电离辐射对小鼠腹腔巨噬细胞POMC转录水平的影响
作者：孙义敏 刘树铮
单位：预防医学院放射生物教研室 吉林 长春130021
关键词：电离辐射；巨噬细胞；POMC；原位杂交
白求恩医科大学学报000207
〔提 要〕 目的：观察75 mGy、2.0 Gy X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞阿黑皮素原(POMC)mRNA转录水平的时程变化。方法：采用地高辛标记碱性磷酸酶显色原位杂交法。结果：阳性细胞胞浆被染成蓝紫色，假照组有POMC mRNA的表达，2.0 Gy照射后不同时间点均未见有POMC的表达。75 mGy照射后从2～8 h表达逐渐增加，8 h达峰值，然后回降到假照水平。结论：低剂量辐射可增强巨噬细胞POMC转录，而高剂量则抑制其表达。
〔中图分类号〕 Q506 〔文献标识码〕 A
, 百拇医药
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0131-03
Effect of irradiation on POMC transcription level in
peritoneal macrophages of mice
Sun Yimin,Liu Shuzheng
(The MH Radiobiology Research Unit,PRC)
〔Abstract〕 Objective:The paper was to investigate the effect of irradiation (75 mGy,2.0 Gy) on the mRNA transcriptional level of POMC in peritoneal macrophages of mice.Methods:In situ hybridization (ISH) was used to examine the changes of POMC mRNA transcription level.Results:The positive cells were stained in blue-purple color.The POMC mRNA transcription was increased from 2 h to 8 h after WBI with 0.075 Gy,returning to the control level at 16 h.No detectable POMC mRNA transcription was found at different time points after WBI with 2 Gy.Conclusion:Low dose irradiation could increase transcription level of POMC in peritoneal MΦ;whereas,high dose radiation could inhibit the POMC mRNA transcription level.
, 百拇医药
〔Key words〕 irradiatoin;macrophages;POMC;in situ hybridization
阿黑皮素原(Proopiomelanocortin,POMC)是多种生物活性肽的前体，在垂体、下丘脑以及免疫细胞中都有合成。由POMC酶解生成促肾上腺素皮质激素(ACTH)和β-内啡肽(β-END)。POMC的衍生肽与神经免疫调节关系密切。我室以往的实验证实，低剂量辐射可使HPA轴功能下调，免疫系统功能增强〔1〕。巨噬细胞是参与免疫反应的重要辅佐细胞，电离辐射对巨噬细胞POMC表达有怎样的影响，国内外均未见报道。本实验用原位杂交的方法观察电离辐射作用后小鼠腹腔巨噬细胞POMC转录水平的时程变化。
1 材料与方法
1.1 动物和分组 雄性健康昆明系小白鼠，由本校实验动物部提供，体重20±2 g。动物随机分为：对照组、方法对照组和照射组，每组3只动物。
, http://www.100md.com
1.2 照射条件 采用Philips深部X线机，剂量≤200 mGy时，剂量率为12.5 mGy/min；剂量>200 mGy时，剂量率为0.287 Gy/min。对照组给予假照射。
1.3 标本制备 见参考文献〔2〕。
1.4 探针标记〔2〕 首先碱裂解法提取POMC质粒，然后用Xhol和DdeⅠ双酶切目的片断，冻融法回收cDNA特异片断。按试剂盒(德国Boehringer Mannbein公司)说明书标记探针。
1.5 原位杂交组织化学方法〔3〕 具体步骤见文献〔2〕。
1.6 方法对照 用25 mg/L RNA酶预处理玻片30 min，使细胞中的mRNA预先被其酶解，再进行杂交，此为阴性对照。另有杂交液对照，其中不含有标记的探针，其它成分及步骤相同。
, http://www.100md.com
1.7 结果观察 计阳性细胞百分率。重复3次实验，取平均值。
2 结 果
阳性细胞的形态特点为胞浆内有蓝紫色颗粒，分布均匀，胞核区无或淡染。假照组有POMC的表达，2.0 Gy照射后不同时间点均未见有POMC的mRNA表达，75 mGy照射后，2～8 h表达增加，16 h后恢复到假照水平。见附表。
3 讨 论
POMC的衍生肽与神经免疫调节关系密切，在人体内分布广泛。现已证实，脑垂体的腺垂体和中间部，下丘脑的弓状核及后交叉区都有明显的POMC基因表达〔4〕。另外，在脑垂体和下丘脑以外的其它组织中如肾上腺、睾丸、脾、肾、卵巢、肺、胸腺、巨噬细胞、外周血细胞、皮肤细胞等也有POMC基因的表达〔5，6〕。
, http://www.100md.com Table Changes of POMC mRNA level in peritoneal macrophages at different time intervals after WBI with 75 mGy X-rays (n=3) Time after
irrad.(t/d)
Number of positive
cells per 100 cells
Sham
25
2
38
4
, 百拇医药
42
8
46
16
20
24
22
近年来，人们对POMC的合成、加工到活性肽的释放这一过程及其调节作了不少研究，其中对其基因表达的调节研究较多，糖皮质激素(GC)抑制下丘脑POMC mRNA的生成。Smith等发现小儿低血糖应激时，下丘脑释放的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)不仅使垂体ACTH分泌增多，而且外周血ACTH阳性白细胞的比率也增高。在人体外周血白细胞培养时，加入CRF，可使ir(immunoreactive)-ACTH和ir-END合成增多。因此，产生ir-ACTH、ir-END的免疫细胞存在着可以表达POMC衍生肽的基因。ir-ACTH和ir-END的合成、分泌均受到CRF的促进和ACTH、END以及皮质激素(Corticosteroid,CS)反馈抑制。Welosk等的工作也证实，用单核细胞的炎性产物IL-1作用于培养的肾上腺细胞，并无促CS生成作用，但可刺激培养的垂体细胞释放ACTH。IL-1具有类CRF的活性，可增加POMC的表达〔7〕。
, 百拇医药
现已证明，激素和递质不是直接作用于POMC基因，而是通过胞内或胞膜上的受体，引发一系列细胞反应，最终才导致POMC基因表达的改变。CRF作用的信号是使细胞内cAMP升高，然后促进POMC基因表达。另外Ca2+也参与对POMC基因表达的调节。在细胞内Ca2+主要通过钙调蛋白和蛋白激酶C发挥作用，钙调蛋白和蛋白激酶C的抑制剂都使POMC mRNA的基础水平下降。
本实验观察了75 mGy和2.0 Gy X射线全身照射后不同时间的POMC mRNA转录水平时程变化。结果显示2.0 Gy照射后不同时间均未见有POMC的mRNA的表达。75 mGy照射后的2～8 h表达增加，16 h时恢复到假照水平。POMC在下丘脑主要分布于弓状核。我室万虹〔8〕报道，低剂量电离辐射作用后首先兴奋中枢神经系统，引起下丘脑cAMP迅速增加，第二信使传递加快，随即诱导c-fos即刻早期基因的转录和表达，抑制POMC的转录。下丘脑内M-EnK、L-EnK含量减少，血清ACTH、CS水平下调可能与此有关。HPA轴的功能下调使机体内环境免疫张力性抑制作用减弱，因而促进免疫功能增强。同时实验证实低剂量辐射可增强免疫器官内POMC的表达，且8 h达峰值，脾脏变化最明显。
, http://www.100md.com
本文的腹腔巨噬细胞实验结果与万虹的免疫器官中POMC基因转录水平的变化有类似趋势。它们发生机理是否相同有待于研究。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39570188)
〔作者简介〕 孙义敏(1967-)，女(回族)，吉林省磐石县人，讲师，医学博士，主要从事电离辐射生物效应学研究。
〔参考文献〕
〔1〕刘树铮.低水平辐射诱导免疫系统兴奋效应的研究现状〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1995，15(4)：217～219.
〔2〕孙义敏，刘树铮.小鼠全身照射后腹腔巨噬细胞TNFα和IL-1β转录水平的变化〔J〕.辐射防护，1998，18(2)：119～125.
〔3〕苏慧慈.原位杂交〔M〕.北京：中国科学技术出版社，1994.72～80.
, 百拇医药
〔4〕Hammer GD,Fairchild Huntress U,Low MJ.Pituitary-specific and homonally regulated gene expression directed by the rat POMC promoter in transgenic mice〔J〕.Mol Endocrinol,1990,4:1689～1697.
〔5〕Stephanou A,Fitzharris P,Knight RA,et al.Characteristics and kinetics of proopiomelanocortin mRNA expression by human leukocytes〔J〕.Brain Beahv Immun,1991,5:319～327.
〔6〕Lyons PD,Blalock JE.Pro-opiomelanocortin gene expression and protein processing in rat mononuclear leukocytes〔J〕.J Neuroimmunol,1997,78(1～2):47～56.
, 百拇医药
〔7〕Melik Parsadaniantz S,Levin N,Lenoir V,et al.Human in interleukin-1 beta:corticotropin releasing factor and ACTH release and gene expression in the male rat:in vivo and in vitro studies〔J〕.J Neurosci Res,1994,37(6):675～682.
〔8〕万 虹，刘树铮.低剂量电离辐射对小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平的影响〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1998，18(3)：217～219.
〔收稿日期〕 1999-06-23, 百拇医药
单位：预防医学院放射生物教研室 吉林 长春130021
关键词：电离辐射；巨噬细胞；POMC；原位杂交
白求恩医科大学学报000207
〔提 要〕 目的：观察75 mGy、2.0 Gy X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞阿黑皮素原(POMC)mRNA转录水平的时程变化。方法：采用地高辛标记碱性磷酸酶显色原位杂交法。结果：阳性细胞胞浆被染成蓝紫色，假照组有POMC mRNA的表达，2.0 Gy照射后不同时间点均未见有POMC的表达。75 mGy照射后从2～8 h表达逐渐增加，8 h达峰值，然后回降到假照水平。结论：低剂量辐射可增强巨噬细胞POMC转录，而高剂量则抑制其表达。
〔中图分类号〕 Q506 〔文献标识码〕 A
, 百拇医药
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0131-03
Effect of irradiation on POMC transcription level in
peritoneal macrophages of mice
Sun Yimin,Liu Shuzheng
(The MH Radiobiology Research Unit,PRC)
〔Abstract〕 Objective:The paper was to investigate the effect of irradiation (75 mGy,2.0 Gy) on the mRNA transcriptional level of POMC in peritoneal macrophages of mice.Methods:In situ hybridization (ISH) was used to examine the changes of POMC mRNA transcription level.Results:The positive cells were stained in blue-purple color.The POMC mRNA transcription was increased from 2 h to 8 h after WBI with 0.075 Gy,returning to the control level at 16 h.No detectable POMC mRNA transcription was found at different time points after WBI with 2 Gy.Conclusion:Low dose irradiation could increase transcription level of POMC in peritoneal MΦ;whereas,high dose radiation could inhibit the POMC mRNA transcription level.
, 百拇医药
〔Key words〕 irradiatoin;macrophages;POMC;in situ hybridization
阿黑皮素原(Proopiomelanocortin,POMC)是多种生物活性肽的前体，在垂体、下丘脑以及免疫细胞中都有合成。由POMC酶解生成促肾上腺素皮质激素(ACTH)和β-内啡肽(β-END)。POMC的衍生肽与神经免疫调节关系密切。我室以往的实验证实，低剂量辐射可使HPA轴功能下调，免疫系统功能增强〔1〕。巨噬细胞是参与免疫反应的重要辅佐细胞，电离辐射对巨噬细胞POMC表达有怎样的影响，国内外均未见报道。本实验用原位杂交的方法观察电离辐射作用后小鼠腹腔巨噬细胞POMC转录水平的时程变化。
1 材料与方法
1.1 动物和分组 雄性健康昆明系小白鼠，由本校实验动物部提供，体重20±2 g。动物随机分为：对照组、方法对照组和照射组，每组3只动物。
, http://www.100md.com
1.2 照射条件 采用Philips深部X线机，剂量≤200 mGy时，剂量率为12.5 mGy/min；剂量>200 mGy时，剂量率为0.287 Gy/min。对照组给予假照射。
1.3 标本制备 见参考文献〔2〕。
1.4 探针标记〔2〕 首先碱裂解法提取POMC质粒，然后用Xhol和DdeⅠ双酶切目的片断，冻融法回收cDNA特异片断。按试剂盒(德国Boehringer Mannbein公司)说明书标记探针。
1.5 原位杂交组织化学方法〔3〕 具体步骤见文献〔2〕。
1.6 方法对照 用25 mg/L RNA酶预处理玻片30 min，使细胞中的mRNA预先被其酶解，再进行杂交，此为阴性对照。另有杂交液对照，其中不含有标记的探针，其它成分及步骤相同。
, http://www.100md.com
1.7 结果观察 计阳性细胞百分率。重复3次实验，取平均值。
2 结 果
阳性细胞的形态特点为胞浆内有蓝紫色颗粒，分布均匀，胞核区无或淡染。假照组有POMC的表达，2.0 Gy照射后不同时间点均未见有POMC的mRNA表达，75 mGy照射后，2～8 h表达增加，16 h后恢复到假照水平。见附表。
3 讨 论
POMC的衍生肽与神经免疫调节关系密切，在人体内分布广泛。现已证实，脑垂体的腺垂体和中间部，下丘脑的弓状核及后交叉区都有明显的POMC基因表达〔4〕。另外，在脑垂体和下丘脑以外的其它组织中如肾上腺、睾丸、脾、肾、卵巢、肺、胸腺、巨噬细胞、外周血细胞、皮肤细胞等也有POMC基因的表达〔5，6〕。
, http://www.100md.com Table Changes of POMC mRNA level in peritoneal macrophages at different time intervals after WBI with 75 mGy X-rays (n=3) Time after
irrad.(t/d)
Number of positive
cells per 100 cells
Sham
25
2
38
4
, 百拇医药
42
8
46
16
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22
近年来，人们对POMC的合成、加工到活性肽的释放这一过程及其调节作了不少研究，其中对其基因表达的调节研究较多，糖皮质激素(GC)抑制下丘脑POMC mRNA的生成。Smith等发现小儿低血糖应激时，下丘脑释放的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)不仅使垂体ACTH分泌增多，而且外周血ACTH阳性白细胞的比率也增高。在人体外周血白细胞培养时，加入CRF，可使ir(immunoreactive)-ACTH和ir-END合成增多。因此，产生ir-ACTH、ir-END的免疫细胞存在着可以表达POMC衍生肽的基因。ir-ACTH和ir-END的合成、分泌均受到CRF的促进和ACTH、END以及皮质激素(Corticosteroid,CS)反馈抑制。Welosk等的工作也证实，用单核细胞的炎性产物IL-1作用于培养的肾上腺细胞，并无促CS生成作用，但可刺激培养的垂体细胞释放ACTH。IL-1具有类CRF的活性，可增加POMC的表达〔7〕。
, 百拇医药
现已证明，激素和递质不是直接作用于POMC基因，而是通过胞内或胞膜上的受体，引发一系列细胞反应，最终才导致POMC基因表达的改变。CRF作用的信号是使细胞内cAMP升高，然后促进POMC基因表达。另外Ca2+也参与对POMC基因表达的调节。在细胞内Ca2+主要通过钙调蛋白和蛋白激酶C发挥作用，钙调蛋白和蛋白激酶C的抑制剂都使POMC mRNA的基础水平下降。
本实验观察了75 mGy和2.0 Gy X射线全身照射后不同时间的POMC mRNA转录水平时程变化。结果显示2.0 Gy照射后不同时间均未见有POMC的mRNA的表达。75 mGy照射后的2～8 h表达增加，16 h时恢复到假照水平。POMC在下丘脑主要分布于弓状核。我室万虹〔8〕报道，低剂量电离辐射作用后首先兴奋中枢神经系统，引起下丘脑cAMP迅速增加，第二信使传递加快，随即诱导c-fos即刻早期基因的转录和表达，抑制POMC的转录。下丘脑内M-EnK、L-EnK含量减少，血清ACTH、CS水平下调可能与此有关。HPA轴的功能下调使机体内环境免疫张力性抑制作用减弱，因而促进免疫功能增强。同时实验证实低剂量辐射可增强免疫器官内POMC的表达，且8 h达峰值，脾脏变化最明显。
, http://www.100md.com
本文的腹腔巨噬细胞实验结果与万虹的免疫器官中POMC基因转录水平的变化有类似趋势。它们发生机理是否相同有待于研究。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39570188)
〔作者简介〕 孙义敏(1967-)，女(回族)，吉林省磐石县人，讲师，医学博士，主要从事电离辐射生物效应学研究。
〔参考文献〕
〔1〕刘树铮.低水平辐射诱导免疫系统兴奋效应的研究现状〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1995，15(4)：217～219.
〔2〕孙义敏，刘树铮.小鼠全身照射后腹腔巨噬细胞TNFα和IL-1β转录水平的变化〔J〕.辐射防护，1998，18(2)：119～125.
〔3〕苏慧慈.原位杂交〔M〕.北京：中国科学技术出版社，1994.72～80.
, 百拇医药
〔4〕Hammer GD,Fairchild Huntress U,Low MJ.Pituitary-specific and homonally regulated gene expression directed by the rat POMC promoter in transgenic mice〔J〕.Mol Endocrinol,1990,4:1689～1697.
〔5〕Stephanou A,Fitzharris P,Knight RA,et al.Characteristics and kinetics of proopiomelanocortin mRNA expression by human leukocytes〔J〕.Brain Beahv Immun,1991,5:319～327.
〔6〕Lyons PD,Blalock JE.Pro-opiomelanocortin gene expression and protein processing in rat mononuclear leukocytes〔J〕.J Neuroimmunol,1997,78(1～2):47～56.
, 百拇医药
〔7〕Melik Parsadaniantz S,Levin N,Lenoir V,et al.Human in interleukin-1 beta:corticotropin releasing factor and ACTH release and gene expression in the male rat:in vivo and in vitro studies〔J〕.J Neurosci Res,1994,37(6):675～682.
〔8〕万 虹，刘树铮.低剂量电离辐射对小鼠下丘脑和免疫器官POMC转录水平的影响〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1998，18(3)：217～219.
〔收稿日期〕 1999-06-23, 百拇医药