膜电位的改变；b.FDA荧光强度的变化表示细胞膜通透性的改变；c.PI荧光强度的变化表示细胞膜通透性的改变。
图3 HL-60细胞凋亡和坏死时细胞膜通
透性和线粒体膜电位的动态变化
凋亡和坏死细胞在不同时间点FDA和PI荧光强度的变化，可见8h后坏死细胞细胞膜通透性高于凋亡细胞细胞膜的通透性，坏死细胞线粒体跨膜电位在4h出现急剧下降，达50%；VP-16诱导凋亡时，线粒体跨膜电位在16h有较明显的下降，表明细胞凋亡和坏死都有线粒体跨膜电位的下降，但凋亡细胞线粒体跨膜电位的下降比坏死细胞线粒体跨膜电位的下降速度缓慢，因此，线粒体跨膜电位的变化可以作为检测细胞凋亡的一项指标，同时也可区别凋亡与坏死。关于凋亡细胞细胞膜通透性的变化，有研究发现HL-60细胞及胸腺细胞凋亡的最早变化是对Hoechst 33342的摄取增加[6]。相反Lyons等报道，同样实验条件可见细胞膜对溴乙淀的通透性增高[9]。Swat等报道，凋亡的胸腺细胞不能摄取PI[10]。本研究发现在细胞凋亡的发展过程中，先有细胞膜对PI通透性的增高，随后出现核浓缩，进而形成碎片。从文献报道看，无论何种细胞，在凋亡过程中，可见有部分细胞出现核碎片，而膜对PI并无通透性。因此，膜通透性增高和核碎裂是两个可以同时存在而又独立的事件，动力学特征各异。这可能与引起细胞凋亡的机理不同有关，是一个值得探讨的问题。总之，在凋亡过程中，细胞膜通透性渐渐增高，线粒体跨膜电位下降，结合形态变化特征，可以准确可靠地了解凋亡过程的动态变化。关于细胞膜通透性和线粒体跨膜电位下降的生化机制有待于进一步探讨。
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基金项目：国家自然科学基金(No.39870697，39870845)
作者简介：管增伟，男，博士，助理研究员
参考文献：
[1]Arends MJ，Morris RG， Wyllie AH. Apolipoptosis:the role of the endonuclease. Am J Pathol，1990，136:593—608
[2]Dive C，Gregory CD， Philipps DG，et al. Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis(programmed cell death)by multiparameter flow cytometry. Biochim Biophys Acta，1992，1133:275—285
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[3]Dawson TL，Gores GJ， Nieminem AL，et al. Mitochondria as a source of reactive oxygen species during reductive stress in rat hepatocytes. Am J Physiol，1993，264：c961—c967
[4]Wyllie AH，Kerr JFR，Curie AR. Cell death:the significance of apoptosis. In:International review of cytology. Vol 68. New York:Academic Press，1980，251—306
[5]Kinnaly LW，Tedeschi H，Maloff BL. Use of dyes to estimate the electrical potential of the mitochondrial membrane. Biochemistry，1978，17：3419—3428
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[6]Darzynkiewicz A，Bruno S，del Bino G，et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry，1992，13:795—808
[7]Gregory CD，Dive C，Handerson S，et al. Activation of Epstein Barr virus latent genes protects human B cells from death by apoptosis. Nature，1991，349：612—615
[8]Darzynkiewicz Z，Staino-Coico L，Melamed RM. Increased mitochondrial uptake of rhodamine 123 during lymphocyte stimulation. Proc Natl Acad Sci USA， 1981，78：2383—2387
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[9]Lyons AB，Samuel K，Sanderson A，et al. Simultanious analysis of immunophenotype and apoptosis of murine thymocytes by single laser flow cytometry. Cytometry，1992，13：809—821
[10]Swat S，Ignatowicz L，Kisielow P. Detection of apoptosis of immature CD4+8+ thymocytes by flow cytometry.J Immunol Methods，1991，137：79—87
收稿日期：1999-09-27, 百拇医药
单位：管增伟(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；袁兰(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；杨建如(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；马士良(北京医科大学医药卫生分析中心细胞室，北京 100083)；王盛兰(北京医科大学病理学系)；李勇(北京医科大学中国妇婴保健中心)；杨业鹏(北京医科大学基础学院放射医学教研室)；王起恩(北京医科大学公共卫生学院劳卫教研室)
关键词：细胞凋亡；流式细胞术
卫生研究000208 摘 要：应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16及化学毒物叠氮钠分别诱导HL-60细胞凋亡及坏死，在0、2、4、8、16及24h各时间点，应用Hoechst33258染色，荧光显微镜及透射电镜对核形态进行观察，通过流式细胞术检测二乙酸荧光素(FDA)、罗丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(PI)荧光强度的变化，观察细胞凋亡及坏死过程中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。结果显示：HL-60细胞在VP-16处理4h时核形态开始变化，有核浓缩的细胞比例在8h达高峰，然后下降；核碎裂细胞的比例在24h达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。线粒体跨膜电位在8h后渐渐降低，16h可见明显降低。坏死细胞的线粒体膜电位在4h降低50%，细胞膜通透性也在8h之后出现变化。随处理的时间延长，FDA荧光强度进一步降低，对PI的摄取渐渐升高。结果提示，细胞凋亡过程中细胞膜通透性逐渐增高，线粒体膜电位降低。这两个指标能反映细胞凋亡及其程度，结合对细胞核形态观察，能更准确、可靠地反映细胞凋亡的发展变化。
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分类号：Q244 Q558 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0083-04
Kinetics of plasma membrane and mitochondrial alterations
in HL-60 cells undergoing apoptosis
Guan Zengwei Wang Shenglan Li Yong Yang Yepeng，et al.
(Medical and Pharmaceutical Analysis Center，Beijing Medical University，Beijing 100083，China)
, 百拇医药 Abstract：In the present study，VP16，an inhibitor of topoisomerase Ⅱ，and NaN3，a chemical toxic substance，were used to induce apoptosis and necrosis of HL-60 cells，respectively. Cells were examined by transmission electron microscopy and by fluorecence micrscopy after staining with Hoechst 33258 at 0，2，4，8，16 and 24h of culture. Alterations of fluorescent intensity produced by FDA，Rh 123 and PI were measured by flow cytometry，which reflects sequential changes on plasma membrane permeability and the potential of mitochondrial membrane. The results indicated that the nuclear morphologic alteration of cells treated with VP-16 began at 4 hour of culture and the cells with condensed nucleus culminated at 8h of culture and then reduced with no drop in cell counts，while the percentage of cells with fragmented nuclei reached its maximum at 24h of culture accounting for some 80%. The potential of mitochondrial membrane of of apopototic cells decreased gradually from 8h of culture and showed obvious decline at 16h of culture.In necrotic cells，the potential decreased by 50% at 4h of culture which indicates an earlier and more rapid decline than that in apopototic cells. Alteration of plasma membrane permeability appeared at 8h of culture and showed a steady increase over time. It was concluded that plasma membrane permeability and mitochondrial membrane potential could reflect the development and degree of apoptosis，and the combination of these two criteria with nuclear morphology revealed by staining with Hoechst 33258 would be a simple and reliable assay for apoptosis and its progression.
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Key words：apoptosis，flow cytometry
细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义[1]。
细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作用、严重缺氧、高温、某些病毒感染及多种化学毒物损伤都可造成细胞坏死。坏死时，细胞膜、核膜常破损，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集[2]。根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。本文应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP-16和叠氮钠分别诱导HL-60细胞的凋亡及坏死，在透射电镜和荧光显微镜下观察形态变化，流式细胞术检测FDA、PI及罗丹明123荧光强度的动态变化，以探讨细胞凋亡和坏死时在流式细胞术检测中细胞膜通透性和线粒体膜电位的动态变化。
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1 材料和方法
1.1 细胞培养
人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞由北京医科大学天然药物国家重点实验室提供，本室传代培养。取0.2×106/ml细胞接种于含10%热灭活小牛血清(北京北效农场产品)及100 U/ml青霉毒、100U/ml链霉素的RPMI 1640(Gibco)培养液中，在37℃、含5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。
1.2 细胞凋亡及坏死的诱导
VP-16(连云港制药厂产品950259)在实验前用乙醇新鲜配制成200mmol/L，终浓度为0.6mmol/L，NaN3用蒸馏水制成3mol/L，室温保存，终浓度为30mmol/L。将对数增长期的细胞离心后换液，同时加上述药物处理，在不同作用时间点收集细胞进行形态学观察和流式细胞术检测。
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1.3 透射电镜观察
取20×106个培养细胞，用1%戊二醛迅速原位固定30min，置细胞于离心管中，低速离心后向沉淀中加入1.5%戊二醛继续固定1h，用0.18mol/L蔗糖冲洗液冲洗3次，每次1h，并在冲洗液中过夜，用1%琼脂包埋沉淀的细胞，用1%锇酸后固定2h，冲洗后，用丙酮梯度系列脱水；以100%丙酮与包埋剂(1∶1)混合物37℃浸透3h，Epon 812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，H-500电镜下观察、拍照。
1.4 荧光显微镜观察
Hoechst 33258(Sigma)用蒸馏水配制成1mg/ml，细胞培养液的终浓度为10μg/ml，在37℃下染色30min后，用多聚甲醛固定，将细胞沉淀物涂于玻片上，用指甲油封片进行观察。此外，用Hoechst 33258(1μg/ml)染色7min，用PBS洗涤，然后用PI 5μg/ml再染5min，立即在玻片上观察，分别计数PI+细胞中核形态正常、核浓缩或核碎裂的细胞。
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1.5 流式细胞术检测
荧光染料PI(Sigma)(最大激发光波长540nm，发射光波长625nm)用PBS配制为100μg/ml，4℃避光保存，按5μg/ml终浓度染色，立即用流式细胞术检测，FDA(最大激发光波长494nm，发射光波长517nm)(Sigma)用丙酮新鲜配制为2mg/ml贮备液，按1×106/ml细胞加125μl，使终浓度为0.25mg/ml，孵育5min后，用流式细胞术检测，Rh123(最大激发光波长505nm，发射光波长334nm)(Sigma)用蒸馏水配为1mg/ml贮备液。按1×106/ml细胞加10μl，使终浓度为10μg/ml，37℃孵育30min，然后用PBS洗2次，在流式细胞仪上检测荧光强度。
流式细胞术(FACScan flow cytometry)(Becton Dickinson)系用氩离子激光激发光源，功率15mW，发射光488nm，FDA、Rh123的绿色荧光用530/30nm带通滤片收集，PI发出的红色荧光用585/42nm带通滤片收集，分析细胞数为10 000，荧光强度以对数模式测定。PI染色时，当荧光强度大于对照细胞时认为是PI+，FDA及Rh123染色时，当荧光强度低于对照细胞时，认为染色为阴性，应用Lysys Ⅱ软件(Becton Dickinson)收集、储存、处理数据。
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2 结果
2.1 凋亡细胞的形态变化
培养细胞在凋亡诱导处理的0、4、16小时进行电镜和荧光显微镜观察，与对照(图1A)相比，用VP-16处理后，可见典型的凋亡细胞形态特征，表现为核浓缩或染色质边集，或有核碎裂，但细胞膜、核膜及线粒体形态保持完整(图1B)。NaN3处理细胞的细胞膜及核膜完整性破坏，细胞浆降解，线粒体肿胀，染色质呈絮状凝集(图1C)。在培养的0、2、4、8、16、24小时，用Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态，可见正常细胞核边界规则整齐(图1D)，用VP-16处理后，可见细胞核碎裂(图1E)或浓缩(图1F)，NaN3处理后，可见核形态弥散且不规整(图1G)。
未经处理(0小时)时，85%～90%的细胞核规整且呈圆形，5%有核碎裂，4%～9%有核浓缩，1%细胞核呈不规则形状，对照组在整个培养过程中，各种核形态所占百分比的变化不大。用VP-16或NaN3处理4小时后，核形态比例开始变化，在处理8小时有核浓缩的细胞比例达高峰，然后下降，而核碎裂细胞的比例在24小时达高峰，约占80%，表明核浓缩发生在核碎裂之前。在整个培养过程中，VP-16处理者，具有坏死细胞核形态特点的细胞<8%，而用NaN3处理后的细胞，坏死细胞的比例在2～24小时渐渐从5%升高到97%。核碎裂及核浓缩细胞的比例超过对照组(图2)。
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2.2 线粒体跨膜电位的变化
用Rh123染色后，用流式细胞术检测染色细胞的比例(图3a)可见对照组细胞在整个培养过程中，荧光强度无明显变化，在不同时间点均为76%左右，NaN3处理后能使荧光细胞的比例迅速下降，在4h降低50%，而VP-16处理组在16小时才有Rh123荧光强度的变化，表明凋亡细胞线粒体的跨膜电位的下降比坏死细胞要晚。也说明线粒体跨膜电位的降低是随细胞凋亡的发展而渐进的一个过程。
2.3 细胞膜通透性的改变
通过测定FDA和PI荧光强度的变化可反映细胞膜完整性，FDA荧光强度降低，表明细胞内非特异性酯酶活性降低，或细胞膜完整性破坏，荧光从胞浆中外漏，或二者皆有。实验结果表明，NaN3诱导FDA阳性细胞(坏死)的比例低于VP-16处理组(图3b)，VP-16、NaN3两种处理的细胞对PI的摄取在8h之前基本相似，8h后，坏死细胞对PI的摄取在各时间点都高于凋亡细胞(图3c)。在VP-16诱导细胞凋亡的过程中，培养20小时的细胞计数稳定不变。用Hoechst 33258(10μg/ml)和PI 5μg/ml同时染色后，在荧光显微镜下观察PI+且核形态正常的细胞、与有核浓缩或核碎裂的细胞比例。动态观察的结果表明，细胞凋亡时，先有对PI摄取增加，继而为核浓缩、核碎裂。实际上PI+核形态正常细胞数比例在3～6小时达到最高，然后减少，但细胞数并无减少，随后核浓缩细胞比例上升，当核碎裂达最高时，核浓缩比例下降。
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A：对照组(4h)；B：VP-16处理组(4h)，可见核浓缩和染色质核周边集，细胞膜、核膜及线粒体形态完整；C：NaN3处理组(4h)，细胞坏死，细胞膜和核膜的完整性破坏，细胞质降解，染色质呈絮状凝集。Hoechst 33258染色，荧光显微镜下可见，D：对照组细胞核形态规整(8h)；E：VP-16处理组(8h)，可见核碎裂现象；F：VP-16处理组(8h)，可见核浓缩；G：NaN3处理组(8h)，细胞坏死，可见核弥散，形态不规则。
图1 电镜及荧光显微镜下 HL-60细胞凋亡和坏死的形态特征
图2 VP-16和NaN3诱导HL-60细胞凋亡
和坏死的比例变化
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3 讨论
细胞死亡，无论是凋亡还是坏死，都是一个多步骤的连续过程。最终细胞破裂，细胞碎片为巨噬细胞所吞噬，但由于细胞死亡的机制不同，细胞膜、细胞核、细胞器变化的先后次序不同。本文以荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术为研究手段，以VP-16、NaN3分别诱导HL-60细胞的凋亡和坏死。在凋亡和坏死诱导过程的不同时间点动态观察细胞核形态、细胞膜通透性及线粒体膜电位的变化。VP-16是一种拓扑异构酶Ⅱ抑制剂，在临床上广泛用于难治性急性白血病等多种恶性肿瘤的化疗，是一种公认的作用确切的细胞凋亡诱导剂，叠氮钠(NaN3)是作用于氧化呼吸链的一种化学毒物，能引起细胞死亡[3]。与以往的研究一致，凋亡和坏死细胞在透射电镜下清晰可辨，凋亡细胞染色质浓缩、核周边集呈块状或新月形，或有核碎裂，而胞膜完整，线粒体形态正常[4]；坏死细胞的细胞膜及核膜破裂，线粒体肿胀，染色质絮状凝集[5]。Hoechst 33258染色，荧光显微镜下观察区别正常、凋亡和坏死细胞是研究细胞凋亡常用的一种可靠技术方法[6，7]，Rh123是一种阳离子亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，由于活细胞线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，因而能特异地聚集于线粒体[5，6，8]，Rh123荧光强度降低，反映线粒体数量减少和/或线粒体膜电位的降低或丧失。与坏死细胞相比，凋亡细胞的线粒体相对完整，能较长时间地维持其跨膜电位[8]。本实验中，VP-16处理的细胞Rh123荧光强度在8h后开始降低，说明细胞凋亡一定时间后就会出现线粒体的损伤。不过，线粒体损伤的速度和程度比NaN3所致者要慢而且轻。FDA是一种不带电荷的脂质性分子，本身不发荧光，但进入细胞后可被细胞非特异性酯酶水解为荧光素，由于其极性而留存于细胞中，FDA荧光强度降低，表明有细胞损伤，如：非特异性酯酶活性降低或丧失，细胞膜破裂或通透性增高。本研究发现在凋亡或坏死细胞FDA荧光降低与PI荧光升高的动力学变化相似。根据
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a.Rh123荧光强度的变化表示线粒体膜电位的改变；b.FDA荧光强度的变化表示细胞膜通透性的改变；c.PI荧光强度的变化表示细胞膜通透性的改变。
图3 HL-60细胞凋亡和坏死时细胞膜通
透性和线粒体膜电位的动态变化
凋亡和坏死细胞在不同时间点FDA和PI荧光强度的变化，可见8h后坏死细胞细胞膜通透性高于凋亡细胞细胞膜的通透性，坏死细胞线粒体跨膜电位在4h出现急剧下降，达50%；VP-16诱导凋亡时，线粒体跨膜电位在16h有较明显的下降，表明细胞凋亡和坏死都有线粒体跨膜电位的下降，但凋亡细胞线粒体跨膜电位的下降比坏死细胞线粒体跨膜电位的下降速度缓慢，因此，线粒体跨膜电位的变化可以作为检测细胞凋亡的一项指标，同时也可区别凋亡与坏死。关于凋亡细胞细胞膜通透性的变化，有研究发现HL-60细胞及胸腺细胞凋亡的最早变化是对Hoechst 33342的摄取增加[6]。相反Lyons等报道，同样实验条件可见细胞膜对溴乙淀的通透性增高[9]。Swat等报道，凋亡的胸腺细胞不能摄取PI[10]。本研究发现在细胞凋亡的发展过程中，先有细胞膜对PI通透性的增高，随后出现核浓缩，进而形成碎片。从文献报道看，无论何种细胞，在凋亡过程中，可见有部分细胞出现核碎片，而膜对PI并无通透性。因此，膜通透性增高和核碎裂是两个可以同时存在而又独立的事件，动力学特征各异。这可能与引起细胞凋亡的机理不同有关，是一个值得探讨的问题。总之，在凋亡过程中，细胞膜通透性渐渐增高，线粒体跨膜电位下降，结合形态变化特征，可以准确可靠地了解凋亡过程的动态变化。关于细胞膜通透性和线粒体跨膜电位下降的生化机制有待于进一步探讨。
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基金项目：国家自然科学基金(No.39870697，39870845)
作者简介：管增伟，男，博士，助理研究员
参考文献：
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收稿日期：1999-09-27, 百拇医药