农药混剂联合毒性评价
作者：孙金秀 陈波 姚佩佩
单位：孙金秀(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；姚佩佩(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；陈波(中国协和医科大学94届实习生，现在天坛生物制品公司质监处)
关键词：农药；联合作用；混剂；毒性比
卫生研究000201 摘 要：用Harris法研究了3类杀虫剂(有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯)的二元混剂对大鼠的急性毒性联合作用。涉及的有机磷类农药有：甲基对硫磷、氧乐果、甲胺磷、辛硫磷、敌敌畏、丙溴磷、马拉硫磷、水胺硫磷；拟除虫菊酯类农药有：高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯：氨基甲酸酯类农药有：灭多威、异丙威、速灭威等。有机磷+有机磷或有机磷+拟除虫菊酯混配的结果表明：敌敌畏+氧乐果、甲胺磷+丙溴磷混配时均为相加作用；辛硫磷+甲基对硫磷为拮抗作用；辛硫磷+溴氰菊酯、辛硫磷+高效氯氰菊酯、水胺硫磷+甲氰菊酯、甲基对硫磷+高效氯氰菊酯混配时毒性显著增加并呈现协同作用；辛硫磷+氰戊菊酯等虽属相加作用但毒性也有所增加；唯有溴氰菊酯+敌敌畏也属相加作用但毒性却略有降低。有机磷与氨基甲酸酯混配时马拉硫磷+异丙威呈协同作用，辛硫磷+灭多威、甲胺磷+速灭威属相加作用，但前者毒性有较大增加，后者毒性略有降低，而甲基对硫磷+灭多威呈拮抗作用。从毒代动力学、毒效动力学和所涉及的生化机制对所发生的联合作用的性质进行了讨论，认为有机磷与有机磷、有机磷与氨基甲酸酯类混配出现相加作用的较多，有机磷与拟除虫菊酯混配后则以出现协同作用或毒性增加的情况较多。
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分类号：R139.3 S481.1 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0065-04
Assessment on acute toxicity of combined pesticides
Sun Jinxiu Chen Bo Yao Peipei
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
Abstract：The acute oral toxicity (LD50) of two pesticides combined from 3 categroies of insecticides，i.e. organophosphates(OPs)，pyrethroids and carbamates，was evaluated by Harris method on equal toxicity doses.The OPs compounds studied included:methylparathion，omethoate，methamidophos，phoxim，dichlorvos，profenofos，isocarbophos and malathion;the pyrethroids:α-cypermethrin，deltamethrin，fenvalerate and fenpropathrin;the carbamates:methomyl，isoprocarb and metolcarb.The mixtures of two OPs on the combination of dichlorvos plus omethoate and methamidophos plus profenofos showed additive effects，but methylparathion plus phoxim showed antagonistic effect.Most of the combinations of OPs with pyrethroids showed synergistic effects，such as the mixtures of phoxim plus deltamethrin，phoxim plus α-cypermethrin，methlyparathion plus α-cypermethrin and ioscoarbphos plus fenpropthrin，with the exception of two mixtures showed additive effects:phoxim plus fenvalerate resulting in 1.5 times higher toxicity than expected，while dichlorvos plus deltamethrin resulting in less toxicity than expected.The effects of the mixtures of OPs and carbamates:phoxim plus methomyl and methamidophos plus metolcarb，were all additive，but the mixtures of he methylparathion plus methomyl showed antagonistic effect and malathion plus isoprocarb were synergistic.The biochemical mechanisms of changed toxicity of pesiticides mixtures were disccussed based on their toxicokinetics and toxicodynamics.It was concluded that the combined effects of insecticide mixtures were additive for OPs plus OPs or plus carbamates in most cased，but synergistic for OPs plus pyrethroids.
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Key words： pesticide，combined toxicity，mixture of pesticide,toxicity ratio
多年来，农药中毒一直是我国农民的主要职业危害和农村中公共卫生问题，近年来由于多种病害并存且害虫普遍出现抗药性，农民越来越多地使用混配形式的农药。目前混剂在我国杀虫剂登记品种中占相当大的比例[1]，全国农药中毒报告资料也表明农药混剂中毒逐年增多，严重威胁着生产者和使用者的健康。因此对不同杀虫剂混配后的毒性及其联合作用的机制进行研究，具有十分重要的理论意义和实际意义。
1 材料和方法
1.1 实验材料和配制
1.1.1 试剂品级和来源 试验农药均为工业品级原药。76.5%甲基对硫磷、80%丙溴磷、88%氧乐果、85%敌敌畏由天津农药总厂提供；85%水胺硫磷、90%马拉硫磷、90%甲氰菊酯、84.5%氰戊菊酯、94%高效氯氰菊酯、97%灭多威由北京华戎生物激素厂提供；99%溴氰菊酯由天津艾格福(Agrevo)公司提供；95%速灭威、98%异丙威由上海东风农药厂提供；98%辛硫磷由北京东方农药厂提供；90%甲胺磷由石家庄农药厂提供；吐温80由广州南方化玻公司进口分装；花生油为市售商品。
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1.1.2 配制 除水溶性农药用蒸馏水配制外，其它农药均加入适量吐温80作为助溶剂，搅拌混匀使与农药充分接触，再加入蒸馏水配制成混悬液备用。
1.2 试验动物
Wistar大鼠，清洁级，体重180～220g。由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供。将受试动物按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。
1.3 染毒剂量和方法
1.3.1 染毒剂量 根据统计计算毒性参数的方法，每一项LD50按等比梯度设定5～8剂量组。
1.3.2 染毒方法 动物禁食12h后，单剂一次经口染毒，混剂按等毒所需剂量分别灌胃给药，2次给药间隔8秒，根据“农药登记毒理学试验方法”对染毒大鼠连续观察2周，记录动物症状发生时间、中毒表现、死亡时间和死亡数。
, 百拇医药
1.4 资料的统计分析
1.4.1 LD50的计算 依照Bliss法 计算单剂和混剂的LD50及95%可信限，并获得相应的对数剂量-效应回归方程。
1.4.2 联合作用方式的判断 采用Harris法[2]，根据各单剂的LD50及95%可信限计算混配农药的预期LD50及95%可信限，再计算预期LD50与观察LD50的比值，称毒性比(TR)。TR等于1且预期与观察LD50的95%可信限互相覆盖，为相加作用；TR>1，预期与观察LD50的95%可信限不互相覆盖，为协同作用；TR<1，预期与观察LD50的95%可信限不互相覆盖，为拮抗作用。
2 结果
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2.1 中毒症状
2.1.1 有机磷与有机磷混配 大鼠经口灌服有机磷农药各种单剂后在出现症状的潜伏期、高峰期、死亡、恢复等过程基本相似，不同农药之间只是症状的出现和维持时间及程度上差异，均相继出现流涎、肌束震颤、全身震颤、抽搐、惊厥、出汗、呼吸抑制、紫绀、死亡等典型的胆碱能危象的表现。2种有机磷混配给药与单剂的上述过程相似，在症状的出现时间、持续时间和程度上有差异。需要特别指出的是氧乐果和辛硫磷，混配染毒后约1h出现肌无力、四肢瘫软，可持续2～3天。
2.1.2 有机磷与拟除虫菊酯类混配 动物染毒后一般首先出现胆碱能症状，如流涎、震颤、抽搐等，继而出现Ⅱ型拟除虫菊酯类症状(CS症候群)，其中包括震颤、流涎、步态不稳、肌紧张、舞蹈样扭动、惊厥，并可致死亡。幸存的动物上述症状仍可持续数日。值得指出的是辛硫磷与氰戊菊酯混配给药后出现四肢无力，持续2日后两后肢瘫痪，但可在4日内恢复，提示有一过性肌无力发生，两单剂均未出现上述症状。
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2.1.3 有机磷与氨基甲酸酯类农药混配 与大鼠经口灌服有机磷农药后出现的症状基本相似，但潜伏期、高峰期、死亡、恢复期均明显缩短。
总之，混配农药中毒的症状潜伏期短、死亡较快，但症状持续时间较单剂相对为长。各组死亡动物大体解剖肉眼观察未见明显病变。实验结果见表1、表2。
表1 单剂农药的毒性比较 农药名称
回归方程(1)
LD50
(mg/kgBW)
95%可信限
(mg/kgBW)
等价
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毒性
甲基对硫磷
=1.85+ 3.77X
6.85
5.49～8.57
1.00
辛硫磷(油)=-8.41+ 4.38X
1 150.30
940.93～1 399.64
172.19
, 百拇医药 辛硫磷(水)=-9.80+ 5.36X
573.28
482.71～674.98
83.36
丙溴磷=-31.53+14.28X
320.58
303.65～339.76
46.74
敌敌畏=-4.98+ 6.13X
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42.15
36.71～48.54
6.32
水胺硫磷=-2.38+ 4.81X
34.37
28.74～41.48
5.02
马拉硫磷=-39.86+14.33X
1 352.83
, 百拇医药 1 265.51～1 439.29
197.49
氧乐果=-12.20+ 7.06X
272.42
239.08～308.35
39.77
甲胺磷=-8.09+11.17X
14.87
13.72～15.95
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2.17
高效氯氰菊酯=-19.91+10.53X
231.40
211.90～252.69
34.28
氰戊菊酯=-8.61+ 5.29X
375.10
315.11～445.45
54.51
, 百拇医药
溴氰菊酯=-21.74+ 8.48X
1 424.16
1 296.51～1 576.49
207.91
甲氰菊酯=-4.38+ 6.67X
25.48
22.46～28.93
3.66
异丙威=-6.74+ 4.88X
, 百拇医药
254.74
211.37～305.00
37.19
灭多威=-0.64+ 4.09X
23.96
19.17～29.70
3.50
速灭威=-3.83+ 3.50X
333.89
, 百拇医药 258.57～426.67
50.69
注：(1)为对数剂量与死亡概率之间的关系，为死亡概率，X为农药的对数剂量表2 农药联合作用评价 农药名称
回归方程
斜率
毒性比
(TR)
联合作用
性质
预期LD50
, 百拇医药
(mg/kgBW)
观察LD50
(mg/kgBW)
LD50
95%可信限
LD50
95%可信限
有机磷+有机磷
辛硫磷(水)+甲基对硫磷
10.19
290.07
, 百拇医药 244.10～341.76
477.68
439.15～516.00
0.61
拮抗作用
敌敌畏+氧乐果
8.66
157.29
137.90～196.45
154.54
139.84～170.00
1.02
, 百拇医药
相加作用(1)
甲胺磷+丙溴磷
12.37
167.73
158.69～177.86
196.35
171.89～202.80
0.85
相加作用(1)
有机磷+拟除虫菊酯
甲基对硫磷+高效氯氰菊酯
, 百拇医药
5.50
119.13
108.70～130.61
54.01
45.74～63.73
2.21
协同作用
辛硫磷(油)+溴氰菊酯
4.83
998.72
889.61～1125.74
165.22
, 百拇医药
138.22～196.50
6.04
协同作用
辛硫磷(水)+高效氯氰菊酯
6.40
402.34
347.31～463.83
98.50
86.64～112.17
4.08
协同作用
水胺硫磷+甲氰菊酯
, 百拇医药
9.86
29.92
25.60～35.39
18.73
17.05～20.55
1.60
协同作用
辛硫磷(油)+氰戊菊酯
5.49
762.68
328.02～922.55
507.00
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428.19～600.30
1.50
相加作用(1)
敌敌畏+溴氰菊酯
4.45
733.16
666.62～812.52
960.09
799.79～1176.65
0.76
相加作用(1)
, 百拇医药 有机磷+氨基甲酸酯
甲基对硫磷+灭多威
11.44
15.41
12.33～19.12
21.06
19.41～22.79
0.73
拮抗作用
马拉硫磷+异丙威
4.54
803.79
, 百拇医药
738.44～894.65
435.60
360.99～532.99
1.85
协同作用
辛硫磷(水)+灭多威
5.27
298.62
250.94～352.34
259.19
217.35～309.09
1.15
, 百拇医药
相加作用(1)
甲胺磷+速灭威
6.84
174.38
136.15～221.31
226.82
200.02～259.86
0.77
相加作用(1)
注：(1)预期与观察LD50的95%可信限互相覆盖3 讨论
本研究对国内常用的8种有机磷、4种拟除虫菊酯、3种氨基甲酸酯类农药组成的13对等毒剂量混剂的联合急性毒性作用进行了评价。按Harris法评价的结果表明：在有机磷混剂中辛硫磷+甲基对硫磷呈拮抗作用，甲胺磷+丙溴磷、敌敌畏+氧乐果混配为相加作用；在有机磷与拟除虫菊酯类混配后，除敌敌畏+溴氰菊酯和辛硫磷+氰戊菊酯为相加作用外，其它4对混配均为协同作用；在有机磷和氨基甲酸酯的混剂中，甲基对硫磷+灭多威为拮抗作用，辛硫磷+灭多威、甲胺磷+速灭威为相加作用，马拉硫磷+异丙威为协同作用。
, 百拇医药
从各混剂实测毒性与按Harris法计算的预期毒性相比较，观察到混配后的毒性发生一些改变。本研究所用的3类农药按化学结构均属酯类。这些农药进入机体后即可抑制体内的酯酶系统，如乙酰胆碱酯酶(AchE)，也可与酶结合(B-酯酶等)或被水解(如A-酯酶)[3]。当2种农药同时进入机体后，酯酶体系负荷、应激能力与给予单剂时不同，因此即使按等毒剂量混配后给动物染毒也会引起代谢途径和速率的变化，致使总体毒性发生改变。如Jokanovic等证实，B-酯酶通过水解酯键或通过其活性部位与有机磷酸酯结合的2种机制，在有机磷酸酯解毒过程中起着重要作用[4]。由于各种有机磷酸酯对B-酯酶的亲和力不同，因此在与其他农药混配时就有可能使毒性发生变化。
3.1 有机磷与有机磷混配的联合作用
有机磷与有机磷混配因作用靶位点相同，理应呈相加作用。Keplinger等对101对有机磷与有机磷、有机磷与有机氯进行了联合作用评价，结果为80对有相加作用、9对大于相加作用、12对小于相加作用[5]。曾有人对甲基对硫磷与多种有机磷(蝇毒磷、育畜磷、乐果、敌恶磷、乙拌磷、丰索磷、乙基对硫磷、磷胺、敌百虫)混配毒性进行了研究，也主要呈亚相加作用或是相加作用[6]。敌敌畏与其他22种有机磷杀虫剂混配未呈协同作用，而与马拉硫磷混配呈现明显的增毒作用[7]。这些报告表明有机磷与有机磷混配多为相加作用。本研究结果与上述报告基本一致，我们研究的3对混配中2对为相加作用，仅甲基对硫磷+辛硫磷混配的毒性比为0.61，属拮抗作用。众所周知，单剂有机磷农药主要代谢途径为氧化、水解、谷胱甘肽转移以及代谢产物的结合反应等，各途径处在动态平衡中。就水解作用而言，很多抗胆碱酯酶的有机磷酸酯是由一组被称为A-酯酶或对氧磷酶水解的。该酶存在于血浆和肝内质网中，可通过裂解酸酐键、P-F、P-CN或酯键水解许多有机磷[8]。Sultatos曾证实对硫磷与毒死蜱混合，动物体内产生的对氧磷与对硝基酚减少，表明对硫磷的氧化作用减少；而水解作用、谷胱甘肽转移酶增强，致使脱甲基和脱芳基产物增多，毒性降低，认为可能是毒死蜱抑制了对硫磷的氧化作用[9]。辛硫磷+甲基对硫磷发生拮抗作用的机制，可以从单剂和混剂的对数剂量-效应曲线的斜率改变看出，毒物在达到相同效应时剂量发生了改变。2药单剂的斜率分别为3.77和5.36，等毒混配后的斜率为10.19，这除了生物变异因素以外，提示可能有毒代动力学的变化，即表明毒物在体内的吸收速率和代谢过程发生了变化。根据Sultatos的实验结果，可能除了辛硫磷抑制甲基对硫磷的氧化作用外，还可能与甲基对硫磷竞争肝微粒体氧化酶，致使生成甲基对氧磷减少而转向脱芳基解毒途径。另外，从等价毒性可知，该甲基对硫磷毒性较辛硫磷大83倍，辛硫磷要达到抑制AchE的阈浓度就必需占有较多的活性位点，因此会与甲基对硫磷竞争活性位点，使生成的甲基对氧磷也不能磷酰化AchE，而有机会被A-酯酶水解使总体毒性降低。
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3.2 有机磷与拟除虫菊酯混配的联合作用
本研究涉及的6对有机磷和拟除虫菊酯的混剂中有4对为协同作用：辛硫磷+溴氰菊酯、辛硫磷+高效氯氰菊酯、水胺硫磷+甲氰菊酯、甲基对硫磷+高效氯氰菊酯；辛硫磷+氰戊菊酯混配属相加作用，但毒性是预期毒性的1.5倍；敌敌畏+溴氰菊酯混配也为相加作用，毒性有一定的降低，即所谓亚相加作用(毒性比为0.76)。拟除虫菊酯类在哺乳动物体内主要代谢途径是酯键的水解，其中B-酯酶起着重要的作用，尤其是在经口染毒时可迅速被水解而解毒。此外，Gauhan等也证实哺乳动物的酯酶对有机磷抑制作用十分敏感，酯酶抑制后可使氰戊菊酯毒性增加25倍[10]。也有报道认为，在拟除虫菊酯代谢过程中除了酯酶水解作用外，肝微粒体氧化酶体系的氧化也起到一定的作用。当有机磷与拟除虫菊酯类混配时，有机磷可抑制肝微粒体酶，或与拟除虫菊酯类竞争B-酯酶，或竞争微粒体氧化酶而使拟除虫菊酯类代谢延缓，使拟除虫菊酯毒性增加[11]。这与酯酶受抑制后，拟除虫菊酯的水解减少有关[12]。有人研究了溴氰菊酯与多种有机磷的联合作用性质，其中与氧乐果、敌敌畏、益棉磷混配时毒性增加，而与乙酰甲胺磷、久效磷、磷胺、甲基对硫磷混配时毒性未增加[13]。我们的实验结果也是多呈协同作用，与以往的报道基本一致。但我们研究中，未见敌敌畏与溴氰菊酯混配时毒性增强，与上述报道不一致，分析原因可能与所用药品品级和染毒方式不同有关。我们的药剂为原药并同时给药，文献中用的是乳油，先给敌敌畏，间隔一段时间再给溴氰菊酯。
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拟除虫菊酯类不仅仅是作用于钠离子闸门，还可拮抗γ-氨基丁酸介导的神经系统抑制作用，改变烟碱样胆碱能递质的传递，增加去甲肾上腺素的释放等[14]。另有报道指出某些拟除虫菊酯与乙酰胆碱受体有高度亲和力[15]。与有机磷混配引起的毒性增加是否与上述机制有关尚待研究。
3.3 有机磷与氨基甲酸酯混配的联合作用
本研究涉及的4对有机磷与氨基甲酸酯混配农药中有2对为相加作用，协同和拮抗作用的各1对。氨基甲酸酯类农药与有机磷作用的靶作用点相同，混配后联合作用应属相加。但本研究中甲基对硫磷与灭多威混配后对大鼠急性经口毒性降低(毒性比为0.73)，呈拮抗作用。曾有人报道了乐果与灭多威混配呈拮抗作用[16]。欧晓明等用6种方法研究甲基对硫磷与硫双灭多威对昆虫的毒性，结果均呈拮抗作用[17]。Lange等对氨基甲酸酯能明显降低甲基对硫磷毒性的解释是认为硫代氨基甲酸酯与甲基对硫磷竞争微粒体氧化酶的结果，延缓了甲基对氧磷的生成[18]。而Hayes等认为是硫代氨基甲酸酯暂时占领了AchE的活性位点，因而阻止了甲基对氧磷对AchE的磷酰化作用，使体内对氧磷酶能有机会对甲基对氧磷进行水解[6]。Mansour等对11种有机磷与2种氨基甲酸酯类农药混配进行了研究，结果表明，当2种毒性强的农药混配时，一般会呈现拮抗作用[19]。汤晓勇等对甲基对硫磷与灭多威混配的毒代动力学进行了研究。结果发现两药混配后引起了AchE抑制时间后延，脱烷基代谢物和对硝基酚的生成延后(待发表)，提供了甲基对硫磷和灭多威发生拮抗作用的毒代动力学的依据。
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马拉硫磷与异丙威混配表现出协同作用。关于马拉硫磷与其它农药混配发生协同作用的报告很多，都证实凡能抑制体内马拉硫磷代谢的羧酸酯酶均可增加马拉硫磷的毒性[20]，这可能因羧酸酯酶被抑制后，马拉硫磷分解代谢减慢，致使其能有更多的“机会”使AchE磷酰化。Mansour等认为被增毒的是混剂中的低毒农药，增毒机制是由于高毒农药对解毒酶有较快的亲和反应，与羧酸酯酶或其它酶形成了稳定的底物-酶复合物，从而阻断了解毒酶对低毒化合物的催化作用，使本来毒性低的农药在体内不被代谢而发挥毒性作用[19]。
总之，混剂的毒性改变是农药在体内行为的综合反映，农药混配引起代谢途径的改变常是主要的原因。由于每种农药代谢途径有很大不同，为了对农药混配的联合作用性质作出预测，必须分别进行毒代动力学研究。
目前在联合作用评价中一些方法、术语尚不统一，给资料的比较带来困难。Smyth等用27种毒物作两两配对，组成350对混合物进行联合毒性实验，提出了评价联合作用性质的经验范围(0.4～2.5)[21]，与Keplinger等用于评价联合作用性质的数值范围(0.57～1.75)有很大差别[5]，使同一试验结果得出不同联合作用性质的评价。本研究仅以一个等毒剂量的结果来评价联合作用性质尚不能代表不同配比联合作用性质[22]。而一些设计多个剂量水平的方法正在逐渐被人们所认识[22～24]。此外，在混配选择中还应注意混配农药的选择毒性(大鼠LD50/昆虫LC50)的测定，以便为选择混配农药的种类和配比提供依据。
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基金项目：国家“九五”攻关基金(No.96-906-04-11)
作者简介：孙金秀，男，大学，副研究员
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单位：孙金秀(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；姚佩佩(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；陈波(中国协和医科大学94届实习生，现在天坛生物制品公司质监处)
关键词：农药；联合作用；混剂；毒性比
卫生研究000201 摘 要：用Harris法研究了3类杀虫剂(有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯)的二元混剂对大鼠的急性毒性联合作用。涉及的有机磷类农药有：甲基对硫磷、氧乐果、甲胺磷、辛硫磷、敌敌畏、丙溴磷、马拉硫磷、水胺硫磷；拟除虫菊酯类农药有：高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯：氨基甲酸酯类农药有：灭多威、异丙威、速灭威等。有机磷+有机磷或有机磷+拟除虫菊酯混配的结果表明：敌敌畏+氧乐果、甲胺磷+丙溴磷混配时均为相加作用；辛硫磷+甲基对硫磷为拮抗作用；辛硫磷+溴氰菊酯、辛硫磷+高效氯氰菊酯、水胺硫磷+甲氰菊酯、甲基对硫磷+高效氯氰菊酯混配时毒性显著增加并呈现协同作用；辛硫磷+氰戊菊酯等虽属相加作用但毒性也有所增加；唯有溴氰菊酯+敌敌畏也属相加作用但毒性却略有降低。有机磷与氨基甲酸酯混配时马拉硫磷+异丙威呈协同作用，辛硫磷+灭多威、甲胺磷+速灭威属相加作用，但前者毒性有较大增加，后者毒性略有降低，而甲基对硫磷+灭多威呈拮抗作用。从毒代动力学、毒效动力学和所涉及的生化机制对所发生的联合作用的性质进行了讨论，认为有机磷与有机磷、有机磷与氨基甲酸酯类混配出现相加作用的较多，有机磷与拟除虫菊酯混配后则以出现协同作用或毒性增加的情况较多。
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分类号：R139.3 S481.1 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0065-04
Assessment on acute toxicity of combined pesticides
Sun Jinxiu Chen Bo Yao Peipei
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
Abstract：The acute oral toxicity (LD50) of two pesticides combined from 3 categroies of insecticides，i.e. organophosphates(OPs)，pyrethroids and carbamates，was evaluated by Harris method on equal toxicity doses.The OPs compounds studied included:methylparathion，omethoate，methamidophos，phoxim，dichlorvos，profenofos，isocarbophos and malathion;the pyrethroids:α-cypermethrin，deltamethrin，fenvalerate and fenpropathrin;the carbamates:methomyl，isoprocarb and metolcarb.The mixtures of two OPs on the combination of dichlorvos plus omethoate and methamidophos plus profenofos showed additive effects，but methylparathion plus phoxim showed antagonistic effect.Most of the combinations of OPs with pyrethroids showed synergistic effects，such as the mixtures of phoxim plus deltamethrin，phoxim plus α-cypermethrin，methlyparathion plus α-cypermethrin and ioscoarbphos plus fenpropthrin，with the exception of two mixtures showed additive effects:phoxim plus fenvalerate resulting in 1.5 times higher toxicity than expected，while dichlorvos plus deltamethrin resulting in less toxicity than expected.The effects of the mixtures of OPs and carbamates:phoxim plus methomyl and methamidophos plus metolcarb，were all additive，but the mixtures of he methylparathion plus methomyl showed antagonistic effect and malathion plus isoprocarb were synergistic.The biochemical mechanisms of changed toxicity of pesiticides mixtures were disccussed based on their toxicokinetics and toxicodynamics.It was concluded that the combined effects of insecticide mixtures were additive for OPs plus OPs or plus carbamates in most cased，but synergistic for OPs plus pyrethroids.
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Key words： pesticide，combined toxicity，mixture of pesticide,toxicity ratio
多年来，农药中毒一直是我国农民的主要职业危害和农村中公共卫生问题，近年来由于多种病害并存且害虫普遍出现抗药性，农民越来越多地使用混配形式的农药。目前混剂在我国杀虫剂登记品种中占相当大的比例[1]，全国农药中毒报告资料也表明农药混剂中毒逐年增多，严重威胁着生产者和使用者的健康。因此对不同杀虫剂混配后的毒性及其联合作用的机制进行研究，具有十分重要的理论意义和实际意义。
1 材料和方法
1.1 实验材料和配制
1.1.1 试剂品级和来源 试验农药均为工业品级原药。76.5%甲基对硫磷、80%丙溴磷、88%氧乐果、85%敌敌畏由天津农药总厂提供；85%水胺硫磷、90%马拉硫磷、90%甲氰菊酯、84.5%氰戊菊酯、94%高效氯氰菊酯、97%灭多威由北京华戎生物激素厂提供；99%溴氰菊酯由天津艾格福(Agrevo)公司提供；95%速灭威、98%异丙威由上海东风农药厂提供；98%辛硫磷由北京东方农药厂提供；90%甲胺磷由石家庄农药厂提供；吐温80由广州南方化玻公司进口分装；花生油为市售商品。
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1.1.2 配制 除水溶性农药用蒸馏水配制外，其它农药均加入适量吐温80作为助溶剂，搅拌混匀使与农药充分接触，再加入蒸馏水配制成混悬液备用。
1.2 试验动物
Wistar大鼠，清洁级，体重180～220g。由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供。将受试动物按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。
1.3 染毒剂量和方法
1.3.1 染毒剂量 根据统计计算毒性参数的方法，每一项LD50按等比梯度设定5～8剂量组。
1.3.2 染毒方法 动物禁食12h后，单剂一次经口染毒，混剂按等毒所需剂量分别灌胃给药，2次给药间隔8秒，根据“农药登记毒理学试验方法”对染毒大鼠连续观察2周，记录动物症状发生时间、中毒表现、死亡时间和死亡数。
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1.4 资料的统计分析
1.4.1 LD50的计算 依照Bliss法 计算单剂和混剂的LD50及95%可信限，并获得相应的对数剂量-效应回归方程。
1.4.2 联合作用方式的判断 采用Harris法[2]，根据各单剂的LD50及95%可信限计算混配农药的预期LD50及95%可信限，再计算预期LD50与观察LD50的比值，称毒性比(TR)。TR等于1且预期与观察LD50的95%可信限互相覆盖，为相加作用；TR>1，预期与观察LD50的95%可信限不互相覆盖，为协同作用；TR<1，预期与观察LD50的95%可信限不互相覆盖，为拮抗作用。
2 结果
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2.1 中毒症状
2.1.1 有机磷与有机磷混配 大鼠经口灌服有机磷农药各种单剂后在出现症状的潜伏期、高峰期、死亡、恢复等过程基本相似，不同农药之间只是症状的出现和维持时间及程度上差异，均相继出现流涎、肌束震颤、全身震颤、抽搐、惊厥、出汗、呼吸抑制、紫绀、死亡等典型的胆碱能危象的表现。2种有机磷混配给药与单剂的上述过程相似，在症状的出现时间、持续时间和程度上有差异。需要特别指出的是氧乐果和辛硫磷，混配染毒后约1h出现肌无力、四肢瘫软，可持续2～3天。
2.1.2 有机磷与拟除虫菊酯类混配 动物染毒后一般首先出现胆碱能症状，如流涎、震颤、抽搐等，继而出现Ⅱ型拟除虫菊酯类症状(CS症候群)，其中包括震颤、流涎、步态不稳、肌紧张、舞蹈样扭动、惊厥，并可致死亡。幸存的动物上述症状仍可持续数日。值得指出的是辛硫磷与氰戊菊酯混配给药后出现四肢无力，持续2日后两后肢瘫痪，但可在4日内恢复，提示有一过性肌无力发生，两单剂均未出现上述症状。
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2.1.3 有机磷与氨基甲酸酯类农药混配 与大鼠经口灌服有机磷农药后出现的症状基本相似，但潜伏期、高峰期、死亡、恢复期均明显缩短。
总之，混配农药中毒的症状潜伏期短、死亡较快，但症状持续时间较单剂相对为长。各组死亡动物大体解剖肉眼观察未见明显病变。实验结果见表1、表2。
表1 单剂农药的毒性比较 农药名称
回归方程(1)
LD50
(mg/kgBW)
95%可信限
(mg/kgBW)
等价
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毒性
甲基对硫磷
=1.85+ 3.77X6.85
5.49～8.57
1.00
辛硫磷(油)
=-8.41+ 4.38X1 150.30
940.93～1 399.64
172.19
, 百拇医药 辛硫磷(水)
=-9.80+ 5.36X573.28
482.71～674.98
83.36
丙溴磷
=-31.53+14.28X320.58
303.65～339.76
46.74
敌敌畏
=-4.98+ 6.13X, http://www.100md.com
42.15
36.71～48.54
6.32
水胺硫磷
=-2.38+ 4.81X34.37
28.74～41.48
5.02
马拉硫磷
=-39.86+14.33X1 352.83
, 百拇医药 1 265.51～1 439.29
197.49
氧乐果
=-12.20+ 7.06X272.42
239.08～308.35
39.77
甲胺磷
=-8.09+11.17X14.87
13.72～15.95
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2.17
高效氯氰菊酯
=-19.91+10.53X231.40
211.90～252.69
34.28
氰戊菊酯
=-8.61+ 5.29X375.10
315.11～445.45
54.51
, 百拇医药
溴氰菊酯
=-21.74+ 8.48X1 424.16
1 296.51～1 576.49
207.91
甲氰菊酯
=-4.38+ 6.67X25.48
22.46～28.93
3.66
异丙威
=-6.74+ 4.88X, 百拇医药
254.74
211.37～305.00
37.19
灭多威
=-0.64+ 4.09X23.96
19.17～29.70
3.50
速灭威
=-3.83+ 3.50X333.89
, 百拇医药 258.57～426.67
50.69
注：(1)为对数剂量与死亡概率之间的关系，
为死亡概率，X为农药的对数剂量表2 农药联合作用评价 农药名称回归方程
斜率
毒性比
(TR)
联合作用
性质
预期LD50
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(mg/kgBW)
观察LD50
(mg/kgBW)
LD50
95%可信限
LD50
95%可信限
有机磷+有机磷
辛硫磷(水)+甲基对硫磷
10.19
290.07
, 百拇医药 244.10～341.76
477.68
439.15～516.00
0.61
拮抗作用
敌敌畏+氧乐果
8.66
157.29
137.90～196.45
154.54
139.84～170.00
1.02
, 百拇医药
相加作用(1)
甲胺磷+丙溴磷
12.37
167.73
158.69～177.86
196.35
171.89～202.80
0.85
相加作用(1)
有机磷+拟除虫菊酯
甲基对硫磷+高效氯氰菊酯
, 百拇医药
5.50
119.13
108.70～130.61
54.01
45.74～63.73
2.21
协同作用
辛硫磷(油)+溴氰菊酯
4.83
998.72
889.61～1125.74
165.22
, 百拇医药
138.22～196.50
6.04
协同作用
辛硫磷(水)+高效氯氰菊酯
6.40
402.34
347.31～463.83
98.50
86.64～112.17
4.08
协同作用
水胺硫磷+甲氰菊酯
, 百拇医药
9.86
29.92
25.60～35.39
18.73
17.05～20.55
1.60
协同作用
辛硫磷(油)+氰戊菊酯
5.49
762.68
328.02～922.55
507.00
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428.19～600.30
1.50
相加作用(1)
敌敌畏+溴氰菊酯
4.45
733.16
666.62～812.52
960.09
799.79～1176.65
0.76
相加作用(1)
, 百拇医药 有机磷+氨基甲酸酯
甲基对硫磷+灭多威
11.44
15.41
12.33～19.12
21.06
19.41～22.79
0.73
拮抗作用
马拉硫磷+异丙威
4.54
803.79
, 百拇医药
738.44～894.65
435.60
360.99～532.99
1.85
协同作用
辛硫磷(水)+灭多威
5.27
298.62
250.94～352.34
259.19
217.35～309.09
1.15
, 百拇医药
相加作用(1)
甲胺磷+速灭威
6.84
174.38
136.15～221.31
226.82
200.02～259.86
0.77
相加作用(1)
注：(1)预期与观察LD50的95%可信限互相覆盖3 讨论
本研究对国内常用的8种有机磷、4种拟除虫菊酯、3种氨基甲酸酯类农药组成的13对等毒剂量混剂的联合急性毒性作用进行了评价。按Harris法评价的结果表明：在有机磷混剂中辛硫磷+甲基对硫磷呈拮抗作用，甲胺磷+丙溴磷、敌敌畏+氧乐果混配为相加作用；在有机磷与拟除虫菊酯类混配后，除敌敌畏+溴氰菊酯和辛硫磷+氰戊菊酯为相加作用外，其它4对混配均为协同作用；在有机磷和氨基甲酸酯的混剂中，甲基对硫磷+灭多威为拮抗作用，辛硫磷+灭多威、甲胺磷+速灭威为相加作用，马拉硫磷+异丙威为协同作用。
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从各混剂实测毒性与按Harris法计算的预期毒性相比较，观察到混配后的毒性发生一些改变。本研究所用的3类农药按化学结构均属酯类。这些农药进入机体后即可抑制体内的酯酶系统，如乙酰胆碱酯酶(AchE)，也可与酶结合(B-酯酶等)或被水解(如A-酯酶)[3]。当2种农药同时进入机体后，酯酶体系负荷、应激能力与给予单剂时不同，因此即使按等毒剂量混配后给动物染毒也会引起代谢途径和速率的变化，致使总体毒性发生改变。如Jokanovic等证实，B-酯酶通过水解酯键或通过其活性部位与有机磷酸酯结合的2种机制，在有机磷酸酯解毒过程中起着重要作用[4]。由于各种有机磷酸酯对B-酯酶的亲和力不同，因此在与其他农药混配时就有可能使毒性发生变化。
3.1 有机磷与有机磷混配的联合作用
有机磷与有机磷混配因作用靶位点相同，理应呈相加作用。Keplinger等对101对有机磷与有机磷、有机磷与有机氯进行了联合作用评价，结果为80对有相加作用、9对大于相加作用、12对小于相加作用[5]。曾有人对甲基对硫磷与多种有机磷(蝇毒磷、育畜磷、乐果、敌恶磷、乙拌磷、丰索磷、乙基对硫磷、磷胺、敌百虫)混配毒性进行了研究，也主要呈亚相加作用或是相加作用[6]。敌敌畏与其他22种有机磷杀虫剂混配未呈协同作用，而与马拉硫磷混配呈现明显的增毒作用[7]。这些报告表明有机磷与有机磷混配多为相加作用。本研究结果与上述报告基本一致，我们研究的3对混配中2对为相加作用，仅甲基对硫磷+辛硫磷混配的毒性比为0.61，属拮抗作用。众所周知，单剂有机磷农药主要代谢途径为氧化、水解、谷胱甘肽转移以及代谢产物的结合反应等，各途径处在动态平衡中。就水解作用而言，很多抗胆碱酯酶的有机磷酸酯是由一组被称为A-酯酶或对氧磷酶水解的。该酶存在于血浆和肝内质网中，可通过裂解酸酐键、P-F、P-CN或酯键水解许多有机磷[8]。Sultatos曾证实对硫磷与毒死蜱混合，动物体内产生的对氧磷与对硝基酚减少，表明对硫磷的氧化作用减少；而水解作用、谷胱甘肽转移酶增强，致使脱甲基和脱芳基产物增多，毒性降低，认为可能是毒死蜱抑制了对硫磷的氧化作用[9]。辛硫磷+甲基对硫磷发生拮抗作用的机制，可以从单剂和混剂的对数剂量-效应曲线的斜率改变看出，毒物在达到相同效应时剂量发生了改变。2药单剂的斜率分别为3.77和5.36，等毒混配后的斜率为10.19，这除了生物变异因素以外，提示可能有毒代动力学的变化，即表明毒物在体内的吸收速率和代谢过程发生了变化。根据Sultatos的实验结果，可能除了辛硫磷抑制甲基对硫磷的氧化作用外，还可能与甲基对硫磷竞争肝微粒体氧化酶，致使生成甲基对氧磷减少而转向脱芳基解毒途径。另外，从等价毒性可知，该甲基对硫磷毒性较辛硫磷大83倍，辛硫磷要达到抑制AchE的阈浓度就必需占有较多的活性位点，因此会与甲基对硫磷竞争活性位点，使生成的甲基对氧磷也不能磷酰化AchE，而有机会被A-酯酶水解使总体毒性降低。
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3.2 有机磷与拟除虫菊酯混配的联合作用
本研究涉及的6对有机磷和拟除虫菊酯的混剂中有4对为协同作用：辛硫磷+溴氰菊酯、辛硫磷+高效氯氰菊酯、水胺硫磷+甲氰菊酯、甲基对硫磷+高效氯氰菊酯；辛硫磷+氰戊菊酯混配属相加作用，但毒性是预期毒性的1.5倍；敌敌畏+溴氰菊酯混配也为相加作用，毒性有一定的降低，即所谓亚相加作用(毒性比为0.76)。拟除虫菊酯类在哺乳动物体内主要代谢途径是酯键的水解，其中B-酯酶起着重要的作用，尤其是在经口染毒时可迅速被水解而解毒。此外，Gauhan等也证实哺乳动物的酯酶对有机磷抑制作用十分敏感，酯酶抑制后可使氰戊菊酯毒性增加25倍[10]。也有报道认为，在拟除虫菊酯代谢过程中除了酯酶水解作用外，肝微粒体氧化酶体系的氧化也起到一定的作用。当有机磷与拟除虫菊酯类混配时，有机磷可抑制肝微粒体酶，或与拟除虫菊酯类竞争B-酯酶，或竞争微粒体氧化酶而使拟除虫菊酯类代谢延缓，使拟除虫菊酯毒性增加[11]。这与酯酶受抑制后，拟除虫菊酯的水解减少有关[12]。有人研究了溴氰菊酯与多种有机磷的联合作用性质，其中与氧乐果、敌敌畏、益棉磷混配时毒性增加，而与乙酰甲胺磷、久效磷、磷胺、甲基对硫磷混配时毒性未增加[13]。我们的实验结果也是多呈协同作用，与以往的报道基本一致。但我们研究中，未见敌敌畏与溴氰菊酯混配时毒性增强，与上述报道不一致，分析原因可能与所用药品品级和染毒方式不同有关。我们的药剂为原药并同时给药，文献中用的是乳油，先给敌敌畏，间隔一段时间再给溴氰菊酯。
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拟除虫菊酯类不仅仅是作用于钠离子闸门，还可拮抗γ-氨基丁酸介导的神经系统抑制作用，改变烟碱样胆碱能递质的传递，增加去甲肾上腺素的释放等[14]。另有报道指出某些拟除虫菊酯与乙酰胆碱受体有高度亲和力[15]。与有机磷混配引起的毒性增加是否与上述机制有关尚待研究。
3.3 有机磷与氨基甲酸酯混配的联合作用
本研究涉及的4对有机磷与氨基甲酸酯混配农药中有2对为相加作用，协同和拮抗作用的各1对。氨基甲酸酯类农药与有机磷作用的靶作用点相同，混配后联合作用应属相加。但本研究中甲基对硫磷与灭多威混配后对大鼠急性经口毒性降低(毒性比为0.73)，呈拮抗作用。曾有人报道了乐果与灭多威混配呈拮抗作用[16]。欧晓明等用6种方法研究甲基对硫磷与硫双灭多威对昆虫的毒性，结果均呈拮抗作用[17]。Lange等对氨基甲酸酯能明显降低甲基对硫磷毒性的解释是认为硫代氨基甲酸酯与甲基对硫磷竞争微粒体氧化酶的结果，延缓了甲基对氧磷的生成[18]。而Hayes等认为是硫代氨基甲酸酯暂时占领了AchE的活性位点，因而阻止了甲基对氧磷对AchE的磷酰化作用，使体内对氧磷酶能有机会对甲基对氧磷进行水解[6]。Mansour等对11种有机磷与2种氨基甲酸酯类农药混配进行了研究，结果表明，当2种毒性强的农药混配时，一般会呈现拮抗作用[19]。汤晓勇等对甲基对硫磷与灭多威混配的毒代动力学进行了研究。结果发现两药混配后引起了AchE抑制时间后延，脱烷基代谢物和对硝基酚的生成延后(待发表)，提供了甲基对硫磷和灭多威发生拮抗作用的毒代动力学的依据。
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马拉硫磷与异丙威混配表现出协同作用。关于马拉硫磷与其它农药混配发生协同作用的报告很多，都证实凡能抑制体内马拉硫磷代谢的羧酸酯酶均可增加马拉硫磷的毒性[20]，这可能因羧酸酯酶被抑制后，马拉硫磷分解代谢减慢，致使其能有更多的“机会”使AchE磷酰化。Mansour等认为被增毒的是混剂中的低毒农药，增毒机制是由于高毒农药对解毒酶有较快的亲和反应，与羧酸酯酶或其它酶形成了稳定的底物-酶复合物，从而阻断了解毒酶对低毒化合物的催化作用，使本来毒性低的农药在体内不被代谢而发挥毒性作用[19]。
总之，混剂的毒性改变是农药在体内行为的综合反映，农药混配引起代谢途径的改变常是主要的原因。由于每种农药代谢途径有很大不同，为了对农药混配的联合作用性质作出预测，必须分别进行毒代动力学研究。
目前在联合作用评价中一些方法、术语尚不统一，给资料的比较带来困难。Smyth等用27种毒物作两两配对，组成350对混合物进行联合毒性实验，提出了评价联合作用性质的经验范围(0.4～2.5)[21]，与Keplinger等用于评价联合作用性质的数值范围(0.57～1.75)有很大差别[5]，使同一试验结果得出不同联合作用性质的评价。本研究仅以一个等毒剂量的结果来评价联合作用性质尚不能代表不同配比联合作用性质[22]。而一些设计多个剂量水平的方法正在逐渐被人们所认识[22～24]。此外，在混配选择中还应注意混配农药的选择毒性(大鼠LD50/昆虫LC50)的测定，以便为选择混配农药的种类和配比提供依据。
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基金项目：国家“九五”攻关基金(No.96-906-04-11)
作者简介：孙金秀，男，大学，副研究员
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