豚鼠耳蜗微血管SP受体阳性结构的观察
作者：乔莉 王锦玲 邱建华 刘顺利
单位：第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科(西安710032)
关键词：SP受体；耳蜗；豚鼠
听力学及言语疾病杂志990204
【摘要】 目的 探讨SP(substance P)调节耳蜗血流的作用机理。方法 本研究采用免疫组织化学ABC技术结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色法，观察豚鼠耳蜗微血管SP受体的分布状态。结果 豚鼠耳蜗基底膜各圈均可见SP受体阳性的微血管，阳性结构主要位于血管内膜，呈密度增高的线状分布。结论 作用于耳蜗微血管内膜SP受体的SP，主要来源于血液及内皮细胞自身。
Distribution of Substance P Receptors in the Cochlear Micrangium of Guinea Pig
, http://www.100md.com
Qiao Li,Wang Jinling,Qiu Jianhua,et al.
(Department of Otolaryngology,Xijing Hospital,The Fourth MilitaryMedical University,Xi'an, 710032)
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of substance P (SP) on the regulation of cochlear blood flow.Methods The distribution of SP receptors in the cochlear micrangium of guinea pig were observed with specific rabbit anti-SP receptor antibody by the Avidin-Biotin peroxidase Complex(ABC) immunostaining combined with the glucose oxidase-DAB-nickel enhancemnent technique(ABC-GND method).Results The cochlear micrangia showing the SP receptor positive immunoreactivity existed in every circles of the cochlear basement membrane.The SP receptor immunoreactivity positive material mainly distributed with a high dense linear appearance in the endangium.Conclusion From the above results,it might be possible that the SP,which reacts on the SP receptors in the endangium of cochlear micrangia,come mainly from the blood and the endothelial cells.
, 百拇医药
【Key words】 SP receptor Cochlea Guinea pig
耳蜗微循环的自主调节作用机制主要包括交感神经[1]、感觉神经[2]以及局部的内分泌和神经内分泌作用。Carlis等[3]曾采用免疫荧光法在豚鼠蜗轴螺旋动脉发现有神经肽Y(neuropetide Y，NPY)、SP阳性纤维分布。一般认为，SP既可直接作用于血管平滑肌，又可作为神经递质参与血管运动的调节。在外周血管，SP可通过直接作用于血管上特异的 SP受体，使血管舒张[4]。为进一步探讨SP调节耳蜗血流的作用方式，本研究采用免疫组织化学ABC技术结合葡萄糖氧化酶-DBA-镍染色法，观察豚鼠耳蜗微血管SP受体的分布状态。
1 材料与方法
耳廓反射灵敏、体重300～360克健康白色豚鼠10只，戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，开胸经心插管至升主动脉，先以150 ml生量盐水冲出血液，再用0.01 mol/L磷酸缓冲液(PB，PH7.4)配制的1.33 mol/L多聚甲醛、5 mmol/L戊二醛混合固定液500 ml灌注固定，取出颞骨，剪开听泡，解剖显微镜下暴露膜迷路，1.33 mol/L多聚甲醛4℃下固定12小时，按耳蜗硬铺片法取出Corti器及血管纹，置入25%蔗糖磷酸缓冲液中(4℃)浸泡至沉底。经TritonX-100，甲醇双氧水及牛血清白蛋白处理后，置入兔抗SP受体血清(Shigemoto等[5]，抗体浓度为1 μg/ml)4℃下孵育72小时后，置入Biotin化的羊抗兔IgG血清(1：200，Vector)4℃24小时，每次加入抗体前均用0.01 mol/L PBS(PH7.4)振荡漂洗，最后用GDN法[6]室温下呈色15～20分钟，解剖显微镜下剪断Corti器各圈，去除前庭膜及盖膜，标本裱于涂有明胶的载片上，脱水、透明后DPX封片，Olympus显微镜观察并照相。对照试验用同等稀释度的正常家兔血清及血清稀释液替代第一抗体，其它试剂及步骤不变。
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2 结果
豚鼠耳蜗基底膜各圈均可见SP受体阳性的微血管，主要为蜗轴螺旋动脉中放射状动脉的分支(内螺旋动脉)，阳性结构主要位于血管内膜，呈密度增高的线状分布，较均匀，在血管分支处略有增厚。以耳蜗第二圈微血管内膜SP受体密度最大(图1)，底圈及第三圈微血管次之，顶圈微血管SP受体密度最低(图2)，内螺旋动脉的分支血管SP受体密度明显减低，在耳蜗基底膜第三圈尚可见SP受体阳性的神经纤维沿内螺旋动脉血管长轴的方向走行，与血管分支处形成连接(图3)，血管纹铺片未见SP受体阳性结构。
图1 豚鼠耳蜗第2圈微血管内膜SP受体(
220)
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图2 豚鼠耳蜗顶圈血管SP受体(220)
图3 豚鼠耳蜗第3圈,SP受体阳性神经纤维沿内螺旋动脉长轴走行,与血管分支处形成连接(220)3 讨论
SP作为一种神经肽，具有广泛的生物学效应。近年来，SP在神经系统和非神经系统间的桥接作用越来越引人注目。SP能以神经分泌的方式作用于各种免疫细胞，促进免疫系统的功能，也可作用于血管内皮细胞，调节局部的血流。SP与其它一些肽类物质如血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、脑啡肽(ENK)及降钙素基因相关肽(CGRP)等均在神经细胞体中合成，然后沿轴浆转运而聚集在神经末梢，贮存在突触小体的囊泡中，神经冲动引起离子通道开放，外面钙内流，促使囊泡与突触前膜融合释放SP，与特异性受体结合发挥生物学效应。本研究结果发现，耳蜗微血管内膜有SP受体存在，但血管内膜的SP受体似乎并不与微血管周围的SP能神经释放的SP结合。血管周围SP能神经释放的SP，可直接作用于血管平滑肌上的受体而引起血管反应。但不可能在没有降解的情况下，穿过血管至中膜和基膜而作用于血管内皮的受体发挥生物学效应。推测作用于耳蜗微血管内膜SP受体的SP，主要来源于血液及内皮细胞自身，近几年来，采用免疫细胞化学结合电镜技术，得以在许多血管内皮细胞定位到胆碱乙酰转移酶、SP、5-HT-血管加压素以及血管紧张素Ⅱ(ArgⅡ)的存在。此外还证明血管内皮细胞能够合成ArgⅡ及组胺[7]。表明耳蜗微血管内皮细胞释放SP，再作用于血管内皮细胞的SP受体，可能是对耳蜗血流产生调节作用的方式。
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Mclaren等[8]采用激光多谱勒血流测定技术，观察了豚鼠颈总动脉内灌注SP对血压及耳蜗血管的影响，发现灌注SP后血压下降而耳蜗血流增加，耳蜗神经动作电位及微音器电位无明显的改变。采用小脑前下动脉微灌注SP的方法，血压无变化而耳蜗血流增加。预先应用SP受体特异性拮抗剂(D-Pro 2D-Trp7.9)-SP、可以对抗SP导致的血管扩张反应。这项结果表明，类似于其它的血管活性肽，内源性的SP可与耳蜗微血管相应的特异性受体结合，对耳蜗血流进行调节，而应用辣椒素(capsaicin)诱发感觉神经纤维释放SP，也可使耳蜗的血流量增加[9]。
本研究发现豚鼠耳蜗Corti器各圈基底膜微血管内膜SP受体分布的密度有一定的差异，以第二圈血管内皮SP受体密度为高、一、三圈次之。这种受体密度分布上的差异，提示内源性SP调节耳蜗血流作用，在耳蜗各圈可能不同。Tyagi等[10]曾发现患出血性低血压豚鼠，耳蜗底圈与第二圈血流有明显的差异。这是否与血管活性肽特异性受体分布上的差异有关尚不清楚。在耳蜗第三圈的微血管上，尚发现有SP受体阳性的神经纤维支配微血管及其血管分支处、提示支配耳蜗微血管的神经纤维可能也受到SP的调节，调节血流的作用是在血管分叉上。本研究结果表明了耳蜗微血管的血流调节的复杂性，至少受到神经及局部内分泌的双重调节。
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4 参考文献
1 Laurikainen EA,Kim D,Didier A,et al.Stellate ganglion drives sympathetic regulation of cochlear blood flow.Hear Res,1993,64:199.
2 Quirk WS,Seidman MD,Laurikainen EA,et al.Influence of calcitonin-gene related peptide on cochlear blood flow and electrophysiology.Am J Otol,1994,15:56.
3 Carlis J,Aberdeen J,Forge A,et al.Neural basis for regulation of cochlear blood flow:peptidergic and adrenergic innervation of the spiral modiolar arterty of the guinea pig.Hear Res,1990,43:107.
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4 赵琳.P物质在心血管系统功能调节中的作用.生理科学，1989，9：15.
5 Shigemoto RY,Nakays S,Nomura R,et al.Immunocyto chemical localization of rat substance P reception in the striatum.Neurosci Lett,1993,153:157.
6 Shu SY,Ju G.The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system.Neurosci Lett,1988,85:169.
7 Lincoin J,Loesch A,Burhstodk G.Localization of vasopressin,serotonin and angiotensin Ⅱ in endothelial cells of the renal and mesenteric arteries of the rat .Cell Tissue Res,1990,259:341.
, http://www.100md.com
8 McLaren GM,Quirk WS, Laurikainen E,et al.Substance P increase cochlear blood flow without changing cochlear electrophysiology in rats.Hear Res,1993,71:183.
9 Vass Z,Nuttall AL,Coleman JK,et al.Capsaicin induced release of substance P increase cochlear blood flow in the guinea pig.Hear Res,1995,89:86.
10 Tyagi I,Nakashima T,Ito A,et al.Effect of hemorrhagic hypotension on blood flow to the basal and upper turns of the cochlea.Auris-Nasus-Larynx,1995,22:93.
(1998-08-18收稿 1998-10-26修回), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科(西安710032)
关键词：SP受体；耳蜗；豚鼠
听力学及言语疾病杂志990204
【摘要】 目的 探讨SP(substance P)调节耳蜗血流的作用机理。方法 本研究采用免疫组织化学ABC技术结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色法，观察豚鼠耳蜗微血管SP受体的分布状态。结果 豚鼠耳蜗基底膜各圈均可见SP受体阳性的微血管，阳性结构主要位于血管内膜，呈密度增高的线状分布。结论 作用于耳蜗微血管内膜SP受体的SP，主要来源于血液及内皮细胞自身。
Distribution of Substance P Receptors in the Cochlear Micrangium of Guinea Pig
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Qiao Li,Wang Jinling,Qiu Jianhua,et al.
(Department of Otolaryngology,Xijing Hospital,The Fourth MilitaryMedical University,Xi'an, 710032)
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of substance P (SP) on the regulation of cochlear blood flow.Methods The distribution of SP receptors in the cochlear micrangium of guinea pig were observed with specific rabbit anti-SP receptor antibody by the Avidin-Biotin peroxidase Complex(ABC) immunostaining combined with the glucose oxidase-DAB-nickel enhancemnent technique(ABC-GND method).Results The cochlear micrangia showing the SP receptor positive immunoreactivity existed in every circles of the cochlear basement membrane.The SP receptor immunoreactivity positive material mainly distributed with a high dense linear appearance in the endangium.Conclusion From the above results,it might be possible that the SP,which reacts on the SP receptors in the endangium of cochlear micrangia,come mainly from the blood and the endothelial cells.
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【Key words】 SP receptor Cochlea Guinea pig
耳蜗微循环的自主调节作用机制主要包括交感神经[1]、感觉神经[2]以及局部的内分泌和神经内分泌作用。Carlis等[3]曾采用免疫荧光法在豚鼠蜗轴螺旋动脉发现有神经肽Y(neuropetide Y，NPY)、SP阳性纤维分布。一般认为，SP既可直接作用于血管平滑肌，又可作为神经递质参与血管运动的调节。在外周血管，SP可通过直接作用于血管上特异的 SP受体，使血管舒张[4]。为进一步探讨SP调节耳蜗血流的作用方式，本研究采用免疫组织化学ABC技术结合葡萄糖氧化酶-DBA-镍染色法，观察豚鼠耳蜗微血管SP受体的分布状态。
1 材料与方法
耳廓反射灵敏、体重300～360克健康白色豚鼠10只，戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，开胸经心插管至升主动脉，先以150 ml生量盐水冲出血液，再用0.01 mol/L磷酸缓冲液(PB，PH7.4)配制的1.33 mol/L多聚甲醛、5 mmol/L戊二醛混合固定液500 ml灌注固定，取出颞骨，剪开听泡，解剖显微镜下暴露膜迷路，1.33 mol/L多聚甲醛4℃下固定12小时，按耳蜗硬铺片法取出Corti器及血管纹，置入25%蔗糖磷酸缓冲液中(4℃)浸泡至沉底。经TritonX-100，甲醇双氧水及牛血清白蛋白处理后，置入兔抗SP受体血清(Shigemoto等[5]，抗体浓度为1 μg/ml)4℃下孵育72小时后，置入Biotin化的羊抗兔IgG血清(1：200，Vector)4℃24小时，每次加入抗体前均用0.01 mol/L PBS(PH7.4)振荡漂洗，最后用GDN法[6]室温下呈色15～20分钟，解剖显微镜下剪断Corti器各圈，去除前庭膜及盖膜，标本裱于涂有明胶的载片上，脱水、透明后DPX封片，Olympus显微镜观察并照相。对照试验用同等稀释度的正常家兔血清及血清稀释液替代第一抗体，其它试剂及步骤不变。
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2 结果
豚鼠耳蜗基底膜各圈均可见SP受体阳性的微血管，主要为蜗轴螺旋动脉中放射状动脉的分支(内螺旋动脉)，阳性结构主要位于血管内膜，呈密度增高的线状分布，较均匀，在血管分支处略有增厚。以耳蜗第二圈微血管内膜SP受体密度最大(图1)，底圈及第三圈微血管次之，顶圈微血管SP受体密度最低(图2)，内螺旋动脉的分支血管SP受体密度明显减低，在耳蜗基底膜第三圈尚可见SP受体阳性的神经纤维沿内螺旋动脉血管长轴的方向走行，与血管分支处形成连接(图3)，血管纹铺片未见SP受体阳性结构。
图1 豚鼠耳蜗第2圈微血管内膜SP受体(
220), 百拇医药
图2 豚鼠耳蜗顶圈血管SP受体(
220)图3 豚鼠耳蜗第3圈,SP受体阳性神经纤维沿内螺旋动脉长轴走行,与血管分支处形成连接(
220)3 讨论SP作为一种神经肽，具有广泛的生物学效应。近年来，SP在神经系统和非神经系统间的桥接作用越来越引人注目。SP能以神经分泌的方式作用于各种免疫细胞，促进免疫系统的功能，也可作用于血管内皮细胞，调节局部的血流。SP与其它一些肽类物质如血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、脑啡肽(ENK)及降钙素基因相关肽(CGRP)等均在神经细胞体中合成，然后沿轴浆转运而聚集在神经末梢，贮存在突触小体的囊泡中，神经冲动引起离子通道开放，外面钙内流，促使囊泡与突触前膜融合释放SP，与特异性受体结合发挥生物学效应。本研究结果发现，耳蜗微血管内膜有SP受体存在，但血管内膜的SP受体似乎并不与微血管周围的SP能神经释放的SP结合。血管周围SP能神经释放的SP，可直接作用于血管平滑肌上的受体而引起血管反应。但不可能在没有降解的情况下，穿过血管至中膜和基膜而作用于血管内皮的受体发挥生物学效应。推测作用于耳蜗微血管内膜SP受体的SP，主要来源于血液及内皮细胞自身，近几年来，采用免疫细胞化学结合电镜技术，得以在许多血管内皮细胞定位到胆碱乙酰转移酶、SP、5-HT-血管加压素以及血管紧张素Ⅱ(ArgⅡ)的存在。此外还证明血管内皮细胞能够合成ArgⅡ及组胺[7]。表明耳蜗微血管内皮细胞释放SP，再作用于血管内皮细胞的SP受体，可能是对耳蜗血流产生调节作用的方式。
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Mclaren等[8]采用激光多谱勒血流测定技术，观察了豚鼠颈总动脉内灌注SP对血压及耳蜗血管的影响，发现灌注SP后血压下降而耳蜗血流增加，耳蜗神经动作电位及微音器电位无明显的改变。采用小脑前下动脉微灌注SP的方法，血压无变化而耳蜗血流增加。预先应用SP受体特异性拮抗剂(D-Pro 2D-Trp7.9)-SP、可以对抗SP导致的血管扩张反应。这项结果表明，类似于其它的血管活性肽，内源性的SP可与耳蜗微血管相应的特异性受体结合，对耳蜗血流进行调节，而应用辣椒素(capsaicin)诱发感觉神经纤维释放SP，也可使耳蜗的血流量增加[9]。
本研究发现豚鼠耳蜗Corti器各圈基底膜微血管内膜SP受体分布的密度有一定的差异，以第二圈血管内皮SP受体密度为高、一、三圈次之。这种受体密度分布上的差异，提示内源性SP调节耳蜗血流作用，在耳蜗各圈可能不同。Tyagi等[10]曾发现患出血性低血压豚鼠，耳蜗底圈与第二圈血流有明显的差异。这是否与血管活性肽特异性受体分布上的差异有关尚不清楚。在耳蜗第三圈的微血管上，尚发现有SP受体阳性的神经纤维支配微血管及其血管分支处、提示支配耳蜗微血管的神经纤维可能也受到SP的调节，调节血流的作用是在血管分叉上。本研究结果表明了耳蜗微血管的血流调节的复杂性，至少受到神经及局部内分泌的双重调节。
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4 参考文献
1 Laurikainen EA,Kim D,Didier A,et al.Stellate ganglion drives sympathetic regulation of cochlear blood flow.Hear Res,1993,64:199.
2 Quirk WS,Seidman MD,Laurikainen EA,et al.Influence of calcitonin-gene related peptide on cochlear blood flow and electrophysiology.Am J Otol,1994,15:56.
3 Carlis J,Aberdeen J,Forge A,et al.Neural basis for regulation of cochlear blood flow:peptidergic and adrenergic innervation of the spiral modiolar arterty of the guinea pig.Hear Res,1990,43:107.
, http://www.100md.com
4 赵琳.P物质在心血管系统功能调节中的作用.生理科学，1989，9：15.
5 Shigemoto RY,Nakays S,Nomura R,et al.Immunocyto chemical localization of rat substance P reception in the striatum.Neurosci Lett,1993,153:157.
6 Shu SY,Ju G.The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system.Neurosci Lett,1988,85:169.
7 Lincoin J,Loesch A,Burhstodk G.Localization of vasopressin,serotonin and angiotensin Ⅱ in endothelial cells of the renal and mesenteric arteries of the rat .Cell Tissue Res,1990,259:341.
, http://www.100md.com
8 McLaren GM,Quirk WS, Laurikainen E,et al.Substance P increase cochlear blood flow without changing cochlear electrophysiology in rats.Hear Res,1993,71:183.
9 Vass Z,Nuttall AL,Coleman JK,et al.Capsaicin induced release of substance P increase cochlear blood flow in the guinea pig.Hear Res,1995,89:86.
10 Tyagi I,Nakashima T,Ito A,et al.Effect of hemorrhagic hypotension on blood flow to the basal and upper turns of the cochlea.Auris-Nasus-Larynx,1995,22:93.
(1998-08-18收稿 1998-10-26修回), 百拇医药