金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁成分的定量测定
作者：卞俊 蔡定国 顾明娟 饶光立 曾华武 张兵 陶志华
单位：海军药学专科中心，上海市 200434
关键词：反相高效液相色谱法；金马通络胶囊；东莨菪碱；士的宁
海军医学杂志990221 摘要 目的：建立一种用反相高效液相色谱法检测金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁含量的方法。方法：用C18 ODS柱为固定相。甲醇：水(58：42，V/V)(水相含0.05mol/L醋酸盐缓冲液及0.0025mol/L十二烷基硫酸钠)为流动相。检测波长226nm。结果：该方法回收率为氢溴酸东莨菪碱100.33%，RSD=3.19%(n=5)；士的宁为97.08%，RSD=4.51%(n=5)。结论：该方法操作简便、快捷、专一、准确性好，可用于金马通络胶囊质量控制。
Determination of Scopolamine and Strychnine in
, 百拇医药
Jinmatongluo Capsules by RP-HPLC
Bian Jun, Cai dingguo, Gu Mingjuan, et al
Navy Research Center of Pharmacy, PLA， Shanghai 200433
Abstract Objective:To develop a RP-HPLC method for determining the content of scopolamine and strychnine. Methods: The chromatographic conditions are listed below: Zorbax ODS C18 Column, UV detector at wavelength 226nm, and a mobile phase MeOH-H2O(0.05mol.L-1 acetate buffer solution with 0.0025mol.L-1 Sodium larug sulfate, 58:42 V/V). Results: The rate of recovery for scopolamine and strychnine by this method is 100.3%(RSD 3.19, n=5) and 97.08%(RSD 4.51, n=5) respectively. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and precise.
, 百拇医药
Key words RP-HPLC; Jinmatongluo Capsules; scopolamine; strychnine
金马通络胶囊是由洋金花、马钱子、淫羊藿、西洋参等数味中药组成的复方制剂。具有祛风除湿、温经通络之功效。临床上常用于强直性脊椎炎等症的治疗。因洋金花中东莨菪碱及马钱子中士的宁均为主要有效且有毒成分，必须严格控制其含量。HPLC法用于洋金花药材中东莨菪碱及马钱子药材及其制剂中士的宁的含量测定，已有文献报道[1～3]，但在同一制剂中采用HPLC法同时测定东莨菪碱及士的宁含量未见文献报道。本文建立了反相HPLC法测定金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁含量的方法，获得了满意结果，为金马通络胶囊的质量控制及安全用药提供了有效手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与试药
, 百拇医药
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；SPD-6AV紫外检测器；C-R3A数据处理机；CTO-6A柱温箱；7125型进样器。氢溴酸东莨菪碱和士的宁对照品(定量用)由中国药品生物制品检定所提供；洋金花、马钱子、淫羊藿、西洋参等药材品种符合中国药典规定，购自上海市药材公司；金马通络胶囊(自制)。十二烷基硫酸钠为化学纯，其余试剂均为分析纯。
1.1.2 色谱条件
分析柱：Zorbax ODS C18柱(150mm×6.0mm粒径5μm)，流动相：甲醇：水(58：42，V/V)，水相含0.05mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.60)及0.0025mol/L十二烷基硫酸钠；流速：1ml/min；检测波长 226nm；记录灵敏度：AUFS=0.08；柱温：40℃；进样体积：20μl。在此色谱条件下，东莨菪碱及士的宁色谱图峰形对称，供试品色谱图中东莨菪碱及士的宁能相互达到基线分离，其它杂质成分对其测定结果不产生干扰。见色谱图1。
, 百拇医药
图1 A东莨菪碱及士的宁对照品色谱图
B样品色谱图(a 东莨菪碱 b 士的宁)
1.1.3 供试品溶液制备
取样品内容物1.1g，精密称取，置具塞三角烧瓶中，精密加入氯仿50ml，浓氯试液3ml，轻轻振摇数分钟，室温放置12h以上，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液30ml，置分液漏斗中，用0.25mol/L硫酸提取3次，每次20ml，合并提取液，加浓氯试液中和后，再多加2ml，迅速用氯仿分次振摇提取(20、15、15、15、10ml)，合并氯仿液，回收氯仿至干，残渣加甲醇溶解，转移至5.0ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.5μm)过滤即得。
1.2 方法
1.2.1 提取方法及条件的选择 经加热回流(1、2、3h)提取，超声20、30min提取及冷浸提取比较，结果表明采用冷浸法萃取，氯仿为溶媒，加浓氨试液使生物碱在碱性条件下充分游离并转入氯仿，并对不同冷浸时间(12、24、36h)的萃取效果进行研究，冷浸12h即可将制剂样品中待测成分提取出来。
, 百拇医药
1.2.2 空白试验 取制剂样品、缺洋金花的空白样品、缺马钱子的空白样品和缺洋金花、马钱子粉的空白样品，制成相同浓度的溶液，在相同色谱条件下分别进样，比较以上样品HPLC谱，空白试验结果表明，本法测定对待测成分无干扰，专属性好。见图2。
图2 C缺洋金花、马钱子样品色谱图
D缺马钱子样品色谱图
E缺洋金花样品色谱图(a东莨菪碱 b士的宁)
1.2.3 线性关系的考察 精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品10mg，士的宁对照品15mg，置100ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，稀释至刻度，制成含氢溴酸东莨菪碱0.1g/L及士的宁0.15g/L的对照品溶液，分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml至5.0ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述各溶液，在上述色谱条件下进样20μl，各浓度溶液分别进样3次，以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得回归方程为：氢溴酸东莨菪碱 Y东=6.174X东+0.0482,r=0.9997;士的宁 Y士=16.36X士-0.045，r=0.9994。可见进样量氢溴酸东莨菪碱在0.8～10μg、士的宁在1.66～8.30μg范围内线性关系良好。
, 百拇医药
1.2.4 方法精密度测定 在同一天内5个不同时间及5个不同日期对同一供试品溶液进行测定，分别计算，东莨菪碱日内精密度为RSD=1.35%，日间精密度为RSD=2.31%；士的宁日内精密度为RSD=1.43%，日间精密度为RSD=2.37%。
1.2.5 重现性实验 取制剂样品，按上述拟定方法平行测定6次，结果表明，本方法重现性好，氢溴酸东莨菪碱RSD为3.61%，士的宁RSD为2.80%。
1.2.6 加样回收率实验 采用加样回收法，取已知含量的制剂样品，分别定量加入氢溴酸东莨菪碱及士的宁对照品，按上述拟定方法测定，计算回收率，结果见表1～2。
表1 氢溴酸东莨菪碱回收率测定结果(n=5) 制剂中含量
(mg)
加入量
, http://www.100md.com
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(RSD)
0.2803
0.3326
0.6005
96.26
0.3038
0.3696
, 百拇医药
0.6655
97.85
100.33%
0.2695
0.3696
0.6480
102.40
(3.19%)
0.2952
0.3696
0.6690
101.14
, http://www.100md.com
0.2962
0.3696
0.6805
103.98
表2 士的宁回收率测定结果(n=5) 制剂中含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
, http://www.100md.com 平均回收率
(RSD)
0.9811
0.240
1.2095
95.16
1.0634
0.303
1.3375
90.45
97.08%
1.0184
0.303
, http://www.100md.com
1.3230
100.52
(4.51%)
1.0031
0.505
1.529
98.19
1.0366
0.505
1.547
101.06
2 结 果 取制剂批号为951214、951216、951218样品，按上述拟定方法及色谱条件，分别吸取20μl进样测定，按外标法计算，测得三批样品结果，见表3。
, 百拇医药
表3 三批样品含量测定结果(n=3) 制剂批号
氢溴酸东莨菪碱
士的宁
实测量(mg/g)
RSD(%)
相当标示量(%)
实测量(mg/g)
RSD(%)
相当标示量(%)
951214
0.4631
4.99
, 百拇医药
102.94
1.9947
4.47
99.78
951216
0.4487
3.10
99.73
1.9723
2.32
98.66
951218
0.4717
, 百拇医药
4.67
104.85
1.9981
4.78
99.94
3 讨 论
3.1 检测波长的选择 经紫外扫描测得，氢溴酸东莨菪碱甲醇液最大吸收波长为226nm。士的宁甲醇液最大吸收波长为255nm，东莨菪碱在此波长没有吸收，而士的宁在226nm测定不受影响，故选择226nm作为检测波长同步检测金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁的含量。
3.2 流动相选择 本文在流动相中加入十二烷基硫酸钠作为配对离子，在酸性条件下与生物碱类成分结合成中性离子对，增加其保留值，使性质相似的生物碱类物质东莨菪碱和士的宁及其它杂质成分在反相系统中相互达到基线分离。
, 百拇医药
3.3 制备供试品 其样品氨性氯仿萃取液经硫酸提取后，经氨水碱化用氯仿回收萃取时，氯仿萃取的次数不应少于5次，这样才能充分保证萃取液中士的宁成分充分转移至氯仿中，以减少测定结果的误差。
3.4 本文建立的方法，经同一型号不同色谱柱及不同型号液相色谱仪对同一批号制剂样品检测，其结果基本相符。实验表明，该方法准确、快速、专一且重现性好。
作者简介：饶光立 海军桂林疗养院海军风湿病研究中心
参考文献
1 于霖汇，杨德柱，胡淑贤.反相高效液相色谱法测定洋金花中东莨菪碱含量.中成药，1992，14(8)：35
2 金 斌.反相离子对HPLC法测定洋金花类生药中的东莨菪碱和阿托品.中国药科大学学报，1991，22(3)：181
3 李海生，周静远.马钱子及其制剂中士的宁的HPLC测定法.药物分析杂志，1982，2(6)：326
(收稿：1999-05-10), 百拇医药
单位：海军药学专科中心，上海市 200434
关键词：反相高效液相色谱法；金马通络胶囊；东莨菪碱；士的宁
海军医学杂志990221 摘要 目的：建立一种用反相高效液相色谱法检测金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁含量的方法。方法：用C18 ODS柱为固定相。甲醇：水(58：42，V/V)(水相含0.05mol/L醋酸盐缓冲液及0.0025mol/L十二烷基硫酸钠)为流动相。检测波长226nm。结果：该方法回收率为氢溴酸东莨菪碱100.33%，RSD=3.19%(n=5)；士的宁为97.08%，RSD=4.51%(n=5)。结论：该方法操作简便、快捷、专一、准确性好，可用于金马通络胶囊质量控制。
Determination of Scopolamine and Strychnine in
, 百拇医药
Jinmatongluo Capsules by RP-HPLC
Bian Jun, Cai dingguo, Gu Mingjuan, et al
Navy Research Center of Pharmacy, PLA， Shanghai 200433
Abstract Objective:To develop a RP-HPLC method for determining the content of scopolamine and strychnine. Methods: The chromatographic conditions are listed below: Zorbax ODS C18 Column, UV detector at wavelength 226nm, and a mobile phase MeOH-H2O(0.05mol.L-1 acetate buffer solution with 0.0025mol.L-1 Sodium larug sulfate, 58:42 V/V). Results: The rate of recovery for scopolamine and strychnine by this method is 100.3%(RSD 3.19, n=5) and 97.08%(RSD 4.51, n=5) respectively. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and precise.
, 百拇医药
Key words RP-HPLC; Jinmatongluo Capsules; scopolamine; strychnine
金马通络胶囊是由洋金花、马钱子、淫羊藿、西洋参等数味中药组成的复方制剂。具有祛风除湿、温经通络之功效。临床上常用于强直性脊椎炎等症的治疗。因洋金花中东莨菪碱及马钱子中士的宁均为主要有效且有毒成分，必须严格控制其含量。HPLC法用于洋金花药材中东莨菪碱及马钱子药材及其制剂中士的宁的含量测定，已有文献报道[1～3]，但在同一制剂中采用HPLC法同时测定东莨菪碱及士的宁含量未见文献报道。本文建立了反相HPLC法测定金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁含量的方法，获得了满意结果，为金马通络胶囊的质量控制及安全用药提供了有效手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与试药
, 百拇医药
日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；SPD-6AV紫外检测器；C-R3A数据处理机；CTO-6A柱温箱；7125型进样器。氢溴酸东莨菪碱和士的宁对照品(定量用)由中国药品生物制品检定所提供；洋金花、马钱子、淫羊藿、西洋参等药材品种符合中国药典规定，购自上海市药材公司；金马通络胶囊(自制)。十二烷基硫酸钠为化学纯，其余试剂均为分析纯。
1.1.2 色谱条件
分析柱：Zorbax ODS C18柱(150mm×6.0mm粒径5μm)，流动相：甲醇：水(58：42，V/V)，水相含0.05mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.60)及0.0025mol/L十二烷基硫酸钠；流速：1ml/min；检测波长 226nm；记录灵敏度：AUFS=0.08；柱温：40℃；进样体积：20μl。在此色谱条件下，东莨菪碱及士的宁色谱图峰形对称，供试品色谱图中东莨菪碱及士的宁能相互达到基线分离，其它杂质成分对其测定结果不产生干扰。见色谱图1。
, 百拇医药
图1 A东莨菪碱及士的宁对照品色谱图
B样品色谱图(a 东莨菪碱 b 士的宁)
1.1.3 供试品溶液制备
取样品内容物1.1g，精密称取，置具塞三角烧瓶中，精密加入氯仿50ml，浓氯试液3ml，轻轻振摇数分钟，室温放置12h以上，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液30ml，置分液漏斗中，用0.25mol/L硫酸提取3次，每次20ml，合并提取液，加浓氯试液中和后，再多加2ml，迅速用氯仿分次振摇提取(20、15、15、15、10ml)，合并氯仿液，回收氯仿至干，残渣加甲醇溶解，转移至5.0ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.5μm)过滤即得。
1.2 方法
1.2.1 提取方法及条件的选择 经加热回流(1、2、3h)提取，超声20、30min提取及冷浸提取比较，结果表明采用冷浸法萃取，氯仿为溶媒，加浓氨试液使生物碱在碱性条件下充分游离并转入氯仿，并对不同冷浸时间(12、24、36h)的萃取效果进行研究，冷浸12h即可将制剂样品中待测成分提取出来。
, 百拇医药
1.2.2 空白试验 取制剂样品、缺洋金花的空白样品、缺马钱子的空白样品和缺洋金花、马钱子粉的空白样品，制成相同浓度的溶液，在相同色谱条件下分别进样，比较以上样品HPLC谱，空白试验结果表明，本法测定对待测成分无干扰，专属性好。见图2。
图2 C缺洋金花、马钱子样品色谱图
D缺马钱子样品色谱图
E缺洋金花样品色谱图(a东莨菪碱 b士的宁)
1.2.3 线性关系的考察 精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品10mg，士的宁对照品15mg，置100ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，稀释至刻度，制成含氢溴酸东莨菪碱0.1g/L及士的宁0.15g/L的对照品溶液，分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml至5.0ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述各溶液，在上述色谱条件下进样20μl，各浓度溶液分别进样3次，以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得回归方程为：氢溴酸东莨菪碱 Y东=6.174X东+0.0482,r=0.9997;士的宁 Y士=16.36X士-0.045，r=0.9994。可见进样量氢溴酸东莨菪碱在0.8～10μg、士的宁在1.66～8.30μg范围内线性关系良好。
, 百拇医药
1.2.4 方法精密度测定 在同一天内5个不同时间及5个不同日期对同一供试品溶液进行测定，分别计算，东莨菪碱日内精密度为RSD=1.35%，日间精密度为RSD=2.31%；士的宁日内精密度为RSD=1.43%，日间精密度为RSD=2.37%。
1.2.5 重现性实验 取制剂样品，按上述拟定方法平行测定6次，结果表明，本方法重现性好，氢溴酸东莨菪碱RSD为3.61%，士的宁RSD为2.80%。
1.2.6 加样回收率实验 采用加样回收法，取已知含量的制剂样品，分别定量加入氢溴酸东莨菪碱及士的宁对照品，按上述拟定方法测定，计算回收率，结果见表1～2。
表1 氢溴酸东莨菪碱回收率测定结果(n=5) 制剂中含量
(mg)
加入量
, http://www.100md.com
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(RSD)
0.2803
0.3326
0.6005
96.26
0.3038
0.3696
, 百拇医药
0.6655
97.85
100.33%
0.2695
0.3696
0.6480
102.40
(3.19%)
0.2952
0.3696
0.6690
101.14
, http://www.100md.com
0.2962
0.3696
0.6805
103.98
表2 士的宁回收率测定结果(n=5) 制剂中含量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
, http://www.100md.com 平均回收率
(RSD)
0.9811
0.240
1.2095
95.16
1.0634
0.303
1.3375
90.45
97.08%
1.0184
0.303
, http://www.100md.com
1.3230
100.52
(4.51%)
1.0031
0.505
1.529
98.19
1.0366
0.505
1.547
101.06
2 结 果 取制剂批号为951214、951216、951218样品，按上述拟定方法及色谱条件，分别吸取20μl进样测定，按外标法计算，测得三批样品结果，见表3。
, 百拇医药
表3 三批样品含量测定结果(n=3) 制剂批号
氢溴酸东莨菪碱
士的宁
实测量(mg/g)
RSD(%)
相当标示量(%)
实测量(mg/g)
RSD(%)
相当标示量(%)
951214
0.4631
4.99
, 百拇医药
102.94
1.9947
4.47
99.78
951216
0.4487
3.10
99.73
1.9723
2.32
98.66
951218
0.4717
, 百拇医药
4.67
104.85
1.9981
4.78
99.94
3 讨 论
3.1 检测波长的选择 经紫外扫描测得，氢溴酸东莨菪碱甲醇液最大吸收波长为226nm。士的宁甲醇液最大吸收波长为255nm，东莨菪碱在此波长没有吸收，而士的宁在226nm测定不受影响，故选择226nm作为检测波长同步检测金马通络胶囊中东莨菪碱及士的宁的含量。
3.2 流动相选择 本文在流动相中加入十二烷基硫酸钠作为配对离子，在酸性条件下与生物碱类成分结合成中性离子对，增加其保留值，使性质相似的生物碱类物质东莨菪碱和士的宁及其它杂质成分在反相系统中相互达到基线分离。
, 百拇医药
3.3 制备供试品 其样品氨性氯仿萃取液经硫酸提取后，经氨水碱化用氯仿回收萃取时，氯仿萃取的次数不应少于5次，这样才能充分保证萃取液中士的宁成分充分转移至氯仿中，以减少测定结果的误差。
3.4 本文建立的方法，经同一型号不同色谱柱及不同型号液相色谱仪对同一批号制剂样品检测，其结果基本相符。实验表明，该方法准确、快速、专一且重现性好。
作者简介：饶光立 海军桂林疗养院海军风湿病研究中心
参考文献
1 于霖汇，杨德柱，胡淑贤.反相高效液相色谱法测定洋金花中东莨菪碱含量.中成药，1992，14(8)：35
2 金 斌.反相离子对HPLC法测定洋金花类生药中的东莨菪碱和阿托品.中国药科大学学报，1991，22(3)：181
3 李海生，周静远.马钱子及其制剂中士的宁的HPLC测定法.药物分析杂志，1982，2(6)：326
(收稿：1999-05-10), 百拇医药