体视学定量分析技术在病理学研究中的应用
作者：张桂珍 赵世光 薄立华 崔亚南 刘霆 徐辉
单位：张桂珍 薄立华 崔亚南 刘霆 徐辉(白求恩医大第三临床学院中心研究室 吉林 长春130031)；赵世光(吉林省委干部保健室)
关键词：体视学；病理学；定量分析
白求恩医科大学学报000225
〔中图分类号〕 R319 〔文献标识码〕 A
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0174-05
体视学(Stereology)是由二维结构信息定量推论三维结构信息的一门介于形态学与数学方面的新兴边缘学科。为什么要在形态学科领域引入定量技术，并由此发展形成体视学这一新兴边缘学科?仔细阅读美国、加拿大等著名体视学专家的著作，不论他们的理论多么高深，公式推导多么烦锁，当解释体视学研究的中心问题时，都是建立在最简单的图像分析基础上，往往以通俗易懂的例子说明定性观察的局限性。例如当我们看到一个图形截面，首先会想到它是球体的截面，事实上它是由一个圆柱体给出的横截面；当看到一个直径较大的圆形截面和一个较小的圆形截面时，很容易认为直径较大的代表较大球体，直径较小的代表一个小的球面体，而实际上较大球形截面恰巧是切割一个较小球体的赤道位置给出的，而较小截面则是切割较大球体近切线位置给出的。同理，图像观察中出现的佐勒错觉，埃宾豪斯错觉现象等，使得定性形态描述带有一定主观性，数量概念模糊，有时会得出完全错误的结论。因此，生物学领域形态研究由定性到定量，由二维向三维方向发展是必然趋势。近20年来兴起的体视学技术由于引入数学的理论与方法，减少图像研究中的偏差，使研究结果更趋于客观性和可靠性。体视学的理论基础涉及几何学、概率论、数理统计及曲线、曲面、微积分和拓扑学理论等。对于大多数体视学应用研究者来说，不需要考虑这些复杂的理论及公式推导过程，重要的是注意这些公式的适用条件，正确地分析测试结果和各参数之间的关系。
, 百拇医药
1 生物医学体视学常用的基本参数与测试系统〔1〕
1.1 体视学定量分析的基本参数分四类 ①密度参数：体积密度(Vv)、表面积密度(Sv)、长度密度(Lv)、曲度密度(Kv)、数密度(Nv)；②形状参数：粒子的表面积与体积比(Rsv)、轴比(Rab)、球度(S.g)、平均曲度(
)、平均表面积(
)；③尺寸参数：粒子的平均直径(
)、粒子的平均体积(
)、平均截距(
)、屏障厚度(τ)等；④分布参数：粒子的平均自由程(
)、平均中心距离(
)、粒子分散度(CλZ)、最近邻距离(△3)。应用这些参数，可以对几乎所有生物医学领域学科涉及到的形态学问题进行定量研究，但根据所要定量组织结构特点选用恰当的参数是十分必要的。
, 百拇医药
1.2 体视学定量分析最常用的测试系统 主要有：①方网格测试系统：方网格内纵横交错的实线为测试线，纵横实线之交点为测试点。方网内每个小格边长为d，面积为d2，测试点共x2个(x方网测试系统边长等分为X份)。用PT表示测试系统中的测试点数，LT表示测试线长度，AT表示测试面积，则方网测试系统点、线、面的数量关系式为：
测试点数：PT=X2；
测试线长度：LT=PT。2d；
测试面积：AT=PT。d2。
主要用于测试：Vv、Sv、Rsv、Nv、Lv等。
, 百拇医药
②多能测试系统(见图2)：是由长度为d的散在测试短线，按一定规律排列而成。短线d与同一水平的两个短线端点的间距相等，短线上下间的垂直距离为
。d，上下两条相邻的短线及其端点边线共同构成一个等边平等四边形，其面积为a=。d2，为一个测试点所代表的测试面积。该测试系统点、线、面的关系是：LT=PT。
。d；AT=PT。。d2主要用于测试：Sv、Rsv、Vv、Nv等。
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Fig.1 The measure system of check net
Fig.2 The measure system of various functions
Fig.3 The measure system of Merz curve
1.3 Merz曲线测试系统 见图3。在方网格测试系统内进一步画上直径d等于测试点点间距的半圆环，半圆环按一上一下的规律绘制。每个测试点所对应的测试线长度为
π，对应的测试面积为d2，其点、线、面的关系是：LT=PT。π；AT=PT。d2。
, 百拇医药
主要用于各向同性及各向异性组织结构的Vv、Sv、Rsv、Nv等。
在某种意义上说，应用上述基本参数测试系统可对生物医学光镜、电镜各种各样的图像进行相对准确的测量，应用测试系统对图像进行的手工测量和应用图像分析仪进行测量结果的误差不超过3%。由于这些测试系统均是由著名的体视学家经过多年探索，在科学的体视学基本理论基础上，经过反复验证而创造的，深得广大体视学应用领域学者的欢迎。
2 体视学定量分析技术在病理科研工作中的应用
近十年来，体视学定量分析技术在病理学研究领域中的应用有了突飞猛进的发展，数十次体视学学术会议收集的论文累计达到数千篇，几乎涉及了所有系统、组织、细胞及大部分亚微结构，对推动病理学科理论的发展，发挥了重要的作用，这里仅就我们多年从事这个领域的研究实践作一回顾，用以探讨开展一项体视学定量分析工作之前，如何选择参数和测试系统，如何减小测量误差，如何针对不同的图像优化设计。
, 百拇医药
2.1 胃粘膜G细胞的免疫组织化学定量分析〔2〕 胃粘膜分泌胃泌素细胞(G细胞)是较早被发现消化道内分泌细胞之一，由于其对消化腺的分泌、消化管的运动、甚至植物神经功能状态具有多方面的调节作用，一直受到有关学者的关注。胃窦部G细胞在某些消化道疾病时会发生病理性增生，成为消化道症状产生的重要病理学基础之一。由于G细胞在胃窦粘膜的分布不是均匀的，主要分布在腺颈部，总体上相当于层状结构分布。因此，首先要确定适合采样的方法分层斜向采样。其次，选择G细胞Nv、Vv作为主要参数进行定量测试，结果见图4。
已经报道的G细胞计数资料，一般是对G细胞“最密集区域”测量的结果，由于G细胞数目个体差异大，又受到取材方法和病变因素的影响，难以把握G细胞分布区域的界限，误差较大。应用体视学的分层斜向采样方法，既反映G细胞总的数目变化，又反映病理状态时G细胞分布的特点，并较好地减少了测量误差。
2.2 胃粘膜胆碱能神经终末的超微结构体视学定量分析〔3〕 胃肠道存在相对独立的植物神经系统，主要由肌间神经丛和粘膜下神经丛构成。分布在胃粘膜的神经纤维大多是粘膜下神经丛(Meissner Plexus)的分支，由神经细胞、雪旺氏细胞以及它们的突起组成，雪旺氏细胞的胞浆几乎包裹了所有的神经成分，在神经纤维接近终末的部分迂曲扩张呈小囊状，内含各种递质小泡，称为终末曲张体(Terminal Varicosities)。神经终末与效应细胞间不形成象神经与横纹肌接头部位典型的突触复合体结构，只是富含递质小泡的神经终末接近效应细胞，间隔至少>1 100。由于胃粘膜层神经终末分布不规则，有关人胃粘膜末梢正常走行资料几乎查不到，电镜下寻找病变粘膜的神经终末难度很大。对这样结构比较特殊的组织，我们首先根据体视学公式进行了最佳样本含量的估计，既节省人力物力，又满足统计学要求。
, 百拇医药
Fig.4 The distribution of G cells acquired by gradational measure in gastric mucous membrane
S Surface layer:surface part in mucous；
L Lower layer :the part between the upper 1/3 and lower 2/3；
M Middle layer:betweeen the surface and lower layer
： Piwei Qixu type 
：Pixu Qizhi type
, 百拇医药
最佳样本含量估计的结果表明，在误差不超过2%的条件下，脾胃气虚组需测试33 214个测试点、3 831 μm测试线长、171 μm2测试面积；测试Vv需选取58个视场、Sv需96个视场、Nv需171个视场。而脾虚气滞组如测试25 714个测试点、3 742 μm测试线、140 μm2测试面积；测量45个视场计算Vv、94个视场计算Sv、140个视场计算Nv，可使测量误差小于1%。
Ach小泡定量分析的结果表明，所测量的四个体视学参数均以脾虚气滞组明显升高，与脾胃气虚组比较，P<0.001。
由于选择了最佳样本含量，选取稳定的包容空间，使难度较大的超微结构突触小泡的定量测试取得客观而可靠的结果。
2.3 克山病患者胰岛损害的免疫组织化学图像分析〔4〕 克山病(KD)的心肌损害是在长期慢性代谢障碍的基础上，又有一过性急剧缺血、缺氧条件而诱发的心肌坏死。20世纪90年代中期，我们从胰岛素对心肌细胞代谢的重要作用中受到启发，提出KD时胰岛损害是否参与KD心肌坏死的发病过程问题，并由此确立了KD胰岛损害问题的研究。我们选择了62例克山病患者尸检胰腺蜡块样本，切片厚度5 μm，经过对KD患者胰岛病变的仔细观察，选择了6个参数作为测试指标并应用图像分析系统进行了测试，其结果见图5。
, 百拇医药
测试首次证实了克山病患者胰岛存在多项参数的异常，提示胰岛损害可能参与克山病心肌坏死链式发展过程。提高定量分析研究质量的关键在于根据组织病变的特点设计定量分析参数，使测试的结果从多方面反映病变的特征与规律〔5〕。
2.4 神经肌肉疾病活检肌组织中巨噬细胞Chymase免疫组织化学定量研究〔6〕 神经肌肉疾病是一组主要以肌肉组织进行性萎缩为主要病变特点的疾病，多由染色体异常所致，一直缺乏有效的治疗措施。1995～1997年间，我们与日本学者合作研究了40例不同类型的肌萎缩患者，观察了其活检肌肉样本组织内巨噬细胞表面标志-Chymase(胰凝乳蛋白酶样蛋白酶)的定位和定量。定量时用NIH图像分析系统测试计算出每平方毫米切片中含有Chymase阳性的细胞数目，测试结果见图6。
Fig.5 The immunohistochemical quantitative analysis of islet lesions in the patients with Keshan disease
, 百拇医药
I+P:The ratio of insulin staining positive area to pancreatic area (%);I+/Is:The ratio of insulin staining positive area to islet area (%);In+A:The average insulin staining positive area in each islet (μm2×10);IsA:The average islet area (μm2×10);NA:The islet number on unit pancreatic area (No./mm2);SF:Shape factor (the ratio of perimeter to area of islet).
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Fig.6 The quantitation analysis of chymase positive cell in diseased human skeletal muscle
研究结果表明，正常肌组织内Chymase阳性巨噬细胞数少于不同类型的肌萎缩性疾患；DMD、BMD、DMRV时，Chymase阳性细胞往往较多，我们还进一步做了与细胞凋亡相关蛋白的免疫组化染色，其结果表明Chymase阳性巨噬细胞的分布与ubiquitin阳性细胞一致，与Fas抗原、Bcl-2、HLA-ABC、HLA-DR、Granzeme A等无相关性。
本研究结果表明Chymase阳性的巨噬细胞在肌萎缩的发生、发展过程中可能起重要作用，提示应用抗Chymase药物，例如应用胆碱酯酶抑制剂治疗进行性肌萎缩，可能收到较满意的疗效。本研究结果也暗示单核吞噬细胞以及相关的免疫系统功能异常可能参与了肌萎缩的发病机理，进一步研究肌萎缩时免疫系统功能状态与肌肉萎缩进展的关系，有可能为此类疾病的病因及发病机理提供重要科学依据。
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2.5 病变骨骼肌细胞核超微结构的定量分析-与细胞凋亡相关变化的研究 为了进一步探讨神经肌肉疾病时，肌肉组织的病变进展与细胞凋亡的内在联系，我们应用超微结构定量分析方法研究了25例神经肌肉样本肌纤维细胞核的改变。电镜放大照片6 000倍，每一病例随机选取50个肌纤维细胞核进行测量。应用NIH电子计算机图像分析系统对细胞核总面积及细胞核内高电子密度区(染色质)进行测试，计算高电子密度区与细胞核总面积的百分比，定量分析结果见附表。
Table Size and dark area of nucleus in the pathologic human skeletal muscle fiber estimated transmission EM Diseases
Cases
Nuclear size
(A/μm2)
, 百拇医药
Dark area
(%)
Control
6
9.16±45.5
3.53±9.8
DMD
1
29.34±30.2
12.14±9.9
BMD
3
8.68±49.9
, 百拇医药
4.82±12.1
LG-D
2
9.97±47.3
4.03±8.9
FSH-D
2
8.26±45.9
3.35±7.9
DMRV
3
11.55±40.3
, 百拇医药 6.94±10.0
MyD
4
9.41±45.1
4.59±8.5
MyC
1
6.58±28.7
2.18±11.4
MtD
2
9.33±47.0
5.25±11.6
, 百拇医药
PM/DM
2
8.94±53.1
3.93±6.8
IBM
1
9.51±45.0
4.29±9.7
SBMA
2
13.56±34.0
5.20±12.1
, 百拇医药 本研究结果表明，神经肌肉疾患时肌纤维核染色质的变化，符合细胞凋亡染色质改变的电镜形态学特点，与其它学者在心肌细胞所观察到的凋亡变化相类似。提示横纹肌纤维凋亡时，细胞核超微结构的变化规律同心肌组织基本一致，并且细胞凋亡最明显的形态学特征-染色质聚积在不同的疾患差别较大，提示凋亡与某些神经肌肉疾患的病因与发病机理可能存在一定联系，但由于较大的标准差，所得结果未能表现出统计学意义。提示对于横纹肌纤维细胞核进行有关定量研究时，应对细胞核的纵、横断面分别进行研究。骨骼肌细胞核为长椭圆形，其纵、横断面的直径、面积存在数倍的差异，往往存在较大标准差而影响统计结果，掩盖所含有意义的信息。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39470612，39870667)
〔作者简介〕 张桂珍(1955-)，女，吉林省德惠县人，教授，医学博士，1995年赴日本爱知医科大学留学，主要从事微量营养素与胰岛、心肌细胞保护研究。
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〔参考文献〕
〔1〕申 洪，沈忠英.实用生物体视学技术〔M〕.广州：中山大学出版社，1991.26～53.
〔2〕张桂珍，王纪芳，李 织，等.脾虚症患者胃窦G细胞体视学定量分析〔J〕.中西医结合杂志，1989，9(12)：711～713.
〔3〕张桂珍，李 织，王纪芳，等.脾虚症患者胃粘膜胆碱能神经终末的形态变化与机能意义的探讨〔J〕.中国医药学报，1989，4(6)：6～9.
〔4〕张桂珍，李 才，李广生，等.克山病患者胰岛损害的病理图像定量分析〔J〕.中国地方病防治杂志，1995，10(2)：77～79.
〔5〕张桂珍，李广生，崔亚南，等.硒缺乏大鼠胰岛损害的免疫组织化学图像分析〔J〕.营养学报，1996，18(1)：71～75.
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〔6〕Zhang Guizhen,Ko Sahashi.Immunostaining of chymast in the mast cell in human dystrophic skeletal muscle〔J〕.J Aich Med Univ,1997,25(10):52～60.
〔7〕Zhang Guizhen,Ko Sahashi,Tohru Ibi.Ultrastructure and quantitation of pathological human skeletal muscle nuxlens〔J〕.J Aich Med Univ,1997,25(10):45.
〔收稿日期〕 1999-06-13, 百拇医药
单位：张桂珍 薄立华 崔亚南 刘霆 徐辉(白求恩医大第三临床学院中心研究室 吉林 长春130031)；赵世光(吉林省委干部保健室)
关键词：体视学；病理学；定量分析
白求恩医科大学学报000225
〔中图分类号〕 R319 〔文献标识码〕 A
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0174-05
体视学(Stereology)是由二维结构信息定量推论三维结构信息的一门介于形态学与数学方面的新兴边缘学科。为什么要在形态学科领域引入定量技术，并由此发展形成体视学这一新兴边缘学科?仔细阅读美国、加拿大等著名体视学专家的著作，不论他们的理论多么高深，公式推导多么烦锁，当解释体视学研究的中心问题时，都是建立在最简单的图像分析基础上，往往以通俗易懂的例子说明定性观察的局限性。例如当我们看到一个图形截面，首先会想到它是球体的截面，事实上它是由一个圆柱体给出的横截面；当看到一个直径较大的圆形截面和一个较小的圆形截面时，很容易认为直径较大的代表较大球体，直径较小的代表一个小的球面体，而实际上较大球形截面恰巧是切割一个较小球体的赤道位置给出的，而较小截面则是切割较大球体近切线位置给出的。同理，图像观察中出现的佐勒错觉，埃宾豪斯错觉现象等，使得定性形态描述带有一定主观性，数量概念模糊，有时会得出完全错误的结论。因此，生物学领域形态研究由定性到定量，由二维向三维方向发展是必然趋势。近20年来兴起的体视学技术由于引入数学的理论与方法，减少图像研究中的偏差，使研究结果更趋于客观性和可靠性。体视学的理论基础涉及几何学、概率论、数理统计及曲线、曲面、微积分和拓扑学理论等。对于大多数体视学应用研究者来说，不需要考虑这些复杂的理论及公式推导过程，重要的是注意这些公式的适用条件，正确地分析测试结果和各参数之间的关系。
, 百拇医药
1 生物医学体视学常用的基本参数与测试系统〔1〕
1.1 体视学定量分析的基本参数分四类 ①密度参数：体积密度(Vv)、表面积密度(Sv)、长度密度(Lv)、曲度密度(Kv)、数密度(Nv)；②形状参数：粒子的表面积与体积比(Rsv)、轴比(Rab)、球度(S.g)、平均曲度(
)、平均表面积()；③尺寸参数：粒子的平均直径()、粒子的平均体积()、平均截距()、屏障厚度(τ)等；④分布参数：粒子的平均自由程()、平均中心距离()、粒子分散度(CλZ)、最近邻距离(△3)。应用这些参数，可以对几乎所有生物医学领域学科涉及到的形态学问题进行定量研究，但根据所要定量组织结构特点选用恰当的参数是十分必要的。, 百拇医药
1.2 体视学定量分析最常用的测试系统 主要有：①方网格测试系统：方网格内纵横交错的实线为测试线，纵横实线之交点为测试点。方网内每个小格边长为d，面积为d2，测试点共x2个(x方网测试系统边长等分为X份)。用PT表示测试系统中的测试点数，LT表示测试线长度，AT表示测试面积，则方网测试系统点、线、面的数量关系式为：
测试点数：PT=X2；
测试线长度：LT=PT。2d；
测试面积：AT=PT。d2。
主要用于测试：Vv、Sv、Rsv、Nv、Lv等。
, 百拇医药
②多能测试系统(见图2)：是由长度为d的散在测试短线，按一定规律排列而成。短线d与同一水平的两个短线端点的间距相等，短线上下间的垂直距离为
。d，上下两条相邻的短线及其端点边线共同构成一个等边平等四边形，其面积为a=。d2，为一个测试点所代表的测试面积。该测试系统点、线、面的关系是：LT=PT。。d；AT=PT。。d2主要用于测试：Sv、Rsv、Vv、Nv等。, http://www.100md.com
Fig.1 The measure system of check net
Fig.2 The measure system of various functions
Fig.3 The measure system of Merz curve
1.3 Merz曲线测试系统 见图3。在方网格测试系统内进一步画上直径d等于测试点点间距的半圆环，半圆环按一上一下的规律绘制。每个测试点所对应的测试线长度为
π，对应的测试面积为d2，其点、线、面的关系是：LT=PT。π；AT=PT。d2。, 百拇医药
主要用于各向同性及各向异性组织结构的Vv、Sv、Rsv、Nv等。
在某种意义上说，应用上述基本参数测试系统可对生物医学光镜、电镜各种各样的图像进行相对准确的测量，应用测试系统对图像进行的手工测量和应用图像分析仪进行测量结果的误差不超过3%。由于这些测试系统均是由著名的体视学家经过多年探索，在科学的体视学基本理论基础上，经过反复验证而创造的，深得广大体视学应用领域学者的欢迎。
2 体视学定量分析技术在病理科研工作中的应用
近十年来，体视学定量分析技术在病理学研究领域中的应用有了突飞猛进的发展，数十次体视学学术会议收集的论文累计达到数千篇，几乎涉及了所有系统、组织、细胞及大部分亚微结构，对推动病理学科理论的发展，发挥了重要的作用，这里仅就我们多年从事这个领域的研究实践作一回顾，用以探讨开展一项体视学定量分析工作之前，如何选择参数和测试系统，如何减小测量误差，如何针对不同的图像优化设计。
, 百拇医药
2.1 胃粘膜G细胞的免疫组织化学定量分析〔2〕 胃粘膜分泌胃泌素细胞(G细胞)是较早被发现消化道内分泌细胞之一，由于其对消化腺的分泌、消化管的运动、甚至植物神经功能状态具有多方面的调节作用，一直受到有关学者的关注。胃窦部G细胞在某些消化道疾病时会发生病理性增生，成为消化道症状产生的重要病理学基础之一。由于G细胞在胃窦粘膜的分布不是均匀的，主要分布在腺颈部，总体上相当于层状结构分布。因此，首先要确定适合采样的方法分层斜向采样。其次，选择G细胞Nv、Vv作为主要参数进行定量测试，结果见图4。
已经报道的G细胞计数资料，一般是对G细胞“最密集区域”测量的结果，由于G细胞数目个体差异大，又受到取材方法和病变因素的影响，难以把握G细胞分布区域的界限，误差较大。应用体视学的分层斜向采样方法，既反映G细胞总的数目变化，又反映病理状态时G细胞分布的特点，并较好地减少了测量误差。
2.2 胃粘膜胆碱能神经终末的超微结构体视学定量分析〔3〕 胃肠道存在相对独立的植物神经系统，主要由肌间神经丛和粘膜下神经丛构成。分布在胃粘膜的神经纤维大多是粘膜下神经丛(Meissner Plexus)的分支，由神经细胞、雪旺氏细胞以及它们的突起组成，雪旺氏细胞的胞浆几乎包裹了所有的神经成分，在神经纤维接近终末的部分迂曲扩张呈小囊状，内含各种递质小泡，称为终末曲张体(Terminal Varicosities)。神经终末与效应细胞间不形成象神经与横纹肌接头部位典型的突触复合体结构，只是富含递质小泡的神经终末接近效应细胞，间隔至少>1 100。由于胃粘膜层神经终末分布不规则，有关人胃粘膜末梢正常走行资料几乎查不到，电镜下寻找病变粘膜的神经终末难度很大。对这样结构比较特殊的组织，我们首先根据体视学公式进行了最佳样本含量的估计，既节省人力物力，又满足统计学要求。
, 百拇医药
Fig.4 The distribution of G cells acquired by gradational measure in gastric mucous membrane
S Surface layer:surface part in mucous；
L Lower layer :the part between the upper 1/3 and lower 2/3；
M Middle layer:betweeen the surface and lower layer
： Piwei Qixu type ：Pixu Qizhi type, 百拇医药
最佳样本含量估计的结果表明，在误差不超过2%的条件下，脾胃气虚组需测试33 214个测试点、3 831 μm测试线长、171 μm2测试面积；测试Vv需选取58个视场、Sv需96个视场、Nv需171个视场。而脾虚气滞组如测试25 714个测试点、3 742 μm测试线、140 μm2测试面积；测量45个视场计算Vv、94个视场计算Sv、140个视场计算Nv，可使测量误差小于1%。
Ach小泡定量分析的结果表明，所测量的四个体视学参数均以脾虚气滞组明显升高，与脾胃气虚组比较，P<0.001。
由于选择了最佳样本含量，选取稳定的包容空间，使难度较大的超微结构突触小泡的定量测试取得客观而可靠的结果。
2.3 克山病患者胰岛损害的免疫组织化学图像分析〔4〕 克山病(KD)的心肌损害是在长期慢性代谢障碍的基础上，又有一过性急剧缺血、缺氧条件而诱发的心肌坏死。20世纪90年代中期，我们从胰岛素对心肌细胞代谢的重要作用中受到启发，提出KD时胰岛损害是否参与KD心肌坏死的发病过程问题，并由此确立了KD胰岛损害问题的研究。我们选择了62例克山病患者尸检胰腺蜡块样本，切片厚度5 μm，经过对KD患者胰岛病变的仔细观察，选择了6个参数作为测试指标并应用图像分析系统进行了测试，其结果见图5。
, 百拇医药
测试首次证实了克山病患者胰岛存在多项参数的异常，提示胰岛损害可能参与克山病心肌坏死链式发展过程。提高定量分析研究质量的关键在于根据组织病变的特点设计定量分析参数，使测试的结果从多方面反映病变的特征与规律〔5〕。
2.4 神经肌肉疾病活检肌组织中巨噬细胞Chymase免疫组织化学定量研究〔6〕 神经肌肉疾病是一组主要以肌肉组织进行性萎缩为主要病变特点的疾病，多由染色体异常所致，一直缺乏有效的治疗措施。1995～1997年间，我们与日本学者合作研究了40例不同类型的肌萎缩患者，观察了其活检肌肉样本组织内巨噬细胞表面标志-Chymase(胰凝乳蛋白酶样蛋白酶)的定位和定量。定量时用NIH图像分析系统测试计算出每平方毫米切片中含有Chymase阳性的细胞数目，测试结果见图6。
Fig.5 The immunohistochemical quantitative analysis of islet lesions in the patients with Keshan disease
, 百拇医药
I+P:The ratio of insulin staining positive area to pancreatic area (%);I+/Is:The ratio of insulin staining positive area to islet area (%);In+A:The average insulin staining positive area in each islet (μm2×10);IsA:The average islet area (μm2×10);NA:The islet number on unit pancreatic area (No./mm2);SF:Shape factor (the ratio of perimeter to area of islet).
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Fig.6 The quantitation analysis of chymase positive cell in diseased human skeletal muscle
研究结果表明，正常肌组织内Chymase阳性巨噬细胞数少于不同类型的肌萎缩性疾患；DMD、BMD、DMRV时，Chymase阳性细胞往往较多，我们还进一步做了与细胞凋亡相关蛋白的免疫组化染色，其结果表明Chymase阳性巨噬细胞的分布与ubiquitin阳性细胞一致，与Fas抗原、Bcl-2、HLA-ABC、HLA-DR、Granzeme A等无相关性。
本研究结果表明Chymase阳性的巨噬细胞在肌萎缩的发生、发展过程中可能起重要作用，提示应用抗Chymase药物，例如应用胆碱酯酶抑制剂治疗进行性肌萎缩，可能收到较满意的疗效。本研究结果也暗示单核吞噬细胞以及相关的免疫系统功能异常可能参与了肌萎缩的发病机理，进一步研究肌萎缩时免疫系统功能状态与肌肉萎缩进展的关系，有可能为此类疾病的病因及发病机理提供重要科学依据。
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2.5 病变骨骼肌细胞核超微结构的定量分析-与细胞凋亡相关变化的研究 为了进一步探讨神经肌肉疾病时，肌肉组织的病变进展与细胞凋亡的内在联系，我们应用超微结构定量分析方法研究了25例神经肌肉样本肌纤维细胞核的改变。电镜放大照片6 000倍，每一病例随机选取50个肌纤维细胞核进行测量。应用NIH电子计算机图像分析系统对细胞核总面积及细胞核内高电子密度区(染色质)进行测试，计算高电子密度区与细胞核总面积的百分比，定量分析结果见附表。
Table Size and dark area of nucleus in the pathologic human skeletal muscle fiber estimated transmission EM Diseases
Cases
Nuclear size
(A/μm2)
, 百拇医药
Dark area
(%)
Control
6
9.16±45.5
3.53±9.8
DMD
1
29.34±30.2
12.14±9.9
BMD
3
8.68±49.9
, 百拇医药
4.82±12.1
LG-D
2
9.97±47.3
4.03±8.9
FSH-D
2
8.26±45.9
3.35±7.9
DMRV
3
11.55±40.3
, 百拇医药 6.94±10.0
MyD
4
9.41±45.1
4.59±8.5
MyC
1
6.58±28.7
2.18±11.4
MtD
2
9.33±47.0
5.25±11.6
, 百拇医药
PM/DM
2
8.94±53.1
3.93±6.8
IBM
1
9.51±45.0
4.29±9.7
SBMA
2
13.56±34.0
5.20±12.1
, 百拇医药 本研究结果表明，神经肌肉疾患时肌纤维核染色质的变化，符合细胞凋亡染色质改变的电镜形态学特点，与其它学者在心肌细胞所观察到的凋亡变化相类似。提示横纹肌纤维凋亡时，细胞核超微结构的变化规律同心肌组织基本一致，并且细胞凋亡最明显的形态学特征-染色质聚积在不同的疾患差别较大，提示凋亡与某些神经肌肉疾患的病因与发病机理可能存在一定联系，但由于较大的标准差，所得结果未能表现出统计学意义。提示对于横纹肌纤维细胞核进行有关定量研究时，应对细胞核的纵、横断面分别进行研究。骨骼肌细胞核为长椭圆形，其纵、横断面的直径、面积存在数倍的差异，往往存在较大标准差而影响统计结果，掩盖所含有意义的信息。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39470612，39870667)
〔作者简介〕 张桂珍(1955-)，女，吉林省德惠县人，教授，医学博士，1995年赴日本爱知医科大学留学，主要从事微量营养素与胰岛、心肌细胞保护研究。
, http://www.100md.com
〔参考文献〕
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〔收稿日期〕 1999-06-13, 百拇医药